hbv基因與耐藥檢測(cè) 臨床版

1、整理課件產(chǎn)品經(jīng)理 吳 勇HBVHBV分型和耐藥突變基因檢測(cè)分型和耐藥突變基因檢測(cè)產(chǎn)品經(jīng)理 吳 勇一、慢性乙肝患者抗病毒治療的臨床現(xiàn)狀一、慢性乙肝患者抗病毒治療的臨床現(xiàn)狀二、基因芯片原理、亞能二、基因芯片原理、亞能HBVHBV分型與耐藥突變基因檢測(cè)分型與耐藥突變基因檢測(cè)三、三、HBVHBV分型與耐藥突變基因檢測(cè)的運(yùn)用與臨床意義分型與耐藥突變基因檢測(cè)的運(yùn)用與臨床意義目目 錄錄一、一、乙肝患者抗病毒治療的臨床現(xiàn)狀乙肝患者抗病毒治療的臨床現(xiàn)狀耐藥耐藥 指南指南 策略策略 干擾素：干擾素：普通干擾素（2a、2b、1b）、 聚乙二醇干擾素（2a、2b）核苷（酸）類藥物：核苷（酸）類藥物：拉米夫定、阿德福韋

2、酯、 恩替卡韋、替比夫定藥物種藥物種類有限類有限我國(guó)我國(guó)CHB治療現(xiàn)狀治療現(xiàn)狀20122012年年EASLEASL、APASLAPASL乙肝防治指南建議乙肝防治指南建議: : ETV或TDF作為單藥一線用藥國(guó)內(nèi)難以普及國(guó)內(nèi)難以普及： 強(qiáng)調(diào)根據(jù)情況個(gè)體化選藥，患者依從性差國(guó)情國(guó)情差異差異干擾素：干擾素：PegIFN 1年病毒學(xué)應(yīng)答率25%，HBeAg血 清學(xué)轉(zhuǎn)換率30%，血清HBV DNA陽(yáng)性率高；耐藥問(wèn)題耐藥問(wèn)題: :核苷（酸）類藥物療效療效有限有限慢性乙型肝炎聯(lián)合抗病毒治療專家共識(shí)，中國(guó)肝臟病雜志，2011，3（2）：38-45耐藥的危害耐藥的危害導(dǎo)致疾病進(jìn)展（病毒學(xué)反彈、生化突破等）導(dǎo)致疾

3、病進(jìn)展（病毒學(xué)反彈、生化突破等）肝硬化和肝癌發(fā)生率高肝硬化和肝癌發(fā)生率高使已取得的療效（如組織學(xué)改善）喪失使已取得的療效（如組織學(xué)改善）喪失后續(xù)治療更復(fù)雜、困難，增加醫(yī)療成本后續(xù)治療更復(fù)雜、困難，增加醫(yī)療成本耐藥毒株的傳播可能導(dǎo)致公共衛(wèi)生問(wèn)題耐藥毒株的傳播可能導(dǎo)致公共衛(wèi)生問(wèn)題警惕警惕耐藥耐藥HBVHBV耐藥耐藥EASL Clinical Practice Guidelines :Management of chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology 2012 vol.57|167-185核苷（酸）類藥物耐藥核苷（酸）類藥

4、物耐藥的預(yù)防和治療的預(yù)防和治療1243 33 5慢性乙型肝炎防治指南（慢性乙型肝炎防治指南（20102010年）年）嚴(yán)格掌握治療適應(yīng)癥嚴(yán)格掌握治療適應(yīng)癥謹(jǐn)慎選擇核苷（酸）類藥物謹(jǐn)慎選擇核苷（酸）類藥物1高危患者及時(shí)聯(lián)合治療高?；颊呒皶r(shí)聯(lián)合治療治療中密切監(jiān)視，一旦耐藥盡早救援治療治療中密切監(jiān)視，一旦耐藥盡早救援治療盡量避免單藥序貫治療盡量避免單藥序貫治療生物化學(xué)檢查：生物化學(xué)檢查：血清ALT和AST、膽紅素、白蛋白等乙肝實(shí)驗(yàn)室檢查乙肝實(shí)驗(yàn)室檢查HBVHBV血清學(xué)檢查血清學(xué)檢查：HBsAg、抗HBs、HBeAg等乙肝兩對(duì)半HBV DNAHBV DNA、基因型和變異檢測(cè)基因型和變異檢測(cè)生物化學(xué)檢查：

