第1講基因工程概論

1、生物技術(shù)核心課程Principles of Genetic Engineering基 因 工 程 原 理生命學(xué)院遺傳與基因工程教研室 余麗蕓 教授博士教學(xué)目的與要求教學(xué)目的與要求 n基因工程學(xué)自20世紀70年代初期誕生以來，在短短的30多年間已經(jīng)取得了許多令世人矚目的成就，成為當代生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最具生命力、最引人關(guān)注的前沿學(xué)科之一，是現(xiàn)代分子生物學(xué)與生物技術(shù)的核心內(nèi)容。n本課程充分考慮到我院學(xué)生知識結(jié)構(gòu)的特點，著重加強有關(guān)基因工程原理部分的講授，并努力將基因工程學(xué)同分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)以及生物化學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科有機地聯(lián)系起來進行討論。在內(nèi)容安排上，強調(diào)基礎(chǔ)性、先進性、系統(tǒng)性和實用性，同時也努

2、力反映國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的最新研究成果。 教學(xué)目的與要求教學(xué)目的與要求 n本課程為分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細胞生物學(xué)、生物化學(xué)等有關(guān)專業(yè) 學(xué)生的學(xué)科基礎(chǔ)課，同時也是植物學(xué)、動物學(xué)以及微生物學(xué)等專業(yè)學(xué)生的重點選修課。我們期望不同專業(yè)的學(xué)生在修完本課程之后，能夠較為系統(tǒng)、全面地掌握基因工程的基礎(chǔ)知識和最新進展，并能跟上該專業(yè)學(xué)科的發(fā)展進程。 教學(xué)目的與要求教學(xué)目的與要求 n學(xué)時/學(xué)分：70/3.5n上課方式：講解為主，討論為輔n考試時間：待定n考試方式：閉卷+ 實驗課面試n勤于思考，勇于發(fā)言nParticipate and Enjoy it!教材與參考書教材與參考書 n吳乃虎，基因工程原理

3、(第二版，上冊)，科學(xué)出版社，1998n吳乃虎，基因工程原理(第二版，下冊)，科學(xué)出版社，2001n樓士林等，基因工程(第一版)，科學(xué)出版社，2002n吳乃虎、張方、黃美娟，基因工程術(shù)語，科學(xué)出版社，2005nGENE VII或VIIIn分子克隆實驗指南(第三版)基因工程原理綱要第一講 基因工程概論第二講 基因工程的主要技術(shù)第三講 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)第四講 基因克隆的載體與受體第五講 目的基因的克隆與分離第六講 克隆基因的檢測與功能鑒定第七講 克隆基因的表達與產(chǎn)物純化第八講 基因表達的調(diào)控第一講 基因工程概論1、現(xiàn)代生物技術(shù)重塑自然生命2、基因研究的發(fā)展3、基因的現(xiàn)代概念4、基因工程的誕生與發(fā)

4、展5、基因工程的應(yīng)用6、基因工程的安全性 現(xiàn)代生物技術(shù)從傳統(tǒng)的生物技術(shù) 到現(xiàn)代生物技術(shù)基 因 工 程細 胞 工 程現(xiàn)代生物技術(shù)的人文憂患基因工程發(fā)展的過程 基因工程的本質(zhì)特征基因工程在農(nóng)業(yè)醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用細胞工程的主要內(nèi)容克隆技術(shù)現(xiàn)代生物技術(shù)會打破生物物種間的平衡嗎？ 對轉(zhuǎn)基因食物的擔憂 我們是否要接納克隆人？ 1 1、現(xiàn)代生物技術(shù)重塑自然生命生物技術(shù)發(fā)展歷程 n第一代生物工程技術(shù)(19世紀20世紀30年代)n很早人們就掌握了釀酒、制造醬油、奶酪、醋、面包等發(fā)酵技術(shù)，其實這些都是生物工程產(chǎn)品。n直至十九世紀，微生物的發(fā)現(xiàn)證明了從糧食到酒精是由活的酵母菌引起，其他發(fā)酵產(chǎn)物也是由不同的微生物作用

5、而形成，隨后科學(xué)家又發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵過程中的高效催化劑酶，從此揭開了發(fā)酵的奧秘，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)得以開始。 生物技術(shù)發(fā)展歷程 n第二代生物工程技術(shù)(20世紀40年代60年代)n以獲取微生物的代謝產(chǎn)物抗生素為目的的抗生素工業(yè)為這一時期生物工程產(chǎn)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)。n1928年英國的Fleming爵士在對細菌的研究中發(fā)現(xiàn)一種青色霉菌能殺死長在培養(yǎng)皿中的金黃色葡萄球菌，隨后他又發(fā)現(xiàn)這種青霉菌的培養(yǎng)湯也能殺死葡萄球菌，于是他推斷是青霉菌的代謝產(chǎn)物中含有殺菌物質(zhì)，他稱之為青霉素。1943年英美科學(xué)家聯(lián)合開發(fā)出大規(guī)模從青霉中提取青霉素的工藝，從此開始了大規(guī)?？股氐纳a(chǎn)，拯救了無數(shù)人的生命。 生物技術(shù)發(fā)展歷程 n第三代

