基因工程制藥的下游技術

1、第八節(jié)第八節(jié) 基因工程制藥的下游技術基因工程制藥的下游技術 一、重組工程菌的培養(yǎng) 二、 基因工程藥物的分離純化 三、 基因工程藥物的質量控制 四、 基因工程藥物制造實例獲得目的基因獲得目的基因組建重組質粒構建基因工程菌（或細胞）培養(yǎng)工程菌產物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝制備基因工程藥物的一般程序制備基因工程藥物的一般程序上游階段下游階段一、一、 重組工程菌的培養(yǎng)重組工程菌的培養(yǎng)（一）、基因工程菌的培養(yǎng)方式（一）、基因工程菌的培養(yǎng)方式 分批培養(yǎng)(batch culture） 補料分批培養(yǎng)(fed batch culture） 連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture） 透析培養(yǎng)(

2、dialysis culture） 固定化培養(yǎng)(immobilized culture）分批培養(yǎng)分批培養(yǎng) 定義：將種子液和培養(yǎng)基一次性裝入反應器內，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后一次性出料的培養(yǎng)過程。 補料分批培養(yǎng)：將種子接人發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間后，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進一步生長的培養(yǎng)方法連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng) 定義：將種子接入發(fā)酵反應器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達一定程度后，開動進料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進行不間斷培養(yǎng) 由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難。兩階段連續(xù)培養(yǎng)透析培養(yǎng)透析培養(yǎng) 定義：利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產物來解除其對生產菌的不

3、利影響 膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時間段都對產物的產率有影響固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng) 基因工程菌經(jīng)固定化后，質粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利（二）、基因工程菌的培養(yǎng)工藝（二）、基因工程菌的培養(yǎng)工藝 生物工程菌為含有帶外源基因的重組載體的微生物細胞 生物工程菌的發(fā)酵生產的目的是希望能獲得大量的外源基因產物，盡可能減少宿主細胞本身蛋白的污染 發(fā)酵水平的好壞還直接影響產品的純化及其質量2.1 培養(yǎng)基的影響培養(yǎng)基的影響 培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持重組質粒的穩(wěn)定性，使外源基因能夠高效表

4、達 使用不同的培養(yǎng)基對菌體生長和外源基因表達有較大的影響 碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖及果糖等 氮源：酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨及氯化銨等 無機鹽、微量元素、維生素、生物素等2.2 接種量的影響接種量的影響 接種量：指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例，它的大小影響發(fā)酵的產量和發(fā)酵周期 接種量小，菌體延遲期較長，不利于外源基因的表達。采用大接種量，可以縮短生長延遲期，并使生產菌能迅速占領整個培養(yǎng)環(huán)境，減少污染機會；但接種量過高往往會使菌體生長過快，代謝產物積累過多，反而會抑制后期菌體的生長 溫度對基因表達的調控作用可發(fā)生在復制、轉錄、翻譯或小分子調節(jié)分子合成

5、等水平上 溫度影響蛋白質的活性和包含體的形成2.3 溫度的影響溫度的影響 溶解氧是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過程中影響菌體代謝的一個重要參數(shù)，溶解氧濃度對菌體生長和產物生成的影響很大。菌群在大量擴增過程中，耗氧進行氧化分解代謝，飽和氧的及時供給很重要 采用調整攪拌轉速的方法可以改善培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產量（發(fā)酵前期采用較低轉速，培養(yǎng)后期采用高攪拌轉速）2.4 溶解氧的影響溶解氧的影響 在發(fā)酵過程中pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件決定 采用兩階段培養(yǎng)工藝，培養(yǎng)前期階段著重于優(yōu)化工程菌的最佳生長條件（最佳pH范圍為6.8-7.4 ），培養(yǎng)后期階段著重于優(yōu)化外源蛋白的表達條件（最佳pH為

6、6.0-6.5） 2.5 pH的影響的影響 誘導時機的影響：一般在對數(shù)生長期或對數(shù)生長后期誘導表達 誘導表達程序的影響2.6 其他影響影響二、二、 基因工程藥物的分離純化基因工程藥物的分離純化 基因工程藥物的特點基因工程藥物的特點 目的產物在初始物料中含量低 含目的產物的初始物料組成復雜 目的產物的穩(wěn)定性差 種類繁多 應用面廣，對其質量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源等（一）、建立工藝需了解各種因素（一）、建立工藝需了解各種因素 含目的產物的初始物料的特點 物料中雜質種類和性質 目的產物特性 產品質量要求（二）、分離純化的基本過程（二）、分離純化的基本過程 細胞破碎 固液分離 濃縮與初步純化

