血液制品去除滅活病毒技術(shù)方法及驗證指導原則

1、血液制品去除/滅活病蠹技術(shù)方法及驗證指導原那么目前經(jīng)血液制品傳染的病毒主要有HBV HCV HIV-1、HIV-2、HTLV和細小病毒B19。尚未發(fā)現(xiàn)經(jīng)血液制品傳染CJD但有少數(shù)研究報揭發(fā)現(xiàn)有實驗性傳染現(xiàn)象，因此要密切關(guān)注CJD,特別是vCJD的開展動向。為了提高血液制品平安性，生產(chǎn)工藝要具有一定的去除/滅活局部病毒能力，生產(chǎn)過程中應有特定的去除/滅活病毒方法。本技術(shù)指導原那么是對血液制品指以人血漿為原料制備 的制品生產(chǎn)過程以及特定的去除 /滅活病毒方法驗證的指導原那么，包括指示病毒和病毒去 除/滅活方法的選擇、驗證方案的設(shè)計、結(jié)果判定以及附錄所列技術(shù)驗證申報的程序。一、去除/滅活病毒方法的選

2、擇由于不同類血液制品潛在的污染病毒的可能性不同，為此選擇病毒去除/滅活方法的側(cè)重點也應有所不同：一凝血因子類制品生產(chǎn)過程中應有特定的能去除 /滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一種或多種 方法聯(lián)合去除/滅活病毒。二免疫球蛋白類制品對于免疫球蛋白類制品 包括靜脈注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特異性人免疫球蛋白生產(chǎn)過程中應有特定的滅活脂包膜病毒方法。但從進一步提高這類制品平安性考慮，提倡生產(chǎn)過程中參加特定的針對非脂包膜病毒的去除/滅活方法。三白蛋白采用低溫乙醇生產(chǎn)工藝和特定的去除/滅活病毒方法，如巴斯德消毒法等。二、常用的去除/滅活病毒方法評價一巴斯德消毒法巴氏消毒法1.人血白蛋白制品幾十

3、年臨床應用結(jié)果說明，白蛋白的巴氏消毒法對HIV和肝炎病毒是平安的。 其病毒滅活條件已很完善，可不要求進行病毒滅活驗證。但是必須對巴氏消毒法所用設(shè)施進行驗證， 使巴氏消毒各參數(shù)符合要求包括制品內(nèi)溫度分布的均一性和滅活時間。2.其它血液制品液體制劑由于制品的組成、穩(wěn)定劑如：氨基酸、糖、枸椽酸鹽等及其濃度的不同，均會對滅 活病毒效果有一定的影響。因此在采用巴氏消毒滅活病毒方法時必須進行病毒滅活效果驗 證。二干熱法凍干制品80C加熱72小時，可以滅活HBV HCV HIV和AV等病毒。但應考慮制品的水分含量、 制品組成如：蛋白質(zhì)、糖、鹽和氨基酸對病毒滅活效果的影響。應確定允許的制品瓶間 各參數(shù)的差異。

4、病毒滅活用的干熱箱至少每半年驗證一次。驗證時枯燥箱內(nèi)應設(shè)多個測溫點包括制品內(nèi)、箱內(nèi)最高和最低溫度點。三有機溶劑/去污劑S/D處理法有機溶劑，如：磷酸三丁脂TNBFP和非離子化的去污劑，如：ritonX-100或吐溫-80結(jié)合可以滅活脂包膜病毒，但對非脂包膜病毒無效。常用的滅活條件是0.3% TNBP和1%溫-80，在24C處理至少6小時；0.3%TNB訝日1%riton X-100，在24C處理至少4小時。S/D處理前應先用1 m濾器除去蛋白溶液中可能存在的顆粒顆?？赡懿啬洳《緩亩绊懖《?滅活效果。參加S/D后應確保是均一的混合物。在滅活病毒全過程中應將溫度控制在規(guī)定的范圍內(nèi)。如果在參加S/

5、D后過濾，那么須檢測過濾后S/D的濃度是否發(fā)生變化， 如有變化應 進行適當調(diào)整。吐溫-80應采用植物源性，并應采用稱量法量取。四膜過濾法膜過濾技術(shù)只有在濾膜的孔徑比病毒有效直徑小時才能有效除去病毒。該方法不能單獨使用，應與其它方法聯(lián)合使用。驗證研究時應考慮蛋白溶液的濃度、 濾速、壓力和過濾量等重要參數(shù)。在過濾前及過濾 后應測試濾膜的完整性。五低pH孵放法研究說明，免疫球蛋白生產(chǎn)工藝中的低pH如pH=4處理有時加胃酶能滅活幾種脂包膜病毒。滅活條件如：pH值、孵放時間和溫度、胃酶含量、蛋白質(zhì)濃度、溶質(zhì)含量等因素可能影響病毒滅活效果，驗證試驗應該研究這些參數(shù)允許變化的幅度。三、特定的去除/滅活病毒方