6、生物工程技術(shù)(20世紀70年代起)n1953年遺傳物質(zhì)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的提出和1972年DNA重組技術(shù)的誕生，開辟了分子生物學(xué)和現(xiàn)代生物技術(shù)的新紀元。n基因的發(fā)現(xiàn)使科學(xué)家們不再滿足于利用現(xiàn)有的生物來為人類服務(wù)，而基因重組技術(shù)的問世使通過改造生物基因創(chuàng)造有新的遺傳特性的生物成為可能，從而使以往的生物工程實現(xiàn)了向代表二十一世紀發(fā)展方向的現(xiàn)代生物工程的飛躍。 現(xiàn)代生物技術(shù)的含義生物工程也叫生物技術(shù)，就是以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他自然科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體，或利用微生物、動物體、植物體或其組成部分（包括器官、組織、細胞等）作為反應(yīng)器對原料進行加工，為人類生產(chǎn)出

7、所需要的產(chǎn)品或達到某種目的的技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)的目的n對生物體進行改造，培育出具有優(yōu)良品質(zhì)的動物、植物、微生物新品系。n利用微生物、動物、植物為反應(yīng)器對原料進行加工，生產(chǎn)出人類所需要的產(chǎn)品。n進行疾病的防治、診斷和治療。n環(huán)境污染的檢測?，F(xiàn)代與傳統(tǒng)生物技術(shù)的區(qū)別n現(xiàn)代生物技術(shù)通過操作基因來改變自然生命物質(zhì)的原有結(jié)構(gòu)和成分。顯然，現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)生物技術(shù)已經(jīng)有了區(qū)別，即它不再是在原有物種水平上和沿襲自然的途徑，而是超越物種的界限，實現(xiàn)的是創(chuàng)造嶄新的品種和有目的的改造和控制自然界已有的生化過程?，F(xiàn)代生物技術(shù)研究的主要內(nèi)容主要由以下5個分支組成：n基因工程(核心所在)n蛋白質(zhì)工程(第二代基因工程)

8、n酶工程n發(fā)酵工程n細胞工程蛋白質(zhì)工程n也稱“第二代基因工程”，其主要內(nèi)容和基本目的可以概括為：以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系為基礎(chǔ)，通過有控制的基因修飾和基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造，設(shè)計、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比自然界存在的蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的新型蛋白質(zhì)。 酶工程n酶工程即利用酶的催化作用，在特定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。發(fā)酵工程n發(fā)酵工程也叫微生物工程，是指利用微生物的特定性狀，在生物反應(yīng)器中生產(chǎn)有用物質(zhì)的技術(shù)。n當前的醫(yī)用抗生素、農(nóng)用抗生素等已

9、有數(shù)百種，絕大部分是發(fā)酵的產(chǎn)品。除抗生素外，發(fā)酵工程產(chǎn)品還包括氨基酸、工業(yè)用酶等。人們?nèi)粘Ｉ钪袕V泛使用的味精、維生素等都是發(fā)酵工程的產(chǎn)品。細胞工程n細胞工程是利用細胞的全能性，在體外條件下，采用組織與細胞培養(yǎng)技術(shù)對動、植物進行修飾，從而改良和創(chuàng)造新品種，生產(chǎn)人類所需要的新的生物類型。 n細胞工程主要包括動植物細胞的組織培養(yǎng)技術(shù)、細胞融合技術(shù)、細胞核移植、細胞器攝取和染色體片段重組技術(shù)等。細胞工程n細胞融合技術(shù)是指兩個不同種類的細胞，加上融合劑，在一定條件下，彼此融合成雜交細胞，使來自兩個親本細胞的基因有可能都被表達，從而打破了遠緣生物不能雜交的屏障，提供了創(chuàng)造新物種的可能。n細胞器攝取主要是

10、指葉綠體和線粒體的攝取。如用白化型原生質(zhì)體攝取正常的葉綠體，進而發(fā)育成正常的綠色植物；用抗藥型草履蟲的線粒體植入其他草履蟲細胞，使后者獲得抗藥性。細胞工程n染色體片段重組是利用染色體替換來改變生物遺傳特性，如利用染色體的易位、缺體等方法，獲得新的染色體組合。n細胞核移植對動物優(yōu)良雜交種的無性繁殖具有重要的意義。它的典型應(yīng)用就是用于動物無性繁殖的“克隆”。克隆技術(shù)n克隆也就是細胞核移植，即將一個細胞中的核經(jīng)顯微手術(shù)和細胞融合的方法移植到去核的另一個細胞中，重組胚胎發(fā)育至產(chǎn)仔的過程。n廣義的說法就是動物不經(jīng)過受精作用而獲得新個體的方法，即無性繁殖。無性繁殖的英文名稱叫“Clone”，譯音為“克隆”

11、。在技術(shù)上，科學(xué)家的“克隆試驗經(jīng)歷了從兩棲動物的核移植到高等動物的核移植；從胚胎細胞核移植到體細胞的核移植的過程”。第一講 基因工程概論1、現(xiàn)代生物技術(shù)重塑自然生命2、基因研究的發(fā)展3、基因的現(xiàn)代概念4、基因工程的誕生與發(fā)展5、基因工程的應(yīng)用6、基因工程的安全性2、基因研究的發(fā)展基因工程或稱基因操作，是在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等學(xué)科綜合發(fā)展的基礎(chǔ)上，于上世紀70年代誕生的一門嶄新的生物技術(shù)科學(xué)。其創(chuàng)立與發(fā)展，直接依賴于基因分子生物學(xué)的進步?？梢哉f，基因的研究為基因工程的創(chuàng)立奠定了堅實的理論基礎(chǔ)，而基因工程技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，又深刻有力地影響著基因的研究，使我們對基因本質(zhì)的認識提高到了空前的高度。