7、 高度純化直至得到純品 成品加工（三）、細胞的破碎方法（三）、細胞的破碎方法 物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、高壓擠壓法 化學破碎法：滲透沖擊、增溶法、脂溶法 生物破碎法：酶溶法（四）、固液分離（四）、固液分離 離心沉淀：高速離心和超速離心 膜過濾：微濾、超濾和反滲透 雙水相萃取 （五）、重組蛋白質的分離純化（五）、重組蛋白質的分離純化 分離純化主要依賴色譜分離方法。分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜等 色譜技術是醫(yī)藥生物技術下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)點是該法具有多種多樣的分離機制、設備簡單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效

8、應離子交換層析離子交換層析 離子交換層析(ion exchange chromatography，IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法 離子交換色譜分辨率高、容量大、操作容易，為多肽、蛋白質、核酸和許多發(fā)酵產物分離純化的一種重要方法 陽離子交換劑和陰離子交換劑疏水層析疏水層析 疏水層析(hydrophobic interaction chromatography，HIC）是利用蛋白質表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團相互作用力的差異，對蛋白質組分進行分離的層析方法 廣泛應用于蛋白質類大分子的分離以及蛋

9、白質結構和折疊機制的研究等 在高鹽濃度時，蛋白質與固定相疏水締合；鹽濃度降低時蛋白質疏水作用減弱，目的蛋白質被逐步洗脫下來 疏水色譜回收率較高，蛋白質與固定相的疏水作用力較弱，蛋白質變性的可能性小，蛋白質活性在層析分離過程中不易喪失親和層析親和層析 親和層析(affinity chromatography，AC）是利用固定化配體與目的蛋白質之間非常特異的生物親和力進行吸附，這種結合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結合解除 親和色譜是分離純化蛋白質、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術，分離過程簡單、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣泛的應用。同時也可用于某些生物大分子結構和功

10、能的研究凝膠過濾層析凝膠過濾層析 凝膠過濾層析(gel filtration chromatography）又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析，是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對溶液中各組分進行分離的液相層析方法。填料有一定大小范圍的孔徑，大分子進不去先洗脫，小分子進入孔徑而后被阻滯，不同的蛋白質根據(jù)它們大小和形狀的不同在層析柱中被分離 優(yōu)點：設備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復性好、不改變樣品生物學活性等 缺點：分辨率較低，尤其是相對分子質量相近的分子之間 廣泛用于蛋白質(酶）、核酸、多糖等生物大分子的分離純化 用于蛋白質相對分子質量的測定、脫鹽、樣品濃縮等（六）、非蛋白質類雜質的去

11、除（六）、非蛋白質類雜質的去除 DNA的去除：離子交換層析、親和層析、疏水層析 熱原質的去除：最好的方法是防止產生熱原質，陰離子交換層析法，疏水層析法，親和層析法（多黏菌素B） 病毒的去除：色譜分離、紫外線照射和過濾 根據(jù)產物表達形式來選擇 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇（七（七 ）、選擇分離純化方法的依據(jù)）、選擇分離純化方法的依據(jù)7.1 根據(jù)產物表達形式來選擇根據(jù)產物表達形式來選擇 分泌型表達產物：濃縮處理（沉淀和超濾） 可溶性表達產物：親和層析，離子交換 周質表達產物：低濃度溶菌酶處理后，采用滲透壓休克的方法 包含體：對蛋白質分離純化有兩方面的影響，一是它可以很容

12、易地與胞內可溶性蛋白雜質分離，蛋白純化較容易完成；另一方面產物經(jīng)過了一個變性復性過程，較易形成產物的錯誤折疊和聚合體 選擇不同機制的分離單元組成一套分離純化工藝，盡早采用高效分離手段，將含量最多的雜質先分離去除，將最昂貴、最費時的分離單元放在最后階段7.2 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 先運用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，盡快縮小樣品體積，提高產物濃度，去除最主要的雜質 隨后采用高分辨率的操作單元，如離子交換色譜和親和色譜 最后選用分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元如凝膠排阻色譜，可以提高分離效果色譜分離次序的選擇色譜分離次序的選擇 經(jīng)鹽析得到的液體不適