6、法驗證一指示病毒的選擇首先，應該選擇經(jīng)血液傳播的相關(guān)病毒如：HIV,不能用相關(guān)病毒的，要選擇與其理化性質(zhì)盡可能相似的指示病毒；第二，所選擇的病毒理化性質(zhì)應有代表性病毒大小、核酸類型以及有無包膜，其中至少應包括一種對物理和/或化學處理有明顯抗性的病毒。在進行去除/滅活病毒驗證時，應根據(jù)制品的特性及所采用的病毒去除/滅活工藝，參照下表列舉的病毒選擇適宜的指示病毒。所選擇的指示病毒至少應包括HIV-1、HBV和HCV莫擬病毒以及非脂包膜病毒。水皰性口炎病毒VSV耐受的p范圍比擬廣，驗證低p孵放法滅活病毒效果時可選用此指示病毒。經(jīng)血液傳播疾病的相關(guān)病毒及驗證可選用的指示病毒舉例病毒基因組脂包膜大小nm

7、指示病毒舉例HIVRNA有80-100HBVDNA有45鴨乙型肝炎病毒、偽狂犬病毒HCVRNA有40-60牛腹瀉病毒、Sindbis病毒HAVRNA無27HAV脊髓灰質(zhì)炎病毒、腦心肌炎EMC病 毒B19DNA無20犬細小病毒、豬細小病毒二方案設(shè)計1.去除/滅活病毒驗證研究應符合GLP的要求。2.研究影響去除/滅活病毒效果的參數(shù)包括機械參數(shù)和理化參數(shù)允許變化的幅度。3.研究病毒滅活動力學，包括病毒滅活速率和滅活曲線。4.指示病毒滴度應該盡可能高病毒滴度應 A106/ml。5.參加的病毒與待驗證樣品體積比不能高于1 ： 9。6.如可能，驗證過程中每步取出的樣品應盡快直接進行病毒滴定, 超離心、透析

8、或保存、除去抑制劑或毒性物質(zhì)等。如果樣品必須做進一步處理，或不同時間取出的樣品要在同一時間進行測定，應考慮這些處理方法對病毒檢測結(jié)果的影響。不做進一步處理如7.檢測方法可包括蝕斑形成、細胞病變?nèi)绾习w或病灶形成、終點滴定或其他方法。這些方法應該有適宜的靈敏度和可重復性，每一個取樣點應取雙份樣品并設(shè)有對照以保證結(jié)果的準確性。8.如果制品的生產(chǎn)工藝中包含了兩步或兩步以上病毒去除/滅活方法，應該分別進行病毒滅活效果驗證。三觀察指標1.病毒方面1去除/滅活病毒滴度；2滅活病毒速率、滅活曲線。以列表和做圖形式報告驗證結(jié)果。2.病毒去除/滅活各參數(shù)允許變化范圍3.蛋白質(zhì)方面1制品質(zhì)量應符合中國生物制品規(guī)程

9、?或有關(guān)規(guī)定；2采用適當方法測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能活性的變化。如：制品比活性、HIVIG的Fc功能分析可了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生了變化；凝膠色譜法可檢測蛋白質(zhì)分子大小和形狀的變化；蛋白質(zhì)形狀變化可導致擴散系數(shù)、沉降常數(shù)和粘度的改變；SDS-PAGE特別是等電聚焦和PAGE吉合雙向電泳也是檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的很好方法。3如果采用新的去除/滅活方法包括更換使用已認可的病毒滅活方法或國內(nèi)外未曾采用過的病毒去除/滅活方法，需對蛋白質(zhì)半衰期和新免疫原性進行研究。要求如下：半衰期：用適宜動物如大鼠或家兔和未經(jīng)病毒去除/滅活的相同制品進行半衰期比擬；新免疫原性：新免疫原性用來檢查蛋白質(zhì)較高級別結(jié)構(gòu)上的變化。這些

10、變化不一定損害蛋白質(zhì)功能，但是會引起受體免疫反響。 實驗室檢測新免疫原性是非常困難的?？捎媒?jīng)和未經(jīng)病毒滅活的蛋白分別免疫動物如家兔，所產(chǎn)生的抗體交叉用未經(jīng)和經(jīng)病毒滅活的蛋白結(jié)合。如果經(jīng)病毒滅活的蛋白抗體被未經(jīng)病毒滅活的蛋白完全結(jié)合,證人類免疫系統(tǒng)識別的表位與實驗動物相同，因此推薦在W期臨床(獲得生產(chǎn)文號后)開展說明不含新抗原。由于不能保是否有新抗原產(chǎn)生的研究。(四) 效果的判定判斷病毒去除/滅活的有效性須綜合考慮，不能僅以病毒去除/滅活的量來確定。在確定 有效之前，必須考慮如下因素，審慎評價每次驗證結(jié)果。1.驗證試驗所選擇的病毒是否適宜，病毒驗證的設(shè)計是否合理。2.病毒降低量(log10) 4

