腺病毒中文操作手冊

1、腺病毒載體操作手冊中文版腺病毒重組系統(tǒng)AdEasyTM 操作手冊第一章 簡介 1第二章 應用重組腺病毒的優(yōu)點2第三章 AdEasyTM 技術 33.1 技術概況33.2 AdEasyTM 系統(tǒng)中產生重組腺病毒的時程3第四章 主要流程44.1 將基因克隆入AdEasyTM 轉移載體44.1.1 克隆的一般原則44.1.2 構建重組AdEasyTM 轉移載體54.2 細菌內AdEasyTM 重組子的產生54.2.1 共轉化的一般原則54.2.2 共轉化方法54.2.3 預期結果54.3 AdEasyTM 重組質粒的篩選和擴增64.4 AdEasyTM 重組子轉染QBI-293A 細胞 64.4.1

2、 細胞鋪板64.4.2 磷酸鈣轉化技術7第五章 常用技術85.1 QBI-293A 細胞培養(yǎng)85.1.1 QBI-293A 細胞的初始培養(yǎng)85.1.2 QBI-293A 細胞的維持培養(yǎng)和增殖85.1.3 QBI-293A 細胞的凍存85.2 QBI-293A 細胞的轉染和病毒空斑的產生95.2.1 感染 QBI-293A 細胞 95.2.2 病毒空斑形成95.2.3 瓊脂糖覆蓋被感染細胞95.3 MOI 測定 105.4 腺病毒感染力測定105.4.1 X-Gal 染色 11縮寫 英文全稱中文全稱Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清 5 型

3、腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒載體Amp Ampicillin 氨芐青霉素&Gal -Galactosidase -半乳糖普酶bp Base Pair 堿基對錄5.5 重組腺病毒的篩選和純化115.5.1 挑選最佳重組腺病毒：表達和基因輸送115.5.2 病毒空斑挑選和小量擴增125.5.3 Western 雜交 135.5.4 Southern雜交和點雜交 135.5.5 病毒裂解產物PCR 145.5.6 免疫測定145.5.7 功能測定145.6 病毒顆粒在QBI-293A 細胞中的大量擴增155.7 兩次氯化銫密度梯度離心純化重組腺病毒165.7.1

4、不連續(xù)密度梯度離心175.7.2 連續(xù)密度梯度離心175.7.3 病毒溶液去鹽和濃集175.8 病毒滴度測定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑測定法205.8.3 50%組織培養(yǎng)感染劑量法20第六章 疑難解答226.1 QBI-293A 細胞培養(yǎng)226.2 感染力測定226.3 轉移載體克隆236.4 在 BJ5183 細胞中共轉化和重組246.5 轉染 QBI-293A 細胞 256.6 篩選和測定256.7 在 QBI-293A 細胞中表達266.8 重組腺病毒的擴增266.9 純化 266.10 病毒滴度測定27BSA Bovine Serum A

5、lbumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互補 DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 閉環(huán)螺旋DNACPE Cytopathic Effect 細胞病理效應CsCl Cesium Chloride 氯化銫DMEM Dulbecco s Modified Eagle Medium DMEM 培養(yǎng)基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亞砜DTT Dithiothreitol 二硫蘇糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromid

6、e 溴化乙錠FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小時ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重復Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千堿基對KDa KiloDaltons 千道爾頓LB Luria-Bertani ( broth ) LB 培養(yǎng)基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位點Min Minute 分鐘MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染復數(shù) mRNA Messenger RNA 信使 RNAMWCO MOIecular W

7、eight Cut-off第一章 簡 介PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝膠電泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸鹽緩沖液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成單位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右側反向末端重復SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸鈉TBE Tris Borate/EDTA 三羥甲基

8、氨基甲烷硼酸鹽/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50% 組織培養(yǎng)感染劑量TCP Total Cellular Protein 細胞總蛋白TE Tris/EDTA TE 溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-口引噪-為D-半乳糖普當今基因輸送技術的發(fā)展日趨復雜，一些治療藥物（生長激素、干擾素、抗病毒和抗癌復合物）和診斷性蛋白（單克隆抗體）的設計、發(fā)展與合成需要更高效的基因輸送工具。人類基因組計劃和正不斷發(fā)展的基因

9、治療同樣急需發(fā)展快速有效和治療性的分析工具。為解決這一問題，基因輸送技術（通常使用病毒載體如增殖缺陷的腺病毒）通過基因工程不斷發(fā)展，致力于生產基因表型藥物。重組腺病毒提供了一類在基因轉移系統(tǒng)發(fā)展中有極大潛力的新的生物治療劑。1953 年對普通感冒病因的探索和研究導致了腺病毒的發(fā)現(xiàn)。迄今為止已發(fā)現(xiàn)了40 多種不同血清型和93 種不同種類的腺病毒，它們通常感染眼、呼吸道或胃腸上皮（Fields 等，1996） 。 1977 年， Frank Graham 博士建立了一種細胞株，可在無輔助病毒的情況下產生重組腺病毒（Graham 等， 1977） 。此后，腺病毒載體作為極具潛力的哺乳動物基因轉移載體

10、而得到廣泛應用，尤其是在基因治療相關領域。迄今為止已有大量關于腺病毒及其應用的綜述發(fā)表，我們給感興趣的讀者推薦以下文章： Hitt et al ， 1999和 Wivelet al， 1999。腺病毒亦可被用來在人體細胞中過量表達蛋白（Massie et al， 1998 A, B） 。但迄今為止還只有熟知腺病毒的研究人員才會采用腺病毒系統(tǒng)。昆騰生物科技公司是第一個提供完備而且能廣泛應用的重組腺病毒試劑盒Adeno-QuestTM 系統(tǒng)及其相關產品和客戶服務的公司，這個系統(tǒng)的基礎是在293 細胞中產生重組腺病毒?，F(xiàn)在介紹的 AdEasyTM 系統(tǒng)以細菌內重組取代哺乳動物細胞（He et al，