13、宜于離子交換層析，可直接應用疏水層析 離子交換色譜之后進行疏水層析比較合適 親和層析多放在第二步以后 凝膠過濾色譜放在最后一步 要具有良好的穩(wěn)定性和重復性 要盡可能減少組成工藝的步驟 組成工藝的各技術或步驟之間要能相互適應和協(xié)調，工藝與設備也能相互適應，從而減少步驟之間對物料的處理和條件調整7.3 根據(jù)根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇分離純化工藝的要求來選擇 在工藝過程中要盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟，或干擾產品質量 工藝時間要盡可能短（生物活性收率會降低） 工藝和技術必須高效，收率高，易操作，對設備要求低，能耗低 具有較高的安全性三、三、 基因工程藥物的質量控制基因工程藥物的質量控制 1

14、983年美國FDA制定“重組DNA生產的藥品、生物制品生產與檢定要點” 1988年與1990年歐共體分別制定“基因重組技術醫(yī)藥用產品生產與質量控制”、“生物技術醫(yī)藥產品臨床前生物安全性試驗要求”與“生物技術生產細胞因子的質量控制” 1990年中國衛(wèi)生部相繼頒發(fā)“人用重組DNA制品質量控制要點” 1991年世界衛(wèi)生組織正式公布“重組DNA生產的藥品生物制品的生產和檢定要點” 2000年中國頒布執(zhí)行中國生物制品規(guī)程（一）、醫(yī)藥生物技術產品質量保證要（一）、醫(yī)藥生物技術產品質量保證要點點 產品安全性評價：臨床試驗 產品本身的結構：藥理學、毒理學研究 嚴格控制條件：從原料到制成品制備全過程的每一步都須

15、嚴格控制條件與鑒定質量，確保符合標準規(guī)格、安全有效（二）、生物材料的質量控制（二）、生物材料的質量控制 原材料的質量控制是要確保編碼藥品的DNA序列正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質粒純而穩(wěn)定 目的基因，表達載體，宿主細胞（三）、培養(yǎng)過程的質量控制（三）、培養(yǎng)過程的質量控制 在貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定 在培養(yǎng)過程中，要求質粒穩(wěn)定，始終無突變 重復生產發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定 始終能排除外源微生物污染（四）、純化過程的質量控制（四）、純化過程的質量控制 分離純化過程質量控制要求：保證去除微量DNA、糖類、殘余宿主蛋白質、純化過程帶人的有害化學物質及熱原質，或者將這類雜質都控制在規(guī)定限度以下

16、（五）、目標產品的質量控制（五）、目標產品的質量控制 基因工程藥物質量控制主要要點：產品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性 任何一種單一的分析方法都無法滿足對該類產品的檢測要求生物活性測定生物活性測定 體內生物活性測定要根據(jù)目的產物的生物學特性建立適合的生物學模型 體外生物活性測定方法：細胞培養(yǎng)計數(shù)法3H-TR摻入法和酶法細胞計數(shù)等 蛋白質的比活性：每毫克蛋白質的生物學活性。不僅是含量指標，也是純度指標 理化性質鑒定理化性質鑒定 非特異性鑒別 特異性鑒別：免疫印跡和點免疫 相對分子質量測定：凝膠過濾法和SDS-PAGE法 等電點測定：等電聚焦電泳法 肽圖分析：用酶法或化學法降解目的蛋白

17、質后，對生成的肽段進行的分離分析，它是一種可檢測蛋白質一級結構中細微變化的最有效方法 蛋白質降解形成的肽段鑒定：用SDS-PAGE電泳法、高效液相色譜、毛細管電泳法及質譜法 氨基酸組成分析 部分氨基酸序列分析：測定N端15個氨基酸，C端應根據(jù)情況測定1-3個氨基酸 蛋白質二硫鍵分析蛋白質含量測定和純度分析蛋白質含量測定和純度分析 含量測定：Folin-酚試劑法、染色法(Bradford法）、雙縮服法、紫外吸收法、HPLC法和凱氏定氮法等方法 純度分析：還原性和非還原性SDS-PAGE、等電點聚焦、各種HPLC及毛細管電泳等 雜質檢測雜質檢測 蛋白類雜質 非蛋白類雜質穩(wěn)定性考察和產品一致性穩(wěn)定性

18、考察和產品一致性 沒有一種單一的穩(wěn)定性試驗或參數(shù)能夠完全反映基因工程藥物的穩(wěn)定性特征，必須對產品在一致性、純度、分子特征和生物效價等多方面變化情況加以綜合評價 從原料、生產到產品的每一步驟都進行嚴格條件控制和質量鑒定，才能確保各批最終產品都是安全有效、含量和雜質限度一致并符合標準規(guī)格的（六）、產品的保存（六）、產品的保存 目的產物失活受多種理化因素的影響，保存時要根據(jù)其不同特性，采取不同的措施，防止變性、降解，保護其活性 液態(tài)保存和固態(tài)保存液態(tài)保存液態(tài)保存 低溫保存：液態(tài)蛋白質樣品在-20-10以下冷凍保存 在穩(wěn)定pH條件下保存：蛋白質較穩(wěn)定的pH一般在等電點附近 高濃度保存 加保護劑保存：糖