5、生物化學(xué)檢查：血清ALT和AST、膽紅素、白蛋白等HBVHBV血清學(xué)檢查血清學(xué)檢查：HBsAg、抗HBs、HBeAg等乙肝兩對(duì)半HBV DNAHBV DNA、基因型和變異檢測(cè)基因型和變異檢測(cè)生物化學(xué)檢查：生物化學(xué)檢查：血清ALT和AST、膽紅素、白蛋白等HBVHBV分型與耐藥突變檢測(cè)方法分型與耐藥突變檢測(cè)方法u PCR PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法；產(chǎn)物直接測(cè)序法；u PCR PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序法；產(chǎn)物克隆測(cè)序法；u 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)(RFLP)；u 線性探針?lè)聪螂s交法線性探針?lè)聪螂s交法(INNO-LiPA)(INNO-LiPA)；u 基因芯片技術(shù)基因芯片技

6、術(shù)u 限制性片段質(zhì)譜多肽性分析限制性片段質(zhì)譜多肽性分析u 焦磷酸測(cè)序法焦磷酸測(cè)序法u 深度測(cè)序法深度測(cè)序法二、基因芯片原理、二、基因芯片原理、亞能亞能HBVHBV分型與耐藥突變基因檢測(cè)分型與耐藥突變基因檢測(cè)基因芯片基因芯片(gene chip)(gene chip)：是多種特定的寡核苷酸序列為探針，固定于支持物表面上而成的二維DNA陣列?；驹恚夯驹恚豪脡A基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過(guò)目的DNA與探針特異結(jié)合來(lái)判斷目的DNA的序列信息?；蛐酒砘蛐酒硪倚透窝撞《痉中秃湍退幫蛔兓驒z測(cè)試劑盒乙型肝炎病毒分型和耐藥突變基因檢測(cè)試劑盒 （PCR-PCR-反向點(diǎn)雜交法）反向點(diǎn)雜交法）注冊(cè)號(hào)：國(guó)

7、食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字注冊(cè)號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字20112011第第34011773401177號(hào)號(hào)專利號(hào)：專利號(hào)：國(guó)內(nèi)首個(gè)全面提示核苷（酸）類藥物耐藥的快速診斷試劑國(guó)內(nèi)首個(gè)全面提示核苷（酸）類藥物耐藥的快速診斷試劑 PCR PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增：在S基因和P基因重疊區(qū)段設(shè)計(jì)PCR引物，PCR擴(kuò)增片段既包含耐藥突變位點(diǎn)又能進(jìn)行基因分型。P P基因：耐藥突變檢測(cè)基因：耐藥突變檢測(cè)編碼DNA合成酶（包含逆轉(zhuǎn)錄酶rt），抗病毒藥物作用靶區(qū)，耐藥基因突變熱點(diǎn)區(qū)S S基因：分型檢測(cè)基因：分型檢測(cè)產(chǎn)品技術(shù)原理產(chǎn)品技術(shù)原理亞能亞能HBVHBV產(chǎn)品應(yīng)用產(chǎn)品應(yīng)用抗病毒治療前、治療中抗病毒治療前、治療中HBVHBV的基因分