12、2、基因研究的發(fā)展20世紀以來，基因研究一直是影響整個遺傳學(xué)發(fā)展的主線。根據(jù)不同歷史時期的水平和特點，可分3階段：20世紀50年代前：基因的染色體遺傳學(xué)階段，主要從細胞染色體水平上進行研究；20世紀50年代70年代：基因的分子生物學(xué)階段，主要從DNA大分子水平上進行研究；20世紀80年代以來：重組DNA技術(shù)不斷完善，人們能夠直接從克隆目的基因出發(fā)，研究基因的功能及其與表型間的關(guān)系，使基因研究進入了反向生物學(xué)階段。2、基因研究的發(fā)展（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立（2）基因與DNA分子（3）基因與多肽鏈（4）基因的結(jié)構(gòu)（5）基因的表達與調(diào)控（6）基因的分離（7）基因的合成（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立n基因的最基本性

13、質(zhì)是在一個多世紀前由孟德爾(G. Mendel)定義的。由他提出的兩大定律分離律與獨立分配律可總結(jié)出：A、基因是一種由親代傳到子代的特殊因子遺傳因子(hereditary factor)；B、基因可能存在變異的形式。(1857-1864，豌豆雜交)G. J. MendelMendel臨終前說；Gregor Mendel 1822-1884 等著瞧吧， 我的時代總有一天會來臨 （1）基因?qū)W說的創(chuàng)立n35年的湮沒。1900年荷蘭H. De Vries、德國C. Correns和奧地利E. Tschermak等植物學(xué)家重新發(fā)現(xiàn)?！翱茖W(xué)論文文獻核查”的做法，為科學(xué)界所接受，一直沿用至今。Hugo de

14、 vires 1848-1935 荷蘭 阿姆斯特丹大學(xué) Erich von Tschermark 1871-1962 德國 土賓根大學(xué) Carl Correns 1864-1933 奧地利 維也納農(nóng)業(yè)大學(xué) （1）基因?qū)W說的創(chuàng)立同時發(fā)現(xiàn)并證實同時發(fā)現(xiàn)并證實 Mendel 的兩大規(guī)律的兩大規(guī)律 1900 Hugo de vires 1848-1935 荷蘭 阿姆斯特丹大學(xué) Erich von Tchermark 1871-1962 德國 土賓根大學(xué) Carl Correns 1864-1933 奧地利 維也納農(nóng)業(yè)大學(xué) Law of segregationLaw of segregation Law

15、 of independent assortmentLaw of independent assortment（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立n1909年，丹麥生物學(xué)家W. Johannsen根據(jù)希臘文“給予生命”之義，創(chuàng)造了基因(gene)一詞，替代了孟德爾的“遺傳因子”。遺傳性狀的符號，尚未具體涉及基因的物質(zhì)概念。n摩爾根(T. H. Morgan)學(xué)派對基因?qū)W說的建立作出了卓越的貢獻。他們通過果蠅突變體的研究第一次將代表某一特定性狀的基因同某一特定的染色體聯(lián)系了起來，創(chuàng)立了遺傳的染色體理論，使基因?qū)W說得到了普遍的承認。(1910-1915)2、基因研究的發(fā)展（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立（2）基因與DNA分子

16、（3）基因與多肽鏈（4）基因的結(jié)構(gòu)（5）基因的表達與調(diào)控（6）基因的分離（7）基因的合成（2）基因與DNA分子n在人們認識核酸的過程中，1928年發(fā)現(xiàn)的“轉(zhuǎn)化”現(xiàn)象具有重要作用。肺炎雙球菌能夠通過引起肺炎殺死老鼠。這種細菌的有毒物質(zhì)被認為是它的外殼多糖，是一種細菌表面的物質(zhì)，能夠避免細菌被宿主破壞掉。不同類型的肺炎雙球桿菌有不同的外殼多糖。但它們都有平滑的表面。n已死亡的病菌中的參與轉(zhuǎn)化的那一部分物質(zhì)稱之為轉(zhuǎn)化物。1944年Avery和他的同事們的實驗表明轉(zhuǎn)移物的化學(xué)組成實際上就是脫氧核糖核酸（DNA）。 n圖1.1 轉(zhuǎn)化過程的核心是DNAn這個結(jié)果說明了原核生物的遺傳物質(zhì)是也是DNA，還為細

17、菌和高等生物的遺傳提供了一種獨特的觀點。n原文對圖1.1的結(jié)果是這樣分析的：這種引入的物質(zhì)，就它的化學(xué)和物理性質(zhì)而言，看起來是高度聚合且有粘性的DNA。另一方面，III 型外殼多糖的合成是由可轉(zhuǎn)移的物質(zhì)激發(fā)的，它是由不含氮的多糖組成。因此我們認為，引入的物質(zhì)以及反過來產(chǎn)生的產(chǎn)物在化學(xué)上是不同的，在功能上有生物特異性，兩者對于決定它們所在細胞的特異性是必須的。n這個討論描述了遺傳物質(zhì)及表達產(chǎn)物之間的區(qū)別，為后來的研究奠定了重要的理論基礎(chǔ)。n當可轉(zhuǎn)移分子被發(fā)現(xiàn)由DNA組成之后，下一步需要證明的就是DNA可在一個完全不同的體系中提供遺傳物質(zhì)。n1952 年，Hershey和Chase用放射性標記T2

