(推薦)WesternBlot的原理,流程及常見(jiàn)問(wèn)題分析

1、(推薦)westernblot的原理,流程及常見(jiàn)問(wèn)題分析western blot 流程和常見(jiàn)問(wèn)題主要內(nèi)容一、一、western blot 技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)流程技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)流程二、二、western blot 技術(shù)技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題分析常見(jiàn)問(wèn)題分析34 western blot定義 western blot又稱免疫印跡，又稱免疫印跡，主要是通過(guò)電泳將樣品中的不同主要是通過(guò)電泳將樣品中的不同蛋白分離開(kāi)，然后蛋白分離開(kāi)，然后將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，利用相應(yīng)將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，利用相應(yīng)的抗體來(lái)檢測(cè)目的蛋白的一種方法。的抗體來(lái)檢測(cè)目的蛋白的一種方法。 western blot 應(yīng)用目的： 檢測(cè)樣品

2、中特異性蛋白質(zhì)的存在 細(xì)胞中某種蛋白質(zhì)的半定量分析 蛋白質(zhì)分子的相互作用研究 western blot實(shí)驗(yàn)流程5step4 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜step6 免疫反應(yīng)免疫反應(yīng) step7 檢測(cè)檢測(cè)step2 蛋白定量蛋白定量step3 sds-pagestep1 蛋白提取蛋白提取 step5 封閉封閉確定蛋白位置，選擇合適的蛋白抽提試劑 防止蛋白質(zhì)的降解 冰上操作 加入蛋白酶抑制劑 bac-細(xì)菌蛋白抽提試劑 mam-哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑 yea-酵母蛋白抽提試劑 tis-組織蛋白抽提試劑 nc-細(xì)胞核/漿蛋白抽提試劑步驟一、蛋白提取67步驟二、蛋白定量 bradford檢測(cè)范圍：100-1,500 ug/m

3、lbca檢測(cè)范圍：20-2,000 ug/mllowry檢測(cè)范圍： 11500ug/ml8bca定量 n 在562nm處有高的光吸收值，顏色的深淺與蛋白濃度呈正比。n 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。梯梯度度稀稀釋釋 步驟三、sds-page 電泳9l上樣前煮沸樣品l上樣量：30-100 gl蛋白marker10步驟四、轉(zhuǎn)膜3 膜的選擇： nc、pvdf、尼龍膜 轉(zhuǎn)膜方法： 半干轉(zhuǎn)、濕轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)膜確認(rèn)： 立春紅染色、蛋白預(yù)染marker膜的選擇1112轉(zhuǎn)移方法 半干轉(zhuǎn) 用濾紙吸buffer來(lái)做轉(zhuǎn)移體系 適合轉(zhuǎn)移小分子量的蛋白； 半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來(lái)算的， 時(shí)間是根據(jù) 蛋白分子大小定的；

4、 56ma/膜 1h 濕轉(zhuǎn) 將膜、膠、濾紙全浸泡在buffer的tank里 適合轉(zhuǎn)移大分子量（100kd以上）蛋白； 濕轉(zhuǎn)電流是恒定的，時(shí)間也是根據(jù)分子量而定； 300ma 1h轉(zhuǎn)移操作13+陽(yáng)極陽(yáng)極-陰極陰極多孔墊片多孔墊片濾紙濾紙凝膠凝膠膜濾紙濾紙 墊片墊片 2 2層濾紙層濾紙 膜（左上角標(biāo)記）膜（左上角標(biāo)記） 凝膠（凝膠（marker靠左）靠左） 2 2層濾紙層濾紙 墊片墊片黑色夾板（負(fù)極）黑色夾板（負(fù)極）56ma /膜 1h300ma 1h白色夾板（正極）白色夾板（正極）14轉(zhuǎn)膜后確認(rèn) 麗春紅可逆染色，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率。與下游wb檢測(cè)完全兼容，無(wú)任何干擾。 蛋白預(yù)染marker實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子