8、型和耐藥突變基因檢測(cè)的基因分型和耐藥突變基因檢測(cè)u 區(qū)分我國(guó)常見(jiàn)的區(qū)分我國(guó)常見(jiàn)的HBV-BHBV-B、C C、D D基因型基因型u 涵蓋我國(guó)涵蓋我國(guó)4 4種核苷（酸）抗病毒藥物（拉米夫定、阿德福韋酯、種核苷（酸）抗病毒藥物（拉米夫定、阿德福韋酯、 替比夫定、恩替卡韋）替比夫定、恩替卡韋）7 7個(gè)耐藥位點(diǎn)的個(gè)耐藥位點(diǎn)的1616種突變：種突變：rtL180MrtL180M、rtM204V/rtM204V/I I、rtA181V/TrtA181V/T、rtN236TrtN236T、rtM250I/L/VrtM250I/L/V、rtS202G/rtS202G/I I、rtT184rtT184I I/S

9、/A/F/L/S/A/F/L。本產(chǎn)品檢測(cè)的樣本為本產(chǎn)品檢測(cè)的樣本為血清或血漿血清或血漿；要求待檢樣本的要求待檢樣本的HBV DNAHBV DNA載量載量1.01.010103 3copies/mLcopies/mL。樣本要求樣本要求樣本保存樣本保存為了避免為了避免DNADNA降解，制備好的血清或血漿，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫放置；降解，制備好的血清或血漿，避免長(zhǎng)時(shí)間室溫放置；2 28 8保存不超過(guò)保存不超過(guò)4848小時(shí)；小時(shí)；-18-18以下保存不超過(guò)半年，避免反復(fù)凍融。以下保存不超過(guò)半年，避免反復(fù)凍融。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)全基因序列全基因序列測(cè)定法測(cè)定法限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（分析

10、法（RFLPRFLP）實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)熒光PCRPCR法法亞能亞能HBV HBV 基因芯片基因芯片靈敏度靈敏度靈敏度低，最低檢測(cè)限為20%；靈敏，最低檢測(cè)限為5%；靈敏，最低檢測(cè)限為5%；靈敏，最低檢測(cè)限為5%；檢測(cè)檢測(cè)位點(diǎn)位點(diǎn)所有突變位點(diǎn)已知耐藥位點(diǎn)僅能檢測(cè)rt204位點(diǎn)我國(guó)4種核苷類藥物7個(gè)耐藥位點(diǎn)的16種突變?cè)u(píng)價(jià)評(píng)價(jià)1、測(cè)序試劑大多未獲得SFDA批準(zhǔn)；2、操作繁瑣、技術(shù)難度大、儀器要求高、不易在臨床開(kāi)展。1、需針對(duì)每一個(gè)待測(cè)突變位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)特異性內(nèi)切酶反應(yīng)體系；2、一些突變可能生成新的酶切位點(diǎn)，或破壞原有酶切位點(diǎn)，必須謹(jǐn)慎看待檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果僅提示拉米夫定耐藥。1、是首個(gè)獲得SFDA批準(zhǔn)的，

11、同時(shí)進(jìn)行分型、耐藥檢測(cè)的試劑盒；2、準(zhǔn)確性好、6小時(shí)出結(jié)果、結(jié)果肉眼可見(jiàn)。儀器要求低，操作便捷、易于臨床使用。HBVHBV耐藥檢測(cè)產(chǎn)品比較耐藥檢測(cè)產(chǎn)品比較三、三、HBVHBV分型與耐藥突變基因檢測(cè)分型與耐藥突變基因檢測(cè)的運(yùn)用與臨床意義的運(yùn)用與臨床意義HBVHBV基因型檢測(cè)臨床意義基因型檢測(cè)臨床意義u HBeAg HBeAg陽(yáng)性患者中，陽(yáng)性患者中，B B基因型對(duì)基因型對(duì)IFN-IFN-治療的應(yīng)答率高于治療的應(yīng)答率高于C C基因基因 型，型，A A基因型高于基因型高于D D基因型?；蛐?。u 與與C C基因型感染者相比，基因型感染者相比，B B基因型感染者較早出現(xiàn)基因型感染者較早出現(xiàn)HBeAgHB