18、噬菌體感染細菌 (32P 標記DNA，35S標記蛋白質(zhì)) 的實驗進一步說明了不管是在細胞基因組中還是病毒中，遺傳物質(zhì)就是DNA這一結(jié)論。n圖 1.2 說明了這個試驗的結(jié)果。n圖 1.2 T2 噬菌體的遺傳物質(zhì)被證明是DNA(搗碎實驗)。n本實驗直接表明父 代 噬 菌 體 的DNA進入到細菌中，變成了子代噬菌體的一部分，恰好符合是遺傳物質(zhì)的遺傳特性。（2）基因與DNA分子n證明了DNA是遺傳物質(zhì)和基因的載體之后，遺傳學(xué)家和分子生物學(xué)家進而著手研究維系生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)DNA分子的自我復(fù)制過程，以揭示遺傳信息是怎樣從親代準確地傳遞到子代的本質(zhì)。n這個問題是在1953年J. Watson和F. Cric

19、k創(chuàng)立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型之后才逐步得到解決的。（2）基因與DNA分子nDNA雙螺旋模型的提出基于以下三個方面的發(fā)現(xiàn)：X光衍射實驗數(shù)據(jù)表明DNA是一種規(guī)則螺旋結(jié)構(gòu)：每3.4nm旋轉(zhuǎn)一周，直徑約為2nm。因為相鄰核苷酸距離為0.34nm，因此每圈有10個核苷酸單位。DNA密度測量說明這種螺旋結(jié)構(gòu)應(yīng)有兩條鏈。而且如果兩條鏈間的堿基都是朝里而且嚴格的按嘌呤對嘧啶排列，那么就可以阻止嘌呤對嘌呤(太粗)，嘧啶對嘧啶(太細)的形成。不論堿基數(shù)目多少，G的含量總是與C一樣，而A與T也是一樣。因此通常以G+C的含量來描述DNA的組成。不同物種G+C的含量一般在2674%。 n圖 1.3 多核糖鍵是由一系列53

20、糖-磷酸鍵作為主鏈和含有堿基突出組成的。n圖 1.4 由于嘌呤堿基總是與嘧啶堿基配對，因此雙螺旋的寬度是恒定的，圖中序列為T-A、C-G、A-T、G-C。n兩條核苷酸鏈反向平行平行。沿著螺旋旋轉(zhuǎn)方向，一條是5-3方向，而另一條是3-5方向。 n圖 1.5 DNA的雙鏈構(gòu)成雙螺旋n每個堿基相對于其相鄰的堿基對都繞螺旋軸旋轉(zhuǎn)約36度。這樣約10個堿基對就能旋轉(zhuǎn)一周。雙螺旋體中的兩條鏈彼此環(huán)繞形成一條窄溝窄溝(約12nm)和一條寬溝寬溝(約22nm)，這兩條溝在電鏡下形狀見圖圖1.5。雙鏈是沿右手右手方向的；即順時針方向轉(zhuǎn)動。所有這些都是B-DNA所具有的特征 n圖 1.6 堿基配對是DNA復(fù)制原理

21、的基礎(chǔ)。n圖上部是一對父本鏈，下部是通過堿基對互補產(chǎn)生的子代鏈。未復(fù)制的親本雙鏈由兩條原始的親本鏈組成。復(fù)制要求兩條鏈分開，從而為互補提供模板。每一個子代雙鏈與原始親本的序列相同，并且包括一條親本鏈和一條新合成的鏈。如此DNA的結(jié)構(gòu)使得它的序列能穩(wěn)定的遺傳。 n圖 1.7 DNA 的復(fù)制是以半保留方式進行的。n親本雙螺旋復(fù)制形成兩個子代雙螺旋，每一個攜帶一條親本鏈和新合成的子代鏈，這種組合在代與代之間非常保守，兩條鏈之中總是有一條親本鏈。這種復(fù)制方式 稱 為 半 保 留 復(fù) 制(Semiconservative replication)。n不管是雜合雙體還是純合雙體，其中任何一條鏈要么是含重原

22、子的要么是含輕原子的。1958年的Meselson-Stahl實驗證實了這一觀點，在這個實驗中觀察了三代酵母菌的DNA復(fù)制。從細胞中提取出DNA，離心測量其密度，則DNA按密度分成三帶：最重的是母體，雜合體是第一代，第二代中一半是雜合體一半是純合雙體。(圖 1.7)n圖 1.8 復(fù)制叉是指從未解旋的母鏈向新復(fù)制的子鏈過度的區(qū)域。nDNA 分子在復(fù)制過程中，非復(fù)制區(qū)保持著親本雙鏈結(jié)構(gòu)，復(fù)制區(qū)分開，從此處形成兩個代雙鏈(圖1.8)。這兩個相接區(qū)域稱為復(fù)制叉，此處雙螺旋的結(jié)構(gòu)被破壞。復(fù)制涉及到復(fù)制叉沿著親本雙鏈移動，因此存在親本雙鏈連續(xù)解螺旋以及重新螺旋形成子代雙鏈。 （2）基因與DNA分子nDNA