11、logs， 表示該步驟去除/滅活病毒有效。 如因檢測方法造 成病毒降低量 v4 logs時，應盲傳三代，如無病毒檢出，可認定是有效的滅活病毒方法。3.病毒滅活動力學可更好的顯示病毒滅活的效果。病毒滅活通常不是簡單的一級反響。往往是起始反響速率快，其后變慢。如果病毒滅活速率隨時間明顯降低，表示該方法可能無效，或者殘留的指示病毒對該滅活方法有抵抗力，說明該步病毒滅活方法無效。4.病毒實際滴度為根底病毒， 指示病毒與樣品1：9的比例混勻后零點取樣的病毒滴度，通過與經(jīng)去除/滅活病毒后的測定的實際病毒殘留量的比擬，作為該病毒去除/滅活方法(步驟)實際的滅活病毒的量。5.病毒檢測敏感度的限值。舉例說明：(

12、1)參加6 logs病毒，剩余4 logs病毒，可將去除/滅活病毒的log數(shù)計算在生產(chǎn) 全過程中去除/滅活病毒總量之中，但是就此步(方法)去除 /滅活病毒能力而言是無效的。(2)參加6logs病毒，但由于制品本身的細胞毒作用使得檢測靈敏度限值為4 logs ,僅證明除去2 logs的病毒。在此種情況下需改變試驗設(shè)計重新進行驗證。(3)參加6 logs病毒，但仍可測定2 logs的剩余病毒，且去除病毒的量可重復出， 并不受工藝的影響，應認為是有效的去除/滅活病毒的方法。4參加6 logs病毒，之后未檢測出病毒。但是由于檢測靈敏度限值為2 logs ,僅能認為大約去除或滅活了4 logs病毒。事實

13、上可能等于或大于4 logs,因此應判定此 方法去除的病毒量 a4logs。5病毒滅活動力學是非常重要的觀察指標。如巴氏消毒法60C, 10小時，如果病毒殘留量很快降到最低檢出限度值， 說明此方法滅活病毒效果很好。如果病毒滅活速率緩 慢，在滅活結(jié)束時才到達最低檢出限度值， 不能認為是一個有效的病毒滅活方法。 這就是說， 評價驗證結(jié)果不能僅考慮病毒降低量，同時也要考慮病毒滅活動力學。四、生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒能力的驗證生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒能力驗證參照特定的去除 /滅活病毒方法驗證的要求進行。需要 特殊考慮的問題有以下幾方面：一只對可能有去除/滅活病毒作用的生產(chǎn)步驟進行驗證。二模擬的生產(chǎn)工藝各種

14、參數(shù)應盡可能與實際的生產(chǎn)工藝相一致，如p、溫度、蛋白質(zhì)和其他組成成分的濃度、反響時間、層析柱的柱床高度及流速與床高的比例、洗脫圖譜及該步驟的生產(chǎn)效果如產(chǎn)量、比活性、組成成分。應分析生產(chǎn)工藝中各種參數(shù)的偏差對病 毒去除/滅活效果的影響。三生產(chǎn)各步驟對不同類型病毒去除/滅活的選擇性。四核酸擴增技術(shù)如PCR檢測病毒核酸的靈敏度比擬高，但是該檢測技術(shù)最大的 局限性是不能區(qū)別被滅活了還是未被滅活的病毒。因此該技術(shù)不能用于滅活病毒量的驗證， 只能用于生產(chǎn)過程中病毒去除量的驗證。五通常在生產(chǎn)過程中去除 /滅活病毒量是可以計算在去除病毒總量中，但不能認定 是有效病毒去除步驟。因為生產(chǎn)過程通常有一些變化，很難控

15、制及驗證，而且，病毒分配完 全取決于病毒特異的理化性質(zhì)，這些理化性質(zhì)影響了病毒與凝膠介質(zhì)相互作用和沉淀的性質(zhì)。因此由于病毒外表特性的微小差異如：糖基化，指示病毒與靶病毒分配形式可能完 全不同。在實驗室增殖的相關(guān)病毒可能在分配上與野生株不同。復，如果影響病毒分配的各生產(chǎn)參數(shù)可以適當?shù)卮_定和控制,認的含病毒組份分開，就可以符合有效步驟的標準即，認為是有效去除/滅活病毒步驟六驗證的目的是為了確定生產(chǎn)工藝去除/滅活病毒的能力，獲得生產(chǎn)全過程中估計去除/滅活病毒的總量。一般降低的總量是各步降低病毒量的總和。但是由于病毒驗證的局 限性，如分步驟中病毒降低量 V1 log那么不應將其計算在總量中。五、去除/滅活