基因的體外重組和轉(zhuǎn)化

1、一、黏性末端的連接 黏性末端連接(Cohesive end ligation)： 具有黏性末端的兩個(gè)雙鏈DNA分子在DNA連接酶的作用下, 連接成為一個(gè)雜合雙鏈DNA。 1.同種酶產(chǎn)生的黏末端的連接優(yōu) 點(diǎn)經(jīng)濟(jì)省時(shí)，操作方便；外源片段容易回收；問 題載體自身環(huán)化 插入片段可雙向插入 2.不同限制酶酶切產(chǎn)生黏末端的連接 載體和目的基因分子上有兩個(gè)相同的酶切位點(diǎn) 載體和目的基因只有一個(gè)相同的限制酶識(shí)別位點(diǎn) 無相同的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，有同尾酶 SalSal片段（片段（CAGCTGCAGCTG） XhoXho 片段片段(GAGCTC) (GAGCTC) DNA連接酶討論： 連接后的重組分子還能被這兩種限制

2、酶切割么？若均不是以上情況呢？二、平末端的連接 平末端連接(blunt end ligation)： 在T4DNA連接酶的作用下，將兩個(gè)具有平末端的雙鏈DNA分子連接成雜種DNA分子。 優(yōu) 點(diǎn)可以用T4連接酶連接任何DNA平端 l5-突出粘性末端的補(bǔ)齊 可用Klenow聚合酶補(bǔ)齊l3-突出粘性末端的削平 可用T4 DNA聚合酶削平 主 要 問 題連接效率低高濃度的底物和T4 DNA連接酶添加凝聚劑：如聚乙二醇不易回收外源DNA片斷雙向插入三、修飾黏末端連接同聚物加尾法： 同聚物加尾(homopolymer tails joining)連接就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3端各加上一段

3、寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 然后在DNA連接酶的作用下, 連接成為重組的DNA。 優(yōu) 點(diǎn)不會(huì)發(fā)生自身環(huán)化作用；連接效率較高；存在問題操作繁瑣外源片段難回收可能會(huì)影響基因表達(dá)銜接物連接法 銜接物（linker）是指用化學(xué)方法合成的一段由812個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。DNA接頭法： DNA接頭（adapter）是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。IBamHI討論 如何將一平末端的DNA片段與BamH形成的粘性末端連接？（P156.4）四、四、PCRPCR產(chǎn)物的連接產(chǎn)物的連接1.1.限制性內(nèi)切酶酶切位

4、點(diǎn)引入法限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)引入法 在引物上添加或引入限制酶識(shí)別位在引物上添加或引入限制酶識(shí)別位點(diǎn)，使點(diǎn)，使PCRPCR產(chǎn)物兩端帶有相應(yīng)的限制產(chǎn)物兩端帶有相應(yīng)的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，進(jìn)一步與相應(yīng)載體進(jìn)酶識(shí)別位點(diǎn)，進(jìn)一步與相應(yīng)載體進(jìn)行連接。行連接。（1）在引物上添加酶切位點(diǎn)！注意添加保護(hù)序列 Primer1: 5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC引入的酶切位點(diǎn)是單一的（2）利用突變?cè)谝?端引入酶切位點(diǎn) 通過在PCR引物序列的5端突變一個(gè)或幾個(gè)堿基，創(chuàng)造出限制酶識(shí)別位點(diǎn)的方法。2.T-

5、A克隆 利用嗜熱聚合酶如Taq聚合酶的模板非依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性(在7075活性高)，使PCR產(chǎn)物的3末端加一個(gè)A的粘性端，將其直接克隆至3粘性末端含一個(gè)T的線性克隆載體中.35T載體載體35載體載體T3535AAPCR產(chǎn)物產(chǎn)物Taq 酶PCR擴(kuò)增+335PCR產(chǎn)物產(chǎn)物AA5T載體載體TT5533連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選 目的片段T載體的構(gòu)建： 用限制性內(nèi)切酶如XcmI, HphI, 與MobII 酶切產(chǎn)生3末端未配對(duì)的T； 應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶與雙脫氧TTP加入一個(gè)突出的T殘基到線形化載體的3末端。 應(yīng)用不依賴末端的Taq DNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性在線形化載體的3末端出的羥基基團(tuán)上催化

6、連接上一個(gè)T堿基。 五、Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng)GatewayGateway技術(shù)：技術(shù)： 一種克隆操作平臺(tái)：把目的基因克隆到入門載體（Entry Vector）后，就不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點(diǎn)和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（Destination Vector，目的載體）上。GatewayGateway技術(shù)的靈活性：技術(shù)的靈活性： 整合后的附著位點(diǎn)為 attL（BOP） attR（POB） 整合位點(diǎn)-attB attP 切除位點(diǎn)-attL attR 整合過程需要介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。第二節(jié)、重組體導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化(transformation):受

