實驗二槐米中蘆丁的提取和蘆丁水解制備槲皮素

1、-實驗二槐米中蘆丁的提取和蘆丁水解制備槲皮素一、概述植物來源 ：槐米系豆科植物槐樹（sophora japonica L.）的花蕾（槐米），蘆丁含量高達(dá)12%20%。蕎麥中含量也較高。含蘆丁成分的植物高達(dá)70 種以上。功效：蘆丁經(jīng)藥理實驗證明具有調(diào)節(jié)毛細(xì)血管滲透作用，具有維生素P 樣作用。在臨床上用作毛細(xì)血管止血藥，常作為高血壓病的輔助用藥。蘆丁為槐米中主要有效成分。主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)：蘆?。?Rutin）也稱蕓香苷，是槲皮素 3位上的羥基與蕓香糖脫水縮合形成的苷 (蕓香糖為葡萄糖與鼠李糖組成的雙糖) 。分子式： C27H30O16· 3H2O，淡黃色針狀結(jié)晶，含三分子結(jié)晶

2、水，熔點174 178 ,無水物為 188190。易溶于堿液，顯橙黃色，酸化后又析出。在冷水中的溶解度為 1 ： 10000 ，熱水中為1： 200，在冷乙醇中為1： 650 ，在熱乙醇中為 1： 60，在吡啶中為 1： 12。微溶于乙酸乙酯和丙酮，難溶于苯、三氯甲烷、石油醚等極性小有機溶劑，可溶于硫酸和鹽酸，加水稀釋又可析出。UVEtOH： 259 ， 299 ， 359nm。蘆丁用 20%HSO4水溶液水解可得槲皮素max（蘆丁的苷元），呈黃色結(jié)晶，313 314， C15H10O7· 2H2O，在熱乙醇中溶解度為1： 23 ，冷乙醇中1： 290 ，UVEtOH難溶于水和苯等極

3、性小的有機溶劑，可溶于極性較大的有機溶劑如甲醇、乙酸乙酯、丙酮等。：max255， 269sh,301sh,370nm。其他成分理化性質(zhì)：皂苷（ saponin）粗品為白色粉末， 220 。易溶于吡啶。能溶于200 倍的甲醇，酸水解后獲得兩種苷元（白樺酯醇、槐花二醇）及糖（糖為葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸內(nèi)酯）。白樺酯醇）無色針晶， m.p215 217 , 能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙（ betulin醇、Sophoradiolm.p219 220 或三氯甲烷、苯等；難溶于石油醚?；被ǘ迹o色針晶，（224，溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇，難溶于水。蘆丁和槲皮素結(jié)構(gòu)式如下所示。OHO

4、HOOHOHOHOOHOHOOH2OHOHO OCCH3OOHOOHOHOHOHOH蘆丁MW664.6 (含三分子水)槲皮素MW338.3（含二分子水）-1-實驗部分（一）實驗?zāi)康囊?. 制備蘆丁，供藥用。2. 通過蘆丁的制備，掌握黃酮類化合物的提取分離的原理和操作。3. 掌握黃酮苷水解制備黃酮苷元的方法。4. 熟悉重結(jié)晶技巧。5. 了解和掌握黃酮類化合物的一些主要性質(zhì)和鑒定方法。（二）實驗的基本原理1. 蘆丁的提取原理利用蘆丁結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，呈酚酸性，能在堿水中溶解的性質(zhì)，可用堿性溶劑進(jìn)行提取，提取液加酸后可沉淀析出（堿溶酸沉法） 。也可利用蘆丁在冷水中溶解度小，在熱水中溶解度大的性

5、質(zhì)進(jìn)行提取。2. 蘆丁的分離原理利用蘆丁結(jié)構(gòu)在冷乙醇中溶解度小，在熱乙醇中溶解度大，以及在熱水中溶解度大，在冷水中溶解度小，蘆丁用溶劑加熱溶解后，趁熱抽濾，濾液放冷后就能析出而達(dá)到分離的目的（如不純可再重復(fù)操作進(jìn)行分離） 。也可采用醇 - 水法進(jìn)行精制。3. 蘆丁的鑒定原理（ 1 ）利用吸附薄層色譜的分離原理，蘆丁與蘆丁對照品在同一條件下進(jìn)行展開，顯色，以達(dá)到鑒定蘆丁的目的。（ 2 ）通過專屬的化學(xué)顯色反應(yīng)，確定蘆丁的成分類型（黃酮類）。( 三)實驗內(nèi)容1. 用酸堿法、水提法、醇提法提取槐米中蘆丁。2. 在酸性條件下加熱回流水解蘆丁，制備槲皮素。3. 溶劑重結(jié)晶純化蘆丁和槲皮素。4. 薄層色譜

6、法和顯色反應(yīng)鑒定蘆丁和槲皮素( 四 )實驗藥材儀器與試劑1. 實驗藥材槐米 20g 。2. 儀器： 500ml 燒杯， 1000ml 燒杯， 250ml 園底燒瓶、 100ml 量筒、 50ml 量筒、 100ml 錐形瓶、 50ml錐形瓶、研缽、減壓過濾裝置，布氏漏斗，層析缸等。3. 試劑：硼砂、氧化鈣、 HCI 、 H2SO4、三氯化鋁、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、甲酸、濾紙等。（五）實驗方法與注意事項1. 蘆丁的提?。?1）方法一（堿溶酸沉法）稱取槐米粗粉20g ，在研缽中研碎后放入500ml燒瓶中，加0.4% 硼砂水溶液 200ml，用加熱磁力攪拌器加熱微沸后，加石灰乳（ 1.5g氧化鈣加