23、分子是基因的載體，是否每一段DNA都是基因呢？n經(jīng)典的基因概念：在染色體或DNA分子上，基因都是成串珠似的一個挨一個排列，它們之間由非遺傳的物質(zhì)連接起來。交換只是在基因之間進行，而不在基因內(nèi)部發(fā)生。基因既是遺傳的功能單位，也是交換單位和突變單位。n以T4噬菌體為材料的研究工作表明，事實并非如此。 （2）基因與DNA分子n1955年，S. Benzer正式使用“順反子”(cistron)這個術(shù)語，將T4噬菌體導(dǎo)致寄主快速溶菌的rII區(qū)的兩個亞區(qū)分別稱為rIIA順反子和rIIB順反子(即rIIA基因和rIIB基因)。n每一個順反子就是一段核苷酸序列，或曰相當于一個基因的DNA或RNA單元，它編碼一

24、種完整的多肽鏈。這種多肽鏈既可以是一種具有生物活性的蛋白質(zhì)，也可以同別的多肽聚合形成多功能的蛋白質(zhì)。（2）基因與DNA分子n順反子是功能單位，由許多可以突變的位點組成。這些位點之間又可以發(fā)生交換。n據(jù)Benzer計算，在功能DNA中，最小交換單位約為13個核苷酸對，這同理論上的最低值一個核苷酸對極為接近。所以，順反子中的最小交換單位(又稱交換子)和最小突變單位(又稱突變子)，都應(yīng)是DNA分子中的一個核苷酸對。也只有在這種情況下，交換子才等于突變子。（2）基因與DNA分子n一般說來，一個順反子即是一個基因，大約含有1500個核苷酸對，是由一群突變單位和重組單位組成的線性結(jié)構(gòu)。n順反子的概念表明：

25、基因不是最小單位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是基因，而只有其中某一特定的多核苷酸區(qū)段才是基因的編碼區(qū)。n由于所有生物的DNA的基本結(jié)構(gòu)都是一致的，因此，來自兩種生命形態(tài)的基因(DNA)可以融為一體，這是進行基因工程的重要理論基礎(chǔ)之一。2、基因研究的發(fā)展（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立（2）基因與DNA分子（3）基因與多肽鏈（4）基因的結(jié)構(gòu)（5）基因的表達與調(diào)控（6）基因的分離（7）基因的合成（3）基因與多肽鏈n基因是細胞中所有的RNA及蛋白質(zhì)分子的“藍圖”。n20世紀40年代，G. W. Beadle和E. L. Tatum提出“一種基因一種酶”假說(“one-gene-one-enzyme

26、hypothesis”)。(X-射線誘導(dǎo)紅色面包霉，營養(yǎng)缺陷突變體，1941年)n1957年，英國劍橋V. M. Ingram在對鐮形細胞貧血癥的血紅蛋白和正常血紅蛋白的氨基酸序列作了對比研究之后，才第一次用實驗證實了基因同蛋白質(zhì)之間的直接聯(lián)系。(GluVal)表明基因的突變會直接影響到它編碼的蛋白質(zhì)多肽鏈成份的改變。n多體蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。假說修正為“一種基因一種多肽鏈”?；虻膲A基順序與蛋白質(zhì)的氨基酸順序?qū)?yīng)關(guān)系？n1958年，F(xiàn). Crick在綜合分析了50年代末期有關(guān)遺傳信息流轉(zhuǎn)向的各種資料的基礎(chǔ)上，提出了描述DNA、RNA和蛋白質(zhì)三者關(guān)系的中心法則(central dogma) ；n19

27、70年，D. Baltimore和H. M. Temin在一些RNA腫瘤病毒中，發(fā)現(xiàn)了一種依賴RNA的DNA多聚酶逆轉(zhuǎn)錄酶。n1971年，F(xiàn). Crick根據(jù)新的進展修改了中心法則：RNADogmaCentralDNAProtein轉(zhuǎn) 錄翻 譯TranscriptionTranslationReplication復(fù) 制逆轉(zhuǎn)錄ReverseTranscription?在生命的初始階段，中心法則是：?RNA自我復(fù)制并翻譯（生產(chǎn)）蛋白質(zhì)RNA只由四種核苷組成，有的結(jié)構(gòu)非常簡單，把核苷鏈片段放在一起就可能組成有自我復(fù)制能力的RNA，這已經(jīng)被實驗證明。但是有一個困難：RNA的自我復(fù)制和翻譯蛋白質(zhì)這兩個過

28、程都需要酶的催化，而酶是一種蛋白質(zhì)。究竟是先有RNA還是先有蛋白質(zhì)呢？1981年，美國生物學(xué)家切赫(T. Cech)等發(fā)現(xiàn)四膜蟲26S rRNA前體的自我剪接作用，隨后又證明前體中的居間序列(intervening sequence，IVS)有五種酶的活力。幾乎在同時，Altman從純化的RNase P中，證明催化tRNA前體成熟的催化劑是RNase P中的RNA。以后又發(fā)現(xiàn)RNA自己不需要蛋白質(zhì)的幫助，就可以用氨基酸合成肽鏈。切赫(T.R.Cech) (1947-) 1989年的諾貝爾化學(xué)獎授予了美國耶魯大學(xué)的悉尼奧爾特曼與科羅拉多大學(xué)的托馬斯切赫 nmRNA分子上從5至3方向，由AUG開始