7、體細(xì)胞捕獲并表達(dá)質(zhì)粒DNA的生命過程；轉(zhuǎn)染(transfection):受體細(xì)胞捕獲并表達(dá)噬菌體DNA的生命過程；轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):重組體包裝成噬菌體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。 一、大腸桿菌感受態(tài)的制備 感受態(tài)：細(xì)胞處于能攝入核酸分子時(shí)的生理狀態(tài)就稱為感受態(tài)。 1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)用CaCl2處理過的大腸桿菌能夠吸收噬菌體DNA。此后不久，Cohen等人用CaCl2法實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，操作原理如下： 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌置入0的CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，再加入DNA，Ca2+與DNA結(jié)合形成抗DNase的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)

8、菌細(xì)胞膜的外表面上；經(jīng)短暫的42熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 CaCl2 二、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌 重組DNA轉(zhuǎn)移到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的過程1.吸附：雙鏈DNA分子吸附在受體菌表面2.轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA分子進(jìn)入受體菌，另一鏈降解；3.自穩(wěn)：外源質(zhì)粒DNA分子在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀；4.表達(dá)：供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄、翻譯。轉(zhuǎn)化項(xiàng)目CaCl2受體菌DNA液體LB皿a陽性對(duì)照10ulPBR322DNA100ul 1b陰性對(duì)照10ul2ul連接液100ul 2c陰性對(duì)照10ul100ul

9、3d連接液轉(zhuǎn)化組60ul6ul連接液600ul 4具體操作：冰浴30；42 2 ；冰浴2 ；加37預(yù)熱LB培養(yǎng)45；表中a、b、c各取100ul/皿涂布，連接液轉(zhuǎn)化組d梯度涂布 I 50ul2皿；II.500ul濃縮后2皿）37倒置培養(yǎng)過夜 ；檢查細(xì)菌生長(zhǎng)情況。 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度 試劑的質(zhì)量 雜菌和雜DNA的污染 思考題：試述 DNA片段的體外連接方式？練習(xí)題： 打算將一個(gè)cDNA克隆到一個(gè)表達(dá)載體，以便在Ecoli中大量制備相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這個(gè)cDNA的兩側(cè)具有BamHI的位點(diǎn)，因此計(jì)劃將它從BamH的位點(diǎn)插入載體中。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格地按照克隆手冊(cè)中的方法進(jìn)行：載體用BamHI切割以后，立即用堿性磷酸

10、酶處理除去5磷酸；接著將處理過的載體同用BamHI切割的cDNA片段混合，加入DNA連接酶后進(jìn)行溫育，連接之后，將DNA同已處理過的可以接受DNA的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞混合。最后，將混合物涂布在加有抗生素固體培養(yǎng)基的平板上。由于載體上帶有抗生素的抗性基因，所以，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠存活。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了4個(gè)對(duì)照： 對(duì)照1： 將未同任何載體接觸過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對(duì)照2： 將未切割載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)平板上； 對(duì)照3： 將經(jīng)切割(但未用堿性磷酸酶處理)并用連接酶連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)乎板上； 對(duì)照4： 將經(jīng)切割(并用堿性磷酸酶處理過)并用DNA連接酶

11、連接(但沒有cDNA片段)的載體轉(zhuǎn)化過的細(xì)菌細(xì)胞涂布在培養(yǎng)子板上。 在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無法計(jì)數(shù)的菌落。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長(zhǎng)。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒DNA，并用BamHI進(jìn)行切割，其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。 cDNA 克隆的結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 制備的樣品 1 2 3 對(duì)照1 只有細(xì)胞 TMTC 0 0 對(duì)照2 未切的載體 TMTC 0 1000 對(duì)照3 省去磷酸

12、酶處理，無cDNA TMTC 0 435 對(duì)照4 無cDNA TMTC 0 25 實(shí)驗(yàn)樣品 TMTC 0 34 注：TMTC=too many to count，多到無法計(jì)數(shù)。 (1)你如何看待第一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?對(duì)照1的目的是什么? (2)影響第二次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是什么?對(duì)照2的作用何在? (3)對(duì)照3和4各有什么作用? (4)為什么要用堿性磷酸酶處理載體?Taq 酶PCR擴(kuò)增+335PCR產(chǎn)物產(chǎn)物AA5T載體載體TT5533連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選 目的片段 在進(jìn)行第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞不是自己制備的，結(jié)果，在所有的平板上都長(zhǎng)出了多到無法計(jì)數(shù)的菌落。在第二次實(shí)驗(yàn)中，自己制備感受態(tài)細(xì)胞，但這一次，所有的平板上都沒有菌落生長(zhǎng)。接著又進(jìn)行了第三次實(shí)驗(yàn)，這次得到了轉(zhuǎn)化子。從實(shí)驗(yàn)平板上挑出12個(gè)菌落，分離了質(zhì)粒DNA，并用BamHI進(jìn)行切割，其中9個(gè)克隆產(chǎn)生大小同載體一樣的單一的一條帶，另三個(gè)克隆中切出一個(gè)cDNA片段，實(shí)驗(yàn)終于獲得成功。 cDNA 克隆的結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 制備的樣品 1 2 3 對(duì)照1 只有細(xì)胞 TMTC 0 0 對(duì)照2 未切的載體 T