7、入10ml水研成乳液）調(diào) PH89 ，一邊加一邊攪拌，加熱微沸30min ，補充失去的水分，并保持溶液PH89，靜置約5 分鐘過濾（或趁熱抽濾），藥渣（第二次提?。┰儆?.4%硼砂水溶液200ml 煮沸半小時（此時不需加石灰乳），隨時加水補充失去的水分，合并兩次濾液（總體積約400ml ），放冷（6070 ），小心滴加濃鹽酸，同時快速攪拌調(diào)制溶液 PH4，室溫放置或在冰箱中放置（過夜），沉淀，待全部沉淀物析出后，減壓抽濾，用少量蒸餾水（約 10ml ）洗滌蘆丁粗品，抽干，室溫下晾干，得粗制蘆丁，稱重，計算得率。（ 2）方法二（水提取法）稱取槐米粗粉20g，在研缽中研碎后放入500ml燒瓶中，加

8、沸水200ml，用加熱磁力攪拌器加熱煮沸30min，趁熱抽濾。殘渣同法操作一次，合并兩次濾液，放置冰箱中析晶，2-待全部析出后，減壓抽濾，用少量蒸餾水洗滌蘆丁結(jié)晶，抽干，得粗制蘆丁，干燥，稱重，計算得率。（ 3 ）方法三（醇提取法）取槐米 20g ，置于 250ml 圓底燒瓶中，加乙醇 150ml 加熱回流 1 小時，趁熱抽濾。濾渣再加乙醇 150ml 回流 1 小時，合并乙醇提取液，放冷，析出絮狀沉淀，過濾，濾液濃縮至約 50ml ，放置過夜，濾液析出結(jié)晶。母液繼續(xù)濃縮一半，放置又析出結(jié)晶，合并結(jié)晶。用乙醚3050ml分次洗去脂溶性成分（油脂、葉綠素等），再用丙酮10ml洗滌一次，稱重，計算

9、得率。2.蘆丁的精制（ 1 ）方法一（醇- 水重結(jié)晶法）取粗制蘆丁2g，置于 250ml園底燒瓶中，加乙醇60ml 加熱回流15分鐘，趁熱抽濾。濾液置250ml 燒杯中，向濾液中加蒸餾水（約34 倍量）至溶液呈明顯混濁，室溫放置，抽濾得精致蘆丁。用少量蒸餾水洗滌蘆丁結(jié)晶，晾干，稱重。（ 2）方法二（水重結(jié)晶法）取粗制蘆丁 2g ，加入蒸餾水 400ml ，加熱回流至蘆丁全部溶解，趁熱立即抽濾，冷卻后即可析出結(jié)晶，抽濾，得蘆丁精制品，晾干，稱重。（ 3 ）方法三（乙醇重結(jié)晶法）取粗制蘆丁2g 于 100ml錐形瓶中，加乙醇60ml加熱溶解，乘熱抽濾，將濾液濃縮至約 30ml ，放置，析出結(jié)晶，母

10、液再濃縮一半，又析出結(jié)晶，合并結(jié)晶，再用乙醇重結(jié)晶一次，濾取精制的蘆丁結(jié)晶，晾干，稱重。3. 蘆丁的水解取蘆丁1g ，置于 250ml燒瓶中，加 2%H2SO480ml，小火加熱微沸回流40min ，開始加熱 10min 為澄清溶液，逐漸析出黃色小針狀結(jié)晶，即槲皮素。放置冷卻，靜置30 分鐘，待固體完全析出，抽濾取結(jié)晶。加50% 乙醇（按 1g 蘆丁用60ml量）加熱回流使槲皮素粗晶溶解（方法一）；加 50%乙醇（按1g蘆丁用 90ml量）加熱回流使槲皮素粗晶溶解（方法二）；加95%乙醇（按 1g蘆丁用 10ml量）加熱溶解（方法三）。趁熱抽濾，放置，析晶，抽濾得精制品，在減壓下110干燥可得

11、槲皮素?zé)o水物。4. 鑒定（ 1）點滴顯色反應(yīng)取蘆丁和槲皮素的甲醇溶液（供試液）分別點在濾紙上，揮去溶劑，然后分別加下列試劑，觀察顯色前后顏色及熒光的變化。供試液：蘆丁、槲皮素的甲醇溶液。顯色劑：2%三氯化鋁乙醇溶液 在紫外燈下 365nm 觀察顯色前后顏色及熒光的變化（ 2 ） 薄層色譜鑒定吸附劑：硅膠 GF254 薄層板（ 5.0cm X 10.0cm）。樣 品：自制蘆丁、槲皮素（用甲醇溶解，濃度約1mg/ml）對照品：蘆丁、槲皮素對照品的甲醇溶液。展開劑：三氯甲烷 - 甲醇 - 甲酸（ 7 2.5 0.5）顯 色： a.先在可見光下觀察，然后在紫外光下觀察（365nm 紫外燈下觀察）b.噴三氯化鋁試劑前后觀察顏色變化（365nm 紫外燈下觀察）實驗結(jié)果記錄：觀察斑點顏色，記錄圖譜并計算Rf 值。5 . 注意事項(1) 硼砂因能與蘆丁中的鄰二酚羥基結(jié)合，起保護(hù)鄰二酚羥基，不被氧化破壞的作用。實驗證明，提取時加入硼砂，產(chǎn)品的質(zhì)量會好些。(2) 石灰乳既能達(dá)到堿溶解提取蘆丁的目的，還可