11、 1998） ，使獲得重組腺病毒對任何有細胞培養(yǎng)設備的分子生物實驗室都更方便。重組腺病毒事實上可在任何細胞或組織中用來研究表達重組蛋白。AdEasyTM 轉移載體可允許插入7.5kb的外源DNA ,目前正研究腺病毒其它區(qū)的缺失以提高腺病毒在基因治療中的應用。這本手冊提供了重組腺病毒技術中所有必須遵循的原則，并詳細描述了產生一個重組腺病毒的所有實驗步驟，包括重組腺病毒在 QBI-293A 細胞中擴增并純化到1012VP 的操作步驟。AdEasyTM 載體系統(tǒng)包含了生產5 型重組腺病毒所需的全部試劑，所有成分購買后即可使用。第二章 應用重組腺病毒的優(yōu)點1. 宿主范圍廣, 對人致病性低這套腺病毒載體

12、系統(tǒng)可廣泛用于人類及非人類蛋白的表達。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞，因此在大多哺乳動物細胞和組織中均可用來表達重組蛋白。2. 在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因逆轉錄病毒只能感染增殖性細胞，因此DNA 轉染不能在非增殖細胞中進行，而必須使細胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。腺病毒則能感染幾乎所有的細胞類型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞。腺病毒是研究原代非增殖細胞基因表達的最佳系統(tǒng)，它可以使轉化細胞和原代細胞中得到的結果直接進行對比。3. 能有效進行增殖，滴度高這套腺病毒系統(tǒng)可產生1010 到 1011VP/ml ，濃縮后可達1013VP/ml ，這一特點使它非常適用于基因治療。4. 無需輔助病毒，可容

13、納7.5 kb 外源 DNA： 為提供克隆空間，此腺病毒缺失了E1 和 E3 早期區(qū)。此外，此腺病毒可包裝比正常病毒DNA 稍大的 DNA 分子（ 105%） 。這些特點允許插入腺病毒的基因或多基因表達盒可達7.5kb。5. 與人類基因同源該腺病毒載體系統(tǒng)應用了人類病毒作為載體，以人類細胞作為宿主，因此為人類蛋白進行準確的翻譯后加工和適當?shù)恼郫B提供了一個理想的環(huán)境。大多數(shù)人類蛋白都可達到高水平表達并且具有完全的功能。6. 不整合到染色體中，無插入致突變性逆轉錄病毒可隨機整合到宿主染色體，導致基因失活或激活癌基因。而腺病毒則除了卵細胞以外幾乎在所有已知細胞中都不整合到染色體中，因此不會干擾其它的

14、宿主基因。在卵細胞中整合單拷貝病毒則是產生具有特定特征的轉基因動物的一個較好的系統(tǒng)。7. 能在懸浮培養(yǎng)液中擴增：293 細胞可以適應懸浮培養(yǎng)，這一調整可使病毒大量擴增。大量事實證明懸浮293 細胞可在120L 的生物反應器中表達重組蛋白。8. 能同時表達多個基因這是第一個可以在同一細胞株或組織中用來設計表達多個基因的表達系統(tǒng)。最簡單的方法是將含有兩個基因的雙表達盒插入腺病毒轉移載體中，或者用不同的重組病毒共轉染目的細胞株來分別表達一個蛋白。測定不同重組病毒的MOI 比值可正確估計各重組蛋白的相對共表達情況。第三章 AdEasyTM 技術3.1 技術概覽AdEasyTM 系統(tǒng)是由T.C.He 等

15、（1998）構建的用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)腺病毒重組系統(tǒng)的一個快捷系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中，只需二步即可產生重組腺病毒：先將表達盒裝入轉移載體，然后再通過同源重組插入腺病毒基因組。將外源基因插入腺病毒的最有效途徑是通過同源重組，原因是： 1） 腺病毒 DNA 是大型的線性分子，含有幾乎所有的內切酶切位點；2） 基因組過大（ 36kb） ，難于操作。在AdEasyTM載體系統(tǒng)中，含有大部分腺病毒基因組的載體為超螺旋質粒，而不是線性DNA ,同源重組則在大腸桿菌進行。相對于傳統(tǒng)系統(tǒng)而言，這二點改進使病毒DNA 操作更容易，同時由于利用了大腸桿菌的高效率同源重組特性而使重組載體的篩選更為簡單。在本系統(tǒng)中，首先將基因c

16、DNA 插入一個轉移載體，將得到的質粒用PmeI 線性化，然后在大腸桿菌 BJ5183 中與病毒DNA 質粒 pAdEasy-1 進行同源重組。pAdEasy-1 缺失了 E1 和 E3 區(qū)，其 E1 區(qū)功能將在293A 細胞中得到互補。重組子通過卡那霉素篩選，用內切酶進行鑒定分析。最后將得到的重組腺病毒用PmeI 線性化，暴露其反向末端重復序列（ITR， Iaverted Termined Repeats） ，轉染QBI-293A 細胞后產生重組病毒顆粒。同源重組在線性化的轉移載體和完整的超螺旋腺病毒質粒之間進行。應用完整的腺病毒質粒而不用內切酶進行線性化，對于產生重組腺病毒至關重要。轉移載