29、，每三個相鄰的核苷酸為一組，在蛋白質(zhì)合成中代表某種氨基酸或其他信息，稱為密碼子或三聯(lián)體密碼(Triplet Code)，統(tǒng)稱為遺傳密碼（genetic codon)。n反密碼子： 轉(zhuǎn)運RNA能與信使RNA的堿基相互配對的三個相鄰堿基。（3）基因與多肽鏈（遺傳密碼）n密碼比(coding ratio)問題n密碼是否同疊？n三聯(lián)體之間是否存在“逗號”？n三聯(lián)密碼子編碼的破譯（3）基因與多肽鏈（遺傳密碼）n1954年，物理學(xué)家George Gamov根據(jù)在DNA中存在4種核苷酸，在蛋白質(zhì)中存在20種氨基酸的對應(yīng)關(guān)系，做出數(shù)學(xué)推理，認為只有43=64這種關(guān)系是理想的。 n1961年，Brenner和C

30、rick根據(jù)DNA鏈與蛋白質(zhì)鏈的共線性(colinearity)，首先肯定了3個核苷酸的推理。隨后的遺傳學(xué)實驗證實，是由3個堿基編碼一種氨基酸，人們稱這種堿基三聯(lián)體為密碼子(codon)。（3）基因與多肽鏈（遺傳密碼）在1962年，用大腸桿菌提取液進行體外合成試驗，加入細菌病毒f2的RNA，結(jié)果合成了一個與天然的f2外殼蛋白完全相同的蛋白質(zhì)，其氨基酸順序完全一樣。這便證明在體外條件下，可 以 準 確 地 按 照mRNA的遺傳信息合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。 1) 在體外無細胞蛋白質(zhì)合成體系中加入人工合成的poly 開創(chuàng)了破譯遺傳密碼的先河。 1961年發(fā)現(xiàn)mRNA后，美國NIH的Nirenberg和Ma

31、thaei合成了polyU作為模板，以觀察無細胞系統(tǒng)中蛋白質(zhì)合成速率。當把翻譯產(chǎn)物分離、純化和做序列分析后，結(jié)果出乎意料，合成的肽鏈中的氨基酸殘基全部是苯丙氨酸，即polyPhe。于是第一次確認了UUU是Phe的密碼子。這樣，就在一個偶然的機會開創(chuàng)了破譯密碼的工作。 生物化學(xué)方法破譯遺傳密碼2) 以兩種不同比例的核苷酸混合物合成不均一的多聚核苷酸來推測密碼子的核苷酸組成。1963年，Speyer和Ochoa等發(fā)展了用兩個堿基的共聚物破譯密碼的方法。例如，以A和C原料，合成polyAC。polyAC含有8種不同的密碼子:CCC、CCA、CAA、AAA、AAC、ACC、ACA和CAC。各種密碼子占

32、的比例隨著A和C的不同而不同，例如當A和C的比例等于5 : 1時，AAA : AAC的比例=555 : 551=125 : 25。實驗顯示AC共聚物作模板翻譯出的肽鏈由六種氨基酸組成Asp，His，Thr，Pro，Glu和Lys，其中Pro和Lys的密碼子早先已證明分別是CCC和AAA。2) 以兩種不同比例的核苷酸混合物合成不均一的多聚核苷酸來推測密碼子的核苷酸組成(續(xù))。根據(jù)共聚物成份不同的比例和翻譯產(chǎn)物中氨基酸比例亦不同的關(guān)系，Speyer等確定了Asp、Glu和Thr的密碼子含2AlC; His的密碼子含1A2C; Thr的密碼子也可以含1A2C; Pro為3C或1A2C; Lys為3A

33、。但上述方法不能確定A和C的排列方式，而只能顯示密碼子中堿基組成及組成比例。Asp，Glu和Thr的2A1C可能有三種排列方式，即AAC、ACA、CAA。此外，通過反復(fù)改變共聚物成份比例的方法亦十分麻煩和費時。 3) 核糖體結(jié)合試驗破譯密碼子的核苷酸順序Nirenberg和Leder于1964年建立了破譯密碼的新方法，即tRNA與確定密碼子結(jié)合實驗：在缺乏蛋白質(zhì)合成所需因子的條件下，特異氨基酸-tRNA也能與核糖體-mRNA復(fù)合物結(jié)合。這種結(jié)合并不一定需要長的mRNA分子，三核苷酸就可。例如，當polyU與核糖體混合時，僅有Phe-tRNA與之結(jié)合；相應(yīng)地Pro-tRNA特異地與polyC結(jié)合

34、。還有GUU可促進Val-tRNA結(jié)合，UUG促進Leu-tRNA結(jié)合等。雖然所有64個三核苷酸(密碼子)都可按設(shè)想的序列合成，但并不是全部密碼子均能以這種方法決定，因為有一些三核苷酸序列與核糖體結(jié)合并不象UUU或GUU等那樣有效，以致不能確定它們是否能為特異的氨基酸編碼。圖1.9 核糖體結(jié)合實驗人工合成的三核苷酸與對應(yīng)的氨酰-tRNA分子及核糖體復(fù)合物可以保留在硝酸纖維膜上。4) 用重復(fù)共聚物(repeating copolymers)破譯密碼 1966年，H. G. Khorana等發(fā)明了利用重復(fù)的共聚體，例如GUGGUG，AAGAAG，來破譯密碼子的途徑，并因此發(fā)現(xiàn)了3個終止密碼子：UA