12、eAg血清學(xué)血清學(xué) 轉(zhuǎn)換，較少進(jìn)展為慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌；轉(zhuǎn)換，較少進(jìn)展為慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌；預(yù)測(cè)干擾素應(yīng)答和疾病進(jìn)展情況預(yù)測(cè)干擾素應(yīng)答和疾病進(jìn)展情況慢性乙型肝炎防治指南（慢性乙型肝炎防治指南（20102010年）年）HBVHBV耐藥檢測(cè)臨床意義耐藥檢測(cè)臨床意義u 抗病毒治療前，預(yù)存耐藥檢測(cè)抗病毒治療前，預(yù)存耐藥檢測(cè) 協(xié)助臨床選擇合理抗病毒藥物，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化抗病毒治療、提高抗病毒療效、降低耐藥發(fā)生率。u 抗病毒治療中，全程耐藥監(jiān)測(cè)抗病毒治療中，全程耐藥監(jiān)測(cè) 全程監(jiān)測(cè)耐藥，利于早期挽救治療，為調(diào)整治療方案提供理論支持。選擇合理抗病毒藥物，為調(diào)整治療方案提供理論依據(jù)選擇合理

13、抗病毒藥物，為調(diào)整治療方案提供理論依據(jù)抗病毒治療前抗病毒治療前抗病毒治療期間抗病毒治療期間抗病毒治療效果不佳時(shí)抗病毒治療效果不佳時(shí)何時(shí)選擇何時(shí)選擇HBVHBV基因分型、耐藥檢測(cè)？基因分型、耐藥檢測(cè)？預(yù)存耐藥檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)治療個(gè)體化預(yù)存耐藥檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)治療個(gè)體化LAMLAM、ADV ADV 、ETVETV預(yù)存耐藥率分別為預(yù)存耐藥率分別為7.81%7.81%、7.81%7.81%、1.56%1.56%預(yù)存耐藥 慢性乙型肝炎患者在核苷(酸)類似物治療前即存在耐藥位點(diǎn)突變，即預(yù)存耐藥變異。蓋洪鵬，孫偉翔，袁德勝，等，預(yù)存耐藥對(duì)核苷（酸）類似物抗病毒治療應(yīng)答和耐藥的影響，臨床肝膽病雜志，2012，28（11）

14、：841-844預(yù)存耐藥檢測(cè)顯著提高預(yù)存耐藥檢測(cè)顯著提高CHBCHB患者患者 HBV DNA HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率、轉(zhuǎn)陰率、HBeAg/HBeAg/抗抗HBeHBe轉(zhuǎn)換率轉(zhuǎn)換率蓋洪鵬，孫偉翔，袁德勝，等，預(yù)存耐藥對(duì)核苷（酸）類似物抗病毒治療應(yīng)答和耐藥的影響，臨床肝膽病雜志，2012，28（11）：841-8444848周周HBeAg/HBeAg/抗抗-HBe-HBe轉(zhuǎn)換率轉(zhuǎn)換率P P 4848周周HBV DNA HBV DNA 轉(zhuǎn)陰率轉(zhuǎn)陰率P P 預(yù)存耐藥檢測(cè)，顯著提高臨床療效預(yù)存耐藥檢測(cè)，顯著提高臨床療效抗病毒治療中的監(jiān)測(cè)抗病毒治療中的監(jiān)測(cè)( (線路圖）線路圖）治療第治療第12周評(píng)估是否存

15、在周評(píng)估是否存在“原發(fā)性無(wú)應(yīng)答原發(fā)性無(wú)應(yīng)答”病毒學(xué)應(yīng)答：HBV DNA 較基線下降10IU或50拷貝/ml原發(fā)性治療失?。篐BV DNA 較基線下降 10IU或 50拷貝/ml患者依從性良好：加用更強(qiáng)的抗病藥物患者依從性不佳：督促勸說(shuō)堅(jiān)持治療治療治療24周評(píng)估療效的早期預(yù)測(cè)因子周評(píng)估療效的早期預(yù)測(cè)因子完全病毒學(xué)應(yīng)答：PCR檢測(cè) HBV DNA 陰性部分病毒學(xué)應(yīng)答：60IU/ml HBV DNA 2000IU/ml不充分病毒學(xué)應(yīng)答：HBV DNA 2000IU/ml以同一藥物繼續(xù)治療，每6個(gè)月監(jiān)測(cè)一次基因屏障低的藥物：加用基因變異特點(diǎn)不同的第二種藥物基因屏障高的藥物：每3個(gè)月監(jiān)測(cè)一次并在48周后