17、體中的卡那霉素抗性基因則可用來篩選重組子。由于線性化的轉移載體產生卡那霉素抗性克隆的背景較低，因此此同源重組系統(tǒng)有較高的信噪比。大腸桿菌BJ5183 有 recA 活性，但同時缺失介導細菌重組的其它酶，具有高效的轉化和重組能力。一旦重組子經確定，則可轉入普通的無recA、endA活性的細菌株如 DH5c等進行擴增。由于缺乏recA活性，DH5c不能用于腺病毒的同源重組。3.2 Ad EasyTM 系統(tǒng)中產生重組腺病毒的時程與傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，AdEasyTM 系統(tǒng)中篩選和純化腺病毒所需的時間大大縮短了?？寺『秃Y選約需1-3 周，重組后需驗證重組病毒質粒是否含有目的基因。重組子在DH5x中擴增后轉入

18、哺乳動物細胞 293A,最后將293A細胞中產生的重組病毒顆粒進行純化和滴定。最終得到的重組腺病毒只能在提供E1 區(qū)功能的293A 細胞中進行增殖。一般來說，用傳統(tǒng)方法產生重組腺病毒并不需要大量工作，每天只需1 小時進行細胞傳代和觀察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整個過程就需要很長時間。而AdEasyTM 載體系統(tǒng)用大腸桿菌產生重組病毒，大大縮短了所需時間。我們強烈建議初學者用QBI-Infect 陽性對照進行感染力測定（見5.2.2） 。進行這些測定之前，必須先擴增QBI-293A 細胞（見5.5.1 ） 。感染力測定使你能觀察到病毒增殖導致的細胞表型的改變，獲知你所用細胞對腺病毒的敏

19、感性，而病毒空斑測定可讓你觀察到病毒空斑的形成。第四章 主要流程4.1 將基因克隆入AdEasyTM 轉移載體AdEasyTM系統(tǒng)中有2種轉移載體可供進行重組腺病毒構建：pShuttle和pShuttle-CMV ,這2個載體都含有多克隆位點（MCS）供插入基因。pShuttle 不含有啟動子和多聚腺苷酸位點（polyA ） ，允許插入含特定啟動子和polyA 位點的表達盒。pShuttle-CMV 含有單拷貝CMV 啟動子和polyA 位點供基礎表達和高表達重組蛋白，你只需將目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位點。表1 提供了各轉移載體的特性。表 1 AdEasyTM 轉移載體特性

20、載體名稱克隆能力啟動子 polyA 位點 克隆位點線性化位點說明pShuttle 7.5kb MCS 共轉化位點PmeI（ ECoRI）轉染位點（PacI） 將完整的表達盒裝入多克隆位點（MCS）pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共轉化位點PmeI（ ECoRI）轉染位點（PacI） CMV 啟動子能在大多數(shù)哺乳動物細胞中高效表達蛋白4.1.1 克隆的一般原則AdEasyTM 轉移載體的特殊設計使其極易在克隆中應用，但在設計克隆策略時應考慮以下因素：1） 在 BJ5183 中進行共轉化之前必須將轉化載體線性化。確證表1 中所列的線性化位點不存在于插入的基因中。注意：在

21、pShuttle 中用 EcoRI 線性化時，需要用RecA 輔助的限制性內切酶進行酶切。如果插入基因含有所有線性化酶切位點，那么必須進行定向突變。2） 重組腺病毒質粒在轉染QBI-293A 細胞之前也必須用PacI 進行線性化。同樣，插入基因中不能含有PacI 位點，如果有則必須進行定向突變。3） 克隆能力是指質粒載體能夠克隆并且不影響病毒增殖能力的插入基因的最大長度。各轉移載體的克隆能力見表1，建議插入基因的長度最好不超過它的上限。在pShuttle 和 pShuttle-CMV 中分別插入大于7.5kb 和 6.6kb 的基因將大大降低整個系統(tǒng)的效率。盡管也可能得到重組子，但可能會發(fā)生D

22、NA 重排，生長速度也將減慢。4） 如果要插入多個表達盒，應避免以頭對頭方向插入相同的元件（如CMV 啟動子） ，否則同源重組時兩個元件之間的部分可能會發(fā)生丟失。5） 在進行構建腺病毒之前最好測定重組蛋白的暫時性表達。這里沒有提供詳細的操作方法，但在CMV 或其它強力啟動子控制下的基因很容易進行暫時性表達實驗。但某些啟動子控制下的蛋白表達水平在無病毒增殖時可能不足以達到檢測水平。6） 載體 DNA 可用氯化銫溴化乙錠平衡密度梯度離心或親和柱法進行純化。我們不主張用小量粗制的DNA 進行轉化和轉染實驗，因為污染的DNA 將大大降低菌落和空斑的形成數(shù)。4.1.2 構建重組AdEasyTM 轉移載體

23、構建重組AdEasyTM 轉移載體的一般指導如下，但我們建議對于詳細的克隆技術和操作方法還需參考通用的分子生物學手冊。1 若 cDNA 含有位置正確的粘性內切酶位點，則可將它直接克隆入轉移載體。如果沒有，可以使用鈍末端內切酶位點，也可用含合適的酶切位點的引物進行PCR 或連接含有酶切位點的接頭使cDNA 產生新的酶切位點。PCR 插入酶切位點的方法較快速，但對于長cDNA 則應使用連接接頭，因為在擴增過程中Taq 酶可能會使序列的某些位點發(fā)生突變。2 插入基因的鑒定可以用限制性內切酶分析或PCR 的方法。3 轉化之前用PmeI 或 EcoRI 將轉移載體重組子線性化，消化應盡可能徹底，以減少背

24、景信號。4 瓊脂糖凝膠上觀察消化產物，若消化已完全，放入6520 分鐘進行滅活。5 凝膠純化線性化載體。盡管膠純化可能會降低轉化效率，但不完全消化往往產生較高的背景，從而降低重組率。將線性化質粒去磷酸化也有助于降低背景信號。6 重懸純化的DNA ,濃度至少為0.2ug/ul。每個轉化實驗取1ug進行，包括對照。4.2 細菌內 AdEasyTM 重組子的產生4.2.1 共轉染的一般原則1） 將線性化轉移載體和pAdEasyTM-1 DNA 共轉化 BJ5183 必須要用高活性的感受態(tài)細胞。試劑盒中提供的細菌為電穿孔感受態(tài)，有很高的轉化效率。如果不用電穿孔法進行轉化，那么必須制備化學敏感性感受態(tài)細

