試驗植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

1、植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定-考馬斯亮藍(lán)G - 250染色法一、原理考馬斯亮藍(lán) G - 250 （ Coomassie brilliant blue , G-250 ）法是利用蛋白質(zhì)-染料結(jié)合的原理，定量地測定微量蛋白質(zhì)濃度的快速、靈敏的方法?？捡R斯亮藍(lán) G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色。它和蛋白質(zhì)通過范德瓦爾鍵結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式，最大光吸收由465 nm變成595 nm ,通過測定595 nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)和染料結(jié)合是一個很快的過程，約2 min即可反應(yīng)

2、完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1 h ,之后，蛋白質(zhì) 磔料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來。此法靈敏度高，易于操作，干擾物質(zhì)少，是一種比較好的定量法。其缺點是在蛋白質(zhì)含量很高時線性偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。二、實驗材料、試劑與儀器設(shè)備（一）實驗材料植物材料。（二）試劑1 .標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（100科曠mL牛血清白蛋白）：稱取牛血清蛋白25 mg ,加水溶解并定容至100 mL ,吸取上述溶液 40 mL ,用蒸儲水稀釋至 100 mL即可。2 .考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán) G-250，溶于50 mL 90 %乙醇中，加入100 mL 85 % （ W / V ）的磷

3、酸，再用蒸儲水定容到1000 mL ,貯于棕色瓶中。常溫下可保存一個月。（三）儀器設(shè)備分光光度計，離心機，研缽，燒杯，量瓶，移液管，試管等。三、實驗步驟1 .標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支試管，按下表加入試劑，搖勻，向各管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，并放置5 min左右，以0號試管為空白對照，在 595 nm下比色測定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為 橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 .樣品測定（1 ）樣品提取稱取鮮樣0.250.5 g，用5 mL蒸儲水或緩沖液研磨成勻漿后，3000r/min離心10 min ,上清液備用。（2 ）吸取樣品提取液 1.0 mL （視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋），放入試管中（每個樣品重復(fù) 3 次），加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，放置 2 min后在595 nm下比色，測定吸光度， 并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑加入量試劑r管號012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(mL )00.200.400.600.801.00蒸儲水量（mL ）1.000.800.600.400.200考馬斯亮藍(lán)G-250 （ mL ）5.005.005.005.005.005.00蛋白質(zhì)含量（gg ）020406080100四、結(jié)果計算樣品中蛋白質(zhì)的含量=7£xfx1000蛋白質(zhì)單位（mg/