16、繼續(xù)監(jiān)測(cè)抗病毒能力相對(duì)低的藥物：每3個(gè)月監(jiān)測(cè)一次并在48周后繼續(xù)監(jiān)測(cè)加用更強(qiáng)的抗病毒藥物：每3個(gè)月監(jiān)測(cè)一次若第48周獲得完全病毒學(xué)應(yīng)答，則繼續(xù)治療若第48周未獲得病毒學(xué)應(yīng)答，則加用一種更強(qiáng)且無(wú)交叉耐藥的藥物Keeffe，et al.Clinical Gastroenterology and Hepatology，2007，5：890897耐藥基因位點(diǎn)變異與臨耐藥基因位點(diǎn)變異與臨床挽救治療方案床挽救治療方案突變基因位點(diǎn)突變基因位點(diǎn)結(jié)果模式結(jié)果模式對(duì)應(yīng)的耐藥藥物對(duì)應(yīng)的耐藥藥物臨床挽救治療方案臨床挽救治療方案rt180M+rt204I/Vrt180M+rt204I/V拉米夫定（拉米夫定（LAMLAM

17、）1 1、加用或換用、加用或換用TDFTDF2 2、加用、加用ADVADVrt204I/Vrt204I/Vrt181V/Trt181V/T換用換用ETVETVrt180M+rt204I/Vrt180M+rt204I/V替比夫定（替比夫定（LdTLdT）1 1、加用或換用、加用或換用TDFTDF2 2、加用、加用ADVADVrt204Irt204Irt181V/Trt181V/T換用換用ETVETVrt181V/Trt181V/T阿德福韋酯（阿德福韋酯（ADVADV）1 1、加或換用、加或換用ETVETV2 2、加用、加用LAMLAM、LdT(rt181LdT(rt181位點(diǎn)未突變者位點(diǎn)未突變者

18、) )rt236Trt236Trt180M+rt204I/Vrt180M+rt204I/V或或rt204I/Vrt204I/V184I/S/A/F/L184I/S/A/F/L恩替卡韋（恩替卡韋（ETVETV） 1 1、加或換用、加或換用TDFTDF 2 2、加用、加用ADVADV250I/L/V250I/L/V202G/I202G/I抗病毒治療耐藥檢測(cè)節(jié)點(diǎn)抗病毒治療耐藥檢測(cè)節(jié)點(diǎn)抗病毒抗病毒治療前治療前部分病毒學(xué)應(yīng)答、不部分病毒學(xué)應(yīng)答、不充分病毒學(xué)應(yīng)答者充分病毒學(xué)應(yīng)答者治療治療24周周治療治療12周周評(píng)估是否原評(píng)估是否原發(fā)無(wú)應(yīng)答發(fā)無(wú)應(yīng)答療效早期療效早期預(yù)測(cè)預(yù)測(cè)后每后每12周監(jiān)周監(jiān)測(cè)一次測(cè)一次抗病毒治療過(guò)程中效果不佳時(shí)：抗病毒治療過(guò)程中效果不佳時(shí)： 需及時(shí)進(jìn)行需及時(shí)進(jìn)行HBVHBV耐藥突變檢測(cè)，調(diào)整用藥。耐藥突變檢測(cè)，調(diào)整用藥。預(yù)存耐藥預(yù)存耐藥國(guó)內(nèi)首個(gè)全面提示核苷（酸）類藥物耐藥的快速診斷試劑；國(guó)內(nèi)首個(gè)全面提示核苷（酸）類