25、胞，并在應用之前試驗其轉 化活性（108 已足夠） 。2） DH5a不可用于轉化，因其不支持重組，它只是用來擴增重組病毒DNA。3） 本實驗需要2ug 線性化膠純化的重組轉移載體，共轉化和對照各需1ug。4.2.2 共轉化方法同時進行實驗組和對照組的轉化實驗：實驗組共轉化：1ug線性化重組轉移載體（5ul）和1.0ul pAdEasyTM-1載體（100ug/ul）對照組車t化：1ug （5ul）線性化重組轉移載體1 將 BJ5183 感受態(tài)細胞和電穿孔杯置于冰上。將細胞分為2 管，每管40ul。2 . 40ul感受態(tài)細胞中至多加入 6ul DNA ,且DNA必須溶于水，避免含有離子。3 .將

26、BJ5183轉入2mm電穿孔杯，防止有氣泡形成。4 .按電穿孔供應商的使用說明轉化BJ5183, Bio-Rad儀器一般使用的參數(shù)為：200 Ohms、25uF、2.5KV ; BTX儀器則為：5 Ohms、2.5KV、C=0。5 . 用1mlLB重懸轉化物。6 . 轉入1550ml離心管中，37c震蕩培養(yǎng) 60分鐘。7 .將轉化物鋪35塊LB/Kan (50ug/ml)培養(yǎng)板，37c培養(yǎng)24小時。建議分別鋪 100、300和600ul,以提高至少在一 塊板中得到可分離菌落的機率，應該得到40100個菌落。8 .挑出24個最好的克隆，轉入 2ml LB/Kan (50ug/ml)培養(yǎng)液中培養(yǎng)1

27、015個小時。不要儲存 BJ5183培養(yǎng)液，因有可 能產生非目的重組子。盡快抽提重組AdEasyTM質粒。9 .用傳統(tǒng)堿裂解法小量制備質粒，取一半進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳，驗證超螺旋質粒的大小。玻璃珠或樹脂制備質粒的試劑盒應避免使用，但粘粒 DNA抽提試劑盒可以用。重組質粒大小約40kb,由于它是低拷貝質粒，所以小量制備時應相應調整具體操作。4.2.3預期結果20%以上的菌落應含有大質粒(近40kb),這些是侯選重組子。與對照培養(yǎng)板生長的菌落進行對照即可大概估計線性化轉移載體再連接所致的背景強弱。由于在此高效重組recA+細菌中重組轉移載體會形成多聚體，因此背景將表現(xiàn)為一個梯度。4.3 Ad

28、EasyTM重組質粒的篩選和擴增將侯選重組子進行酶切分析，驗證其結構。比如：PacI酶切后通常得到約 30kb的片段和一個3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重組位置在左臂還是復制子而不同。建議同時用克隆基因的內切酶進行分析，鑒定是否含有插入基因。挑選最佳陽性重組子轉入 DH5x中進行擴增：轉化 DH5x只需1-5ul小量制備的重組子。這一步對于擴增時保持重組DNA的結構是必需的，因為 AdEasyTM這樣的大質粒在recA+細菌株如BJ5183中是不穩(wěn)定的，會迅速出現(xiàn)缺失 ，而在DH5x中能很容 易地獲得大量DNA。1 .將DH5a感受態(tài)細胞和電穿孔杯置于冰上。2 .將1-5ul DN

29、A加入40ul DH5 a感受態(tài)細胞中，DNA必須用水溶，避免含有離子。3 .將DH5a感受態(tài)細胞轉入2mm電穿孔杯，防止形成氣泡。4 . 按照說明轉化 DH5a : Bio-Rad儀器一般使用的參數(shù)為：200 Ohms、25uF、2.5KV ; BTX儀器則為：50 Ohms、2.5KV、C = 0o5 .將轉化混合液重懸于1ml LB中。6 . 轉入15-50ml離心管中，37c振蕩培養(yǎng)60分鐘。7 .培養(yǎng)后用LB按一定梯度稀釋轉化的 DH5a (1:10、1:100和1:1000)8 .取100ul轉化液鋪在LB/Kan (50ug/ml)板上，37c培養(yǎng)24小時。未用的轉化液可在 4c

30、保存-2周。9 .每個重組子挑13個克隆轉入5ml LB擴增，以備有足夠量質粒。這時，用內切酶再次分析重組DNA ,以確證含有插入基因，以及重組子的穩(wěn)定性。10 .用柱純化試劑盒制備至少 5ug高質量的重組 DNA。11 .取5ug質粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在無菌條件下溶于50ul 0.1kE溶液。具體要求參見磷酸鈣技術一章中有關轉染前 DNA制備的內容。4.4 AdEasyTM 重組子轉染 QBI-293A 細胞注意：培養(yǎng)細胞前先參閱 5.1章中有關QBI-293A細胞培養(yǎng)的內容。磷酸鈣技術中的注意點：無菌在整個過程中保持所有成分的無菌是至關重要的。昆騰公司提供的試劑盒