35、A，UAG，UGA。蛋白質(zhì)在核糖體上的合成可以在這些有規(guī)律的共聚物的任一點開始，并把特異的氨基酸摻入肽鏈。由Poly(GUA)或Poly(GAU)只獲得兩種均聚肽。UAG和UGA為終止密碼子1966年，尼倫伯格(Nirenberg)和科拉納(Khorana)等人完成了對全部遺傳密碼的破譯，2人共同獲得1968年的諾貝爾獎。 密碼表遺傳密碼(genetic codon)的特點l 連續(xù)性l 簡并性l 擺動性l 通用性l 不重疊遺傳密碼(genetic codon)的特點連續(xù)性 (commaless) mRNA分子的ORF中，組成遺傳密碼的 三聯(lián)體沒有間斷，須3個一組連續(xù)讀下去，直至出現(xiàn)終止密碼子為

36、止。mRNA鏈上堿基的插入或缺失，就會改變密碼閱讀的順序，造成框移，使下游翻譯出的氨基酸完全改變，即移碼突變。遺傳密碼(genetic codon)的特點簡并性(degeneracy)一種氨基酸可有幾個意義相同的密碼子，即同義密碼子。除Trp、Met外，其余氨基酸均有24個最多達6個密碼子。同義密碼子之間，前兩個堿基均相同，只是第三個堿基不同。若頭兩個堿基發(fā)生點突變，可譯出不同氨基酸，而第三個堿基的突變，不會影響氨基酸的翻譯。遺傳密碼(genetic codon)的特點擺動性(wobble) 反密碼子和密碼子配對時，有時會出現(xiàn)不遵從堿基配對規(guī)律的情況，稱為遺傳密碼的擺動現(xiàn)象。這一現(xiàn)象常見于反密

37、碼子的第一位堿基與密碼子的第三位堿基之間。按照Wobble假說密碼子與反密碼子配對遺傳密碼(genetic codon)的特點通用性(universal)不同種屬的生物都使用同一套遺傳密碼。但近年發(fā)現(xiàn)線粒體和葉綠體使用的遺傳密碼稍有差別。如線粒體、葉綠體以AUG、AUU、AUA為起始密碼子，而AUA兼有Met密碼子功能。終止密碼子是AGA、AGG，Trp密碼子是UGA等。遺傳密碼(genetic codon)的特點不重疊 通常說來，密碼子是不重疊的，每個三聯(lián)體中的三個核苷酸只編碼一個氨基酸，核苷酸不重疊使用。 噬菌體x174中某些基因之間有重疊現(xiàn)象2、基因研究的發(fā)展（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立（2）基

38、因與DNA分子（3）基因與多肽鏈（4）基因的結(jié)構(gòu)（5）基因的表達與調(diào)控（6）基因的分離（7）基因的合成（4）基因的結(jié)構(gòu)n最早試圖揭示基因內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的研究工作是S. Benzer在20世紀50年代晚期進行的。1955年他發(fā)展出了一種應(yīng)用T4噬菌體rII區(qū)的不同等位基因繪制基因內(nèi)部圖譜(intragenic maps)的方法，為探索產(chǎn)生等位基因的分子機理提供了新的手段。n1967年C. Yanofsky等通過對E.coli色氨酸合成酶基因(trpA)的研究，首次將基因的精細結(jié)構(gòu)遺傳圖(genetic map)同物理圖(physical map)進行比較。（4）基因的結(jié)構(gòu)n只有到了70年代中期，隨

39、著基因克隆和DNA序列分析技術(shù)的相繼發(fā)展，人們才真正有可能從單堿基水平上剖析基因的分子結(jié)構(gòu)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNA聚酶聚酶結(jié)合位點結(jié)合位點RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。 原核基因的結(jié)構(gòu)能夠轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的信使RNA，進而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成，也就是說能夠編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域。 位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的DNA序列，雖不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)但有

40、調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，如啟動子、終止子等。非編碼區(qū)(調(diào)控序列)編碼區(qū)(編碼序列) 原核基因的結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與與RNA聚酶聚酶結(jié)合位點結(jié)合位點內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子，內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子 外顯子 真核基因的結(jié)構(gòu)原核細胞 真核細胞不同點相同點原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是連續(xù)的編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較：非編碼區(qū)與內(nèi)含子都是基因結(jié)構(gòu)中不能編碼蛋白質(zhì)

41、的序列,它們有哪些不同?內(nèi)含子能轉(zhuǎn)錄為信使RNA啟動子與起始密碼有何不同?啟動子是基因結(jié)構(gòu)中位于編碼區(qū)上游的核苷酸序列，是RNA聚合酶結(jié)合位點，能夠準確地識別轉(zhuǎn)錄的起始點并開始轉(zhuǎn)錄，有調(diào)控遺傳信息表達的作用。而起始密碼則是mRNA上的三個相鄰堿基。啟動子不止三個堿基。 外顯子與內(nèi)含子的角色是否固定不變?一般說，真核細胞結(jié)構(gòu)基因都是由外顯子和內(nèi)含子組成，但是，外顯子和內(nèi)含子的關(guān)系并不是完全固定不變的，有時同一條DNA鏈上的某一段DNA序列，當它作為編碼某多肽鏈的基因時是外顯子，而作為編碼另一多肽鏈的基因時，則是內(nèi)含子，結(jié)果是同一基因可以同時轉(zhuǎn)錄為兩種或兩種以上的mRNA。 終止子和終止密碼有何不