19、類、脂肪類、蛋白質類、多元醇及有機溶劑等 固態(tài)保存固態(tài)保存 固態(tài)蛋白質比液態(tài)穩(wěn)定，一般蛋白質含水量超過10%時容易失活。含水量降到5%時，在室溫或冰箱中保存均比較穩(wěn)定 長期保存蛋白質的最好方法：制成干粉或結晶 冷凍干燥是指使被干燥液體冷凍成固體，在低溫低壓條件下利用水的升華性能，使冰直接升華變成水蒸氣而除去，以達到干燥目的的一種干燥方法 凍干過程一般分三步：預凍結、升華干燥和解吸干燥四、 基因工程藥物制造實例 干擾素是真核細胞對各種刺激作出反應而自然形成的一組復雜的蛋白質。 干擾素除具有廣譜抗病毒活性，還具有抑制細胞分裂，特別是抑制腫瘤細胞生長和免疫調節(jié)等功能，作為一種生物活性蛋白有著良好的臨

20、床應用價值。 干擾素是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)分子結構和抗原性的差異分為、等4個類型。型干擾素在分為1b、2a、2b等亞型，其區(qū)別僅表現(xiàn)為個別氨基酸。 是我國已經(jīng)批準上市的基因工程藥物。 早期獲得方法：用病毒誘導人白血球(白細胞)產生，產量低，價格貴。 。 20032003年抗非典期間，江年抗非典期間，江南大學與麗珠集團蘇州新寶南大學與麗珠集團蘇州新寶制藥廠合作攻關，通過發(fā)酵制藥廠合作攻關，通過發(fā)酵工程和生物制藥工程研制成工程和生物制藥工程研制成功了重組人功了重組人-2b-2b干擾素口鼻干擾素口鼻腔噴霧劑，解決了干擾素常腔噴霧劑，解決了干擾素常溫保存穩(wěn)定性問題。在疫區(qū)溫保存穩(wěn)定性問題。

21、在疫區(qū)特殊人群捐贈使用，效果顯特殊人群捐贈使用，效果顯著。著。（一）、基因工程菌的組建誘生的白細胞 提取全RNA 通過寡dT-纖維素柱 蔗糖密度梯度 獲得寡A的mRNA 離心提取12s 的 mRNA 逆轉錄成cDNA 雙鏈cDNA接上dT或dG尾 pBR322質粒 pBR322質粒加上dA或dC 退火獲的雜交質粒 轉化大腸桿菌k12 擴增雜交質粒 篩選抗四環(huán)素但對氨芐 用已知干擾素的DNA片斷作為 青霉素敏感細菌克隆 探針挑選富有干擾素cDNA克隆 將干擾素cDNA克隆入表達載體 在大腸桿菌 中進行高效表達（二）、基因工程干擾素的制備啟開種子 制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng) 粗提精提 半成品制備 半成品

22、檢定 分裝凍干 成品檢定 成品包裝 2b干擾素生產過程 1.發(fā)酵 工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，質粒用PL啟動子，含氨芐青霉素抗性基因。種子培養(yǎng)基含1%蛋白胨0.5%酵母提取物0.5%NaCl。制備種子液作為發(fā)酵罐種子使用。 發(fā)酵培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05%NaCl，0.01%NH4Cl等。發(fā)酵培養(yǎng)基加入氨芐青霉素，防泡劑。30發(fā)酵8h，然后在42誘導2-3h可完成發(fā)酵。每隔不同的時間取發(fā)酵液，離心稱量濕菌體。 2.產品的提取與純化 a冷卻后離心，除上清液，得濕菌體懸浮于緩沖液中，冰浴條件下超聲破碎； b離心，取沉淀部分；加尿素、緩沖液和二巰基蘇糖醇溶液溶解。攪拌抽提2h，離心取上清。 c加入復性緩沖液，離心，除去不溶物。 d超濾器濃縮后，經(jīng)Sephadex G50 分離。 e經(jīng)SDS-PAGE檢查。 f再經(jīng)DE-52柱純化。（三）、質量控制標準和要求半成品檢定干擾素效價測定蛋白質含量測定比活性純度測定相對分子量測定殘余外源性DNA含量測定殘余血清IgG含量測定殘余抗生素活性測定紫外光譜掃描肽圖測定