31、中所有成分均是無菌的，但使用者還必須保證所 用其它試劑也均為無菌。DNA純度磷酸鈣轉染中所用的 DNA必須是高純度的，一些DNA污染物對培養(yǎng)的細胞具有很強的毒性，那些成功轉染的細胞往往會被污染物殺死。沉淀時間以前的資料都建議磷酸鈣-DNA共沉淀顆粒在加入細胞和培養(yǎng)液之前至少應反應20分鐘。然而與此相反，最近的研究(Jordan等，1996)顯示長時間共沉淀會形成聚合沉淀塊，從而降低轉染效率。因此，建議共沉淀成分混合后1分鐘即可 將沉淀加入細胞培養(yǎng)板。這一時間上的調整可產生小而穩(wěn)定的沉淀，能更有效地被細胞攝入。4.4.1 細胞鋪板每塊板都用DMEM5%進行培養(yǎng)，這樣細胞在鋪板后第二天即可達到70

32、%匯合率。由于共轉染是通過細胞表面完成的，因此轉染時細胞必須是分離的，而不是匯合的。1 .轉染前一天以 7.5X05 QBI-293A細胞在60mm培養(yǎng)皿中鋪板，用DMEM5%培養(yǎng)，第二天的細胞數(shù)應達到 1.01.5博6。37 C CO2孵箱中培養(yǎng)。CO2孵箱有助于保持合適的 PH,培養(yǎng)皿在不進行操作時必須始終保存在CO2孵箱中。2 .轉染前3-4小時換成新鮮培養(yǎng)液，以保證在轉染過程中細胞具有超常的生長力。將培養(yǎng)皿放回CO2孵箱中。3 .4.2磷酸鈣轉化技術1 .每個轉染都必須用5ug無菌的線性化重組腺病毒 DNA o2 .標記一個1.5ml離心管為編號1。用微量移液槍加入 169ul無菌水和

33、5ul 2M氯化鈣溶液。上下吸打二次混勻，然后一 滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化鈣，再用移液槍慢慢吹打混勻。此時緩沖液的體積為 250ul ,含有0.25M氯化鈣和5ug DNA。3 .準備第2管離心管（編號2）,加入250ul 2 HBS緩沖液。4 .用1ml移液槍吹打2號管中的溶液形成氣泡，在吹打的同時逐滴加入1號管的溶液。加完后繼續(xù)吹打5秒以使其完全混勻。這一步驟對于形成的共沉淀顆粒的大小至關重要，小顆粒轉染效率更高，而吹打可以形成較小的顆粒。等一分鐘后再加入細胞培養(yǎng)皿內。5 .在超凈臺內將磷酸鈣-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培養(yǎng)皿中，覆蓋范圍盡可能廣。培養(yǎng)液

34、稍后即會透明，十字形晃 動培養(yǎng)皿使沉淀均勻分布。6 .培養(yǎng)皿放入孵箱培養(yǎng)過夜。4小時后，沉淀顆粒在 200M到置顯微鏡下應清晰可見，尤其在無細胞的培養(yǎng)皿表面。7 .第二天，去除含共沉淀顆粒的培養(yǎng)液，用 PBS制備的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：轉染后細胞都十分脆弱，容易脫壁。清洗時應十分輕柔，將PBS沿培養(yǎng)皿壁加入，然后輕輕旋轉培養(yǎng)皿。用移液槍反復將培養(yǎng)液直接加在細胞上，即可使細胞脫落，然后收集。由于這一時期細胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。8 . 將細胞分裝入 4個60mm培養(yǎng)皿（每個培養(yǎng)皿中加 5ml DMEM5% ）或一塊6孔板中（每孔加 3ml DMEM5% ）,靜置6

35、 小時使其貼壁。6小時后覆蓋瓊脂糖以供形成病毒空斑。第五章常用技術5.1 QBI-293A細胞培養(yǎng)昆騰公司的293A細胞來源于一個用作空斑測定的亞克隆，具有易使用和易轉染的特性。該細胞株對于高細胞密度很敏感，當細胞超過70%匯合時，一些細胞可能會丟失它們的表型。若細胞密度持續(xù)在 70%以下，QBI-293A細胞則能連續(xù)培養(yǎng)34個月維持原有細胞特性。若以購買得到的293作為第一代，則30代內能得到最佳結果。一旦到了 30代，最好復蘇一管細胞開始新的培養(yǎng)。所以，我們建議你在收到細胞后應盡快建立自己的QBI-293A細胞庫。QBI-293A細胞在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，該培養(yǎng)液還含有4.5g/L L-

36、葡萄糖、110mg/L丙酮酸鈉、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清濃度為2%10%,視實驗需要來調節(jié)細胞生長速度。為簡化此操作說明，培養(yǎng)基描述為DMEM后加血清濃度（如：DMEM5%表示：含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸鈉、終濃度為2mM的谷氨酰胺和終濃度為 5%的熱滅活胎牛血清）。QBI-293A細胞需按標準的細胞培養(yǎng)規(guī)程進行操作，在健康狀態(tài)時，它們呈成纖維細胞樣并在培養(yǎng)瓶中貼壁形成單層細胞。被感染的細胞則變圓脫落，即所謂的細胞病理效應（ CPE）。所有的細胞培養(yǎng)操作都應嚴格遵循無菌原則，這一點是至關重要的?？股乜捎每刹挥?，但無抗生素條件對于操作質量來說通常是一個好的對照。Q

37、BI-293A細胞生長的相對密度見下表：表2：匯合率與細胞數(shù)量匯合率 （） 60mm培養(yǎng)皿100mm培養(yǎng)皿50 1.60 106 3.5 W675 2.40 106 5.25 W6100 3.20 106 7.00 W65.1.1 QBI-293A細胞初始培養(yǎng)1 .將凍存的一管QBI-293A細胞在37 c水浴輕輕晃動融化。2 .融化后在超凈臺無菌條件下用70%乙醇將凍存管的蓋沿擦拭干凈。3 .將細胞轉入15mL無菌離心管中，加入 10mL DMEM 10% , 600 xg離心5分鐘使細胞沉淀。4 .棄去上清。5 .將細月用10mL DMEM 10% 重懸，輕輕打勻6 .轉入75cm2培養(yǎng)瓶