5、量參照與目的蛋白同時(shí)轉(zhuǎn)移至印跡膜上，檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率。對(duì)轉(zhuǎn)膜后的凝膠進(jìn)行考染麗春紅染色結(jié)果麗春紅染色結(jié)果15步驟五、封 閉去除非特異結(jié)合位點(diǎn)： blocking buffer ：3%bsa 5% milk room temperature 1 h 一抗的選擇 ：確定所研究的目的蛋白，根據(jù)目的蛋白名稱查詢相關(guān)抗體?？贵w所檢測(cè)的種屬：人、小鼠、大鼠等注意：抗體的稀釋倍數(shù)是由底物和目的蛋白質(zhì)的豐度決定的，為了獲得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，強(qiáng)烈推薦進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體的實(shí)驗(yàn)參數(shù).步驟六、抗體孵育1617步驟六、抗體孵育 二抗的選擇：抗小鼠抗小鼠抗兔抗兔抗大鼠抗大鼠抗人抗人抗山羊抗山羊抗雞抗雞抗豚鼠抗豚鼠抗馬抗馬標(biāo)記

6、物標(biāo)記物hrp、ap、biotin、熒光標(biāo)記、無(wú)標(biāo)記、熒光標(biāo)記、無(wú)標(biāo)記熒光標(biāo)記抗體熒光標(biāo)記抗體紅色cy3、tritc、rrx、texas red x、dylight549、dylight 594、dylight 649綠色fitc、cy2、dylight488藍(lán)色amca近紅外線cy5 根據(jù)一抗物種： 根據(jù)標(biāo)記物：步驟七、檢測(cè)方法18化學(xué)發(fā)光法：化學(xué)發(fā)光法： hrp酶標(biāo)系統(tǒng)-ecl魯米諾（luminol） 特點(diǎn)特點(diǎn)：無(wú)毒害、靈敏度高、速度快； 特異性好、節(jié)省抗體、線性寬； 可重新剝離檢測(cè)?；瘜W(xué)顯色法：化學(xué)顯色法： 酶標(biāo)系統(tǒng)hrp-tmb和dab 酶標(biāo)系統(tǒng)ap-bcip和nbt 特點(diǎn)特點(diǎn)：方便、

7、便宜； 具有一定毒性、靈敏度較低、反應(yīng)速度慢； 檢測(cè)后的膜不可重新剝離檢測(cè)。19推 薦對(duì)照設(shè)置 內(nèi)參對(duì)照 beta-actin /beta-tubulin/gapdh 陽(yáng)性對(duì)照 檢測(cè)一抗是否正常 陰性對(duì)照 檢測(cè)一抗特異性 空白對(duì)照 不加一抗，只加二抗，檢測(cè)二抗是否發(fā)生交叉反應(yīng)。 二western blot 技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題分析20原因原因解決辦法解決辦法膜的污染使用干凈鑷子；戴手套操作；換一張新膜用足夠的液體，膜始終保持濕潤(rùn)；孵育時(shí)使用脫色搖床；避免膜重疊，互相覆蓋；小心操作，勿毀損膜漂洗不完全增加漂洗時(shí)間和緩沖液體積封閉液不適合比較嘗試不同封閉液封閉不完全延長(zhǎng)封閉時(shí)間 （可4過(guò)夜）抗體濃度過(guò)高優(yōu)

8、化降低一抗、二抗?jié)舛绕毓鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)縮短曝光時(shí)間緩沖液污染使用新配制緩沖液原因原因解決辦法解決辦法抗原量不足增加上樣量蛋白質(zhì)儲(chǔ)存過(guò)程中降解重新制備樣品轉(zhuǎn)膜不完全確定轉(zhuǎn)膜效率、保證膠與膜充分結(jié)合、電極正確裝配、控制轉(zhuǎn)膜溫度（冰袋降溫）、優(yōu)化轉(zhuǎn)膜電流及時(shí)間。膜錯(cuò)誤選擇選擇合適膜的孔徑：22kd 蛋白選用 0.45m孔徑 22kd 蛋白選用 0.22m孔徑抗原被封閉液遮蔽優(yōu)化封閉液、縮短封閉時(shí)間、減小封閉液中蛋白濃度。抗體增加抗體濃度、注意抗體儲(chǔ)存條件（避免反復(fù)凍融）。曝光時(shí)間過(guò)短延長(zhǎng)曝光時(shí)間底物延長(zhǎng)底物孵育時(shí)間現(xiàn)象現(xiàn)象原因原因解決辦法解決辦法熒光萃滅快二抗?jié)舛忍吣じ稍锝档投節(jié)舛缺ＷC膜的濕潤(rùn)度條帶內(nèi)出現(xiàn)不顯影圓點(diǎn)轉(zhuǎn)膜過(guò)程中有氣泡轉(zhuǎn)膜時(shí)趕盡氣泡條帶不完整底物孵育不均勻用保鮮膜均與孵育底物反影（白色條帶、黑色背景）hrp濃度過(guò)