38、或100mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。7 .在5% CO2孵箱中37c培養(yǎng)過夜。8 .第二天觀察細胞匯合率，若合適則可進行實驗，否則按5.1.2所述繼續(xù)培養(yǎng)。9 .1.2 QBI-293A細胞的維持培養(yǎng)和增殖QBI-293A細胞必須按1:10至（1:20傳代1 .室溫下胰酶消化13分鐘使貼壁細胞脫落2 .拍打培養(yǎng)瓶邊緣使細胞脫落，在倒置顯微鏡下觀察細胞是否變圓，是否已從培養(yǎng)瓶表面脫落。3 .按需要用新鮮培養(yǎng)液稀釋細胞懸液，轉入新的培養(yǎng)瓶中。在5% FBS中，細胞倍增的時間是 26小時，在10% FBS中稍短一些。5.1.3 QBI-293A細胞的凍存建立細胞庫時必須使培養(yǎng)的細胞匯合率低于50% ,以保證亞

39、克隆的特定表型。1 . QBI-293A細胞必須在含 10%高質量FBS的DMEM 中培養(yǎng)。2 .將健康生長的QBI-293A細胞離心沉淀。3 .以最小體積的DMEM 10%重懸細胞。4 .用血球計數(shù)器進行細胞計數(shù)。5 .用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS 重懸細胞，細胞終濃度為 1 X106/mL。6 .無菌操作將1mL細胞懸液轉入2mL凍存管中。7 .將凍存管放入凍存盒中，-80C儲存24小時。這一簡便措施可保持約1C/分鐘的降溫速率，適于凍存細胞。8 .第二天將凍存的細胞轉入液氮罐或 -150 C冰箱中長期保存。QBI-293A細胞若正確凍存，則可在液氮罐中保存數(shù)年

40、。5.2 QBI-293A細胞的感染和病毒空斑的產生感染QBI-293A細胞和產生病毒空斑在這本手冊的多種操作中都得到應用，其具體操作視不同的實驗目的而稍有差異（如 滴度測定、大規(guī)模擴增和純化）。這一節(jié)提供了一個基本的操作說明，并詳細描述了QBI-293A細胞感染后不同時間的具體變化。5.2.1 感染 QBI-293A 細胞QBI-293A細胞中腺病毒的感染周期表現(xiàn)為光鏡下可見的細胞表型的改變，此周期始于病毒和細胞接觸后。被感染細胞的 表型變化與病毒接觸的時間以及病毒細胞比率相關，這個比率稱為感染復數(shù) （MOI）。病毒控制細胞并阻止細胞的生長需要幾個小時的時間。1020的MOI值通常用于需要同

41、時感染所有細胞時，此時細胞匯合率應該在9095%左右，因為細胞在感染數(shù)小時內將停止生長。加入病毒的量可通過MOI值測定（見5.3）或病毒滴度測定（見 5.8）確定。在這個 MOI值條件下，被感染細胞的形態(tài)在12天后就會完全改變：細胞變圓并逐漸從壁上脫落（見5.2.2）。隨著病毒的增殖，細胞核將占據(jù)細胞的大部分，這一表現(xiàn)稱為細胞病理效應（CPE）。感染后3天，所有細胞都將呈現(xiàn) CPE。當QBI-293A細胞在MOI值為1或更低的情況下被感染，則只有一部分細胞能被感染。此時感染所有的細胞必須產生完整 的感染周期并釋放病毒，整個過程大概需要 4天。在這個過程中，未被感染的細胞將繼續(xù)生長，細胞可能在未

42、被全部感染時達到100%匯合率而停止生長。感染后的表現(xiàn)是多種多樣的，但典型的表現(xiàn)是在感染后5天可見大多數(shù)細胞呈現(xiàn) CPE而其余的細胞表現(xiàn)為原來未被感染的形態(tài)。感染的操作很簡單，只要將病毒與細胞接觸。為增加感染的有效性，在最初2小時感染中最好將培養(yǎng)液的體積減到最小，這樣病毒與細胞接觸得會更緊密，然后再增加培養(yǎng)液。止匕外，緩慢而持續(xù)地晃動培養(yǎng)板（Mittereder et al. 1996 ）可使病毒分布更均勻，從而使感染效果更好。注意：處理細胞和病毒時都必須使用消毒的槍頭。5.2.2 病毒空斑形成病毒空斑形成源于一個細胞被一個病毒感染后，經過多次完整的感染周期釋放病毒再感染周圍的細胞。病毒空斑的

43、形成是一個緩慢的過程，甚至在光鏡下能觀察到空斑之前，細胞已經達到 100%匯合。為限制病毒的擴散，通常在培養(yǎng)液中加入 瓊脂糖，但在瓊脂糖覆蓋下觀察細胞形態(tài)的改變則要稍微困難一些。感染后7天左右可以在顯微鏡下看到小的空斑，表現(xiàn)為一定區(qū)域內細胞呈現(xiàn)CPE。第10天可以在光鏡下看到形態(tài)完整的空斑，有經驗的研究者則能憑肉眼觀察到培養(yǎng)板底部有小的空白斑點形成。到 14天，空斑可非常容易地被挑選出來。5.2.3 瓊脂糖覆蓋被感染細胞將瓊脂糖覆蓋細胞不是一項容易的技術，你必須在瓊脂糖凝固之前迅速地將它在單層細胞上完全鋪勻。但是如果鋪得太快 太重，那么細胞往往會脫壁。但通過幾次實驗后，這一步應該比較容易了。瓊

44、脂糖/DMEM混合物制備：1 .用無菌PBS制備5% SeaPlaque瓊脂糖（FMC產品）儲存液，高壓消毒后每管 10mL分裝在50mL塑料離心管中，4c保 存。2 .使用之前先在微波爐中融化 5% SeaPlaque瓊脂糖（避免沸騰），然后冷至45 C。防止瓊脂糖沸騰最好的辦法是在沸水浴 中加熱，如果沒有完全融化的話再在微波爐中加熱數(shù)秒。3 .加入30mL預平衡至37c的DMEM5% 后充分混勻，這樣瓊脂糖的終濃度為1.25%。立即使用。覆蓋QBI-293A細胞：在進行下一步操作之前，請確認細胞是否已貼壁完好。1 .移去培養(yǎng)液，用1.25%瓊脂糖/DMEM混合物覆蓋單層細胞。2 .沿著培養(yǎng)

45、板的邊緣將瓊脂糖輕輕加入，加入的具體體積參考表3,然后放回CO2孵箱培養(yǎng)。表3:不同培養(yǎng)器皿應用的瓊脂糖體積 培養(yǎng)皿大小首次量追加量100 mm 10 mL 5 mL60 mm 5 mL 3 mL6 孔板 3 mL 1.5 mL空斑應在1021天內形成，為保持細胞活力，每45天或培養(yǎng)基變黃時追加瓊脂糖 /DMEM混合物。5.3 MOI 測定一這一實驗用來粗略估計病毒上清中病毒顆粒的數(shù)量（精確測定病毒顆粒數(shù)量見 5.8節(jié)的滴度測定）0MOI測定通常在擴增病毒尤其是在大量擴增的時候使用，以確定感染的最佳條件。這一實驗可在含有1X106QBI-293A細胞/孔的6孔板中進行。1 .移去培養(yǎng)液，每孔加

46、入 500 VL新鮮的培養(yǎng)液2 . 一孔為對照，其余每孔分別加入2、5、10、25、50 VL病毒上清。3 .不斷緩慢晃動培養(yǎng)板，培養(yǎng)約 3小時。4 .加入1.5mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng) 72小時。觀察每孔細胞是否出現(xiàn) CPE,根據(jù)預先的估計，感染后 3天細胞完全出現(xiàn) CPE的病毒MOI值為1020。這樣，根據(jù)感染 的細胞數(shù)量，你就可以估計出上清中的病毒量。5 .4腺病毒感染力測定這一實驗的目的是確定腺病毒是否能將DNA轉導入293之外的某一細胞株。該實驗至關重要，因為它將確定腺病毒是否可應用于這個細胞株，以及如果能應用則需要多少的病毒量（也就是需要大量擴增的程度）來完成整個研究。這個實驗中，如果用

47、的是Ad5-CMV-LacZ則檢測3半乳糖普酶，Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP則檢測GFP。這些高滴度的產品都 可單獨向昆騰公司購買。本實驗的陽性對照（3半乳糖普酶檢測）亦可向昆騰公司購買，但由于病毒滴度太低而不適于直接進行實驗，通常需要擴增以達到理想的病毒滴度（擴增步驟見5.6）。腺病毒轉導的效率各個細胞株都不太一樣，其中尤以淋巴細胞株最難轉導。腺病毒感染力測定通常在多孔板中進行，MOI為1200,當測定淋巴細胞株時 MOI可至1000。對大多數(shù)細月株來說，150的MOI值可將報告基因轉入所有的細胞而不會出現(xiàn)任何的毒性。在高 MOI情況下，某些病毒蛋白的高表達可對某些細胞

48、產生毒性。無論 MOI為多少，感染時都必須用最小的培養(yǎng)液體積并不斷晃動，以使感染效果達到最佳。1 .按5.2.1中所述方法在6孔板中用不同數(shù)量病毒感染細胞（合適的MOI范圍），培養(yǎng)48小時。2 .進彳f X-gal染色（見下述）。注意細胞與病毒培養(yǎng)后不必清洗細胞，在整個實驗過程中讓病毒留在培養(yǎng)液中。5.4.1 X-gal 染色1 .棄去培養(yǎng)液，用37c預熱的PBS沖洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆蓋細胞，0.05%戊二醛室溫孵育515分鐘或2%多聚甲醛室溫孵育 60分鐘。2 .棄去固定液，室溫下用 PBS徹底洗3遍：第一遍將沖洗液立刻棄去，第二、第三遍則讓沖洗液保留5分鐘。3

49、 .加入最小體積的X-gal溶液。4 . 37c孵育1至12小時（過夜），陽性細胞將被染成藍色。染色完成后可將培養(yǎng)板置于4c保存。溶液：a）戊二醛固定液使用前將戊二醛用 PBS稀釋至終濃度為0.05% b)多聚甲醛固定液1 .將2g多聚甲醛溶解在50mL預熱至55c的水中。2 .加入2滴10 N NaOH ,溶液將變澄清。3 .待多聚甲醛溶解后，加入 10mL 0.2M 磷酸二氫鈉(2.76g/100mL)和40mL 0.2M 磷酸氫二鈉(無水，3g/100mL)。4 .固定液在37c條件下加入，在室溫下固定。多聚甲醛固定液可在4c最長保存一個星期。c) X-gal 溶液用 PBS 制備(PH

50、7.4):20 mM 富鐵酸鉀(K3Fe(CN)6 )20 mM 富亞鐵酸鉀 (K4Fe(CN)6?3H2O )2 mM MgCl2 或 MgSO4使用前加入X-gal儲存?( 20mg/mL溶于N,N-二甲基甲酰胺),終濃度為1mg/mL。上述三種X-gal染色用的溶液可在室溫下保存數(shù)月，溶于N,N-二甲基甲酰胺的X-gal儲存液則可于-20C在玻璃容器中儲存，用箔包裹后避光保存。5.5重組腺病毒的篩選和純丁-腺病毒轉移載體和腺病毒 DNA通過在體同源重組產生重組腺病毒，這涉及到復雜的反應和基因重排或突變，導致病毒呈 現(xiàn)不同的表型。雖然重組腺病毒 DNA在細菌內重組后已篩選到含有插入基因，但

51、我們還是建議按照下面的操作步驟對細 胞內產生的重組腺病毒進行鑒定。5.5.1 挑選最佳重組腺病毒：表達和基因輸送重組腺病毒的挑選取決于病毒表達蛋白和增殖的能力。比如有兩個不同特性的克隆，第一個克隆蛋白表達很好而且病毒可增殖至5000VP/細胞，而第二個克隆雖然蛋白表達水平只達到第一個克隆的75%,但是卻可以增殖到10000VP/細胞。擴增的時候，第二個克隆10L產量中的病毒數(shù)量即可達到第一個克隆20L的產量，這樣當需要大量擴增病毒時第二個克隆是較好的選擇，而且產物足以產生生物學效應，。篩選方法的選擇取決于病毒最終的應用。如果用于蛋白表達，那么必須使用能監(jiān)測蛋白表達水平的方法；如果要挑選能有 效

52、擴增的克隆，那么就用能定量檢測DNA產量的方法。簡單的重組腺病毒篩選可用 PCR方法，這一技術只檢測病毒中的重組DNA ,而不能篩選特定的表型。其它技術不但能篩選重組病毒，同時也能挑選特定的表型?？寺〉奶暨x可根據(jù)：1 .每個細胞產生病毒的數(shù)量。這可以用Southern雜交的方法，因為病毒 DNA量與每個細胞的病毒含量有關。能產生高水平病毒量的克隆有利于生產高滴度的病毒儲存液，但是增殖最佳的克隆未必能最有效地表達蛋白。2 .每個細胞蛋白表達的水平。這可以用Western雜交或功能測定的方法。請注意有些最佳克隆可能會較難培養(yǎng)。因此篩選方法的選擇取決于用來觀察生物學效應的蛋白表達水平和重組腺病毒的最

53、終應用。表4提供了選擇最佳篩選方法的向導。報告基因、表達蛋白的抗體和功能測定的敏感性將影響操作方法的選擇。得到最初結果的時間對方法的選擇也很重要，但這一原則必須慎重考慮，因為如果最終目的是生產大量病毒，那么一個10倍量高產的克隆只需擴增1L即能達到原來10L的病毒量，這時使用快速篩選方法所節(jié)省的時間會在大量擴增過程中完全耗費掉。表4:各種篩選方法的特性篩選方法優(yōu)點缺點Western雜交逐示表達蛋白的完整性瑜示插入基因的蛋白表達水平0需要表達蛋白的抗體 可以用與其它蛋白有交叉反應的抗體，因為蛋白會在膠上得到分離V'得到最終結果需兩個星期Southern 雜交或點雜交 4使用克隆基因作為探

54、針，無須特殊試劑通過信號強弱間接測定每個細胞內的病毒數(shù)量年需從病毒儲存液中額外擴增，整個流程需要一周時間Y雙能檢測克隆的基因pcrY迅速，使用擴增病毒的儲存液只需1天時間 苗又能檢測克隆的基因且無法定量%；能需要優(yōu)化克隆基因的 PCR條件免疫測定畬目對快速，總共需要 3天時間'需要與細胞蛋白無交叉反應的特異性抗體?顯示插入基因的蛋白表達水平功能測定丫直接顯示蛋白的完整性和功能疆從病毒儲存液中額外擴增，整個流程需要一周時間對于大多數(shù)方法來說，信號密度與蛋白的表達水平、病毒DNA的增殖程度以及病毒保存液的純度有關?？瞻呖偭恐械年栃月侍崾究寺〉募兌雀叩?。比較不同克隆間的信號密度水平時克隆的純

55、度非常重要，也就是說必須保證所有篩選出來的空 斑必須100%陽性。5.5.2病毒空斑挑選和小量擴增通過AdEasyTM系統(tǒng)純化得到的細菌克隆而產生的病毒空斑應該幾乎都是（95%）重組病毒。每個細菌克隆最好測定至少12個空斑的表型。操作步驟1 .從培養(yǎng)板上挑選612個空斑，標上圓圈。2 .無菌條件下用200 VL槍頭挑出克隆并轉入含 0.5mL DMEM5%/孔的24孔板。3 . 37c病毒24小時。4 .鋪一塊每孔含1X105 QBI-293A細胞的24孔板。5 .移去培養(yǎng)液，輕輕加入 100 VL步驟3中清洗的病毒（約103病毒顆粒），切勿將細胞吹起，十字型輕輕晃動3次，轉入CO2孵箱37

56、c培養(yǎng)90分鐘。6 .加入DMEM5% ,使總體積為1mL,輕輕混勻。7 . 37 CO2孵箱培養(yǎng)直至完全出現(xiàn) CPE,在此MOI值下一力需要510天。如果10天后還沒出現(xiàn)CPE,說明此克隆的病 毒量太低，需要進行第二輪擴增。8 .為從細胞中釋放病毒，在-20 C和37 c中充分凍融細胞 3次。9 .收集細胞，在15mL離心管中打碎。臺式離心機上以最大轉速離心10分鐘，收集上清并儲存于-80C。這一凍存液中大約有5X107VP/mL。如步驟7中所述，如果在第一次擴增后CPE不完全，則進行第二輪擴增。由于QBI-293A細胞含有腺病毒基因組的 E1區(qū)，因此E1區(qū)缺失的腺病毒與人染色體發(fā)生同源重組而產生有增殖能力的腺 病毒（RCA）的機率很低。發(fā)生這種回復突變的機率大約