42、同?終止子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄終點，調(diào)控遺傳信息表達的DNA序列。它特殊的堿基排列順序能夠阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，從而使轉(zhuǎn)錄工作結(jié)束。終止密碼位于mRNA上，共有三種：UAA、UAG、UGA。2、基因研究的發(fā)展（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立（2）基因與DNA分子（3）基因與多肽鏈（4）基因的結(jié)構(gòu)（5）基因的表達與調(diào)控（6）基因的分離（7）基因的合成n 基 因 表 達( g e n e expression)：是遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄生mRNA再經(jīng)翻譯生成蛋白質(zhì)的過程。（5）基因的表達與調(diào)控n1961年，F(xiàn). Jacob和J. Monod提出大腸桿菌的乳糖操縱子模型。n操縱子(

43、operon)是一種完整的細菌基因表達單位，由若干個結(jié)構(gòu)基因、一個或數(shù)個調(diào)節(jié)基因及控制單元組成?？刂茊卧ㄒ粋€操縱基因和啟動區(qū)序列。n結(jié)構(gòu)基因(structural gene)：細胞中基本看家蛋白質(zhì)如代謝酶類、轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)和細胞骨架成份等的編碼基因。n調(diào)節(jié)基因(regulatory gene)：編碼用以控制其它基因表達的RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。n操縱基因(operator)：接受來自調(diào)節(jié)基因合成的調(diào)節(jié)蛋白的作用，使結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄活性得以控制的特定的DNA區(qū)段。（5）基因的表達與調(diào)控n1961年，F(xiàn). Jacob和J. Monod提出大腸桿菌的乳糖操縱子模型：（5）基因的表達與調(diào)控n操縱子概念指

44、出基因不但在結(jié)構(gòu)上是可分的，在功能上也是有分工的。（5）基因的表達與調(diào)控n1969年，R. J. Britten和E. H. Davidson提出一個假想的真核細胞的基因調(diào)控模型。根據(jù)這個模型，與調(diào)節(jié)基因相連的一段DNA叫做傳感基因(sensor gene)，細胞根據(jù)需要向它發(fā)出信號。這種信號可能是由細胞中的化學(xué)分子傳達，當其到達傳感基因后，調(diào)節(jié)基因就開始發(fā)生作用，制造出激體RNA (activator RNA)，并由它指示同結(jié)構(gòu)基因相鄰的受體基因(receptor gene)，令其發(fā)動結(jié)構(gòu)基因行使功能轉(zhuǎn)錄出mRNA，進而轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子。2、基因研究的發(fā)展（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立（2）基因

45、與DNA分子（3）基因與多肽鏈（4）基因的結(jié)構(gòu)（5）基因的表達與調(diào)控（6）基因的分離（7）基因的合成（6）基因的分離n據(jù)生物的表現(xiàn)型來研究基因型這種間接的研究法不能滿足科學(xué)發(fā)展的要求，有必要將基因分離出來，在試管中直接研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)節(jié)等一系列問題。n1969年，美國哈佛大學(xué)R. Beckwith等應(yīng)用DNA-DNA分子雜交技術(shù)，分離到了一種特殊的基因大腸桿菌乳糖操縱子的-半乳糖苷酶基因，首創(chuàng)了單基因分離的成功先例，激發(fā)了人們從不同角度、用不同方法分離基因的積極性，從而加速了基因研究工作的進展。2、基因研究的發(fā)展（1）基因?qū)W說的創(chuàng)立（2）基因與DNA分子（3）基因與多肽鏈（4）基因的結(jié)構(gòu)（

46、5）基因的表達與調(diào)控（6）基因的分離（7）基因的合成（7）基因的合成n1970年美國MIT的H. G. Khorana等首次報道了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸基因(77bp)全合成；1976年，大腸桿菌酪氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸基因(200bp)全合成。將之導(dǎo)入E. coli之后，表現(xiàn)出特有的生物活性，起到了基因的作用。n1977年，H. W. Boyer等將化學(xué)合成的人腦激素基因連接在乳糖操縱子上并導(dǎo)入大腸桿菌細胞，成功實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，產(chǎn)生出有生物活性的蛋白質(zhì)。這是第一個以DNA重組技術(shù)完成的基因工程。第一講 基因工程概論1、現(xiàn)代生物技術(shù)重塑自然生命2、基因研究的發(fā)展3、基因的現(xiàn)代概念4、基因工程的誕生與

47、發(fā)展5、基因工程的應(yīng)用6、基因工程的安全性3、基因的現(xiàn)代概念（1）移動基因（2）斷裂基因（3）假基因（4）重復(fù)序列及重復(fù)基因（6）重疊基因（1）移動基因n移動基因，又叫轉(zhuǎn)位因子。由于它可以從染色體基因組上的一個位置轉(zhuǎn)移另外一個位置，甚至在不同的染色體之間躍遷，因此在文獻上有時也形象地稱之為跳躍基因。 n移動基因最早是由美國冷泉港實驗室的女科學(xué)家B. McClintock，于本世紀40年代晚期在玉米中首次發(fā)現(xiàn)的。她因為本項發(fā)現(xiàn)，獲得了1983年的諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎。3、基因的現(xiàn)代概念（1）移動基因（2）斷裂基因（3）假基因（4）重復(fù)序列及重復(fù)基因（5）重疊基因（2）斷裂基因n過去人們一直認為，基因

48、的遺傳密碼子是連續(xù)不斷地并列在一起，形成一條沒有間隔的完整的基因?qū)嶓w。但以后通過對真核蛋白質(zhì)編碼基因結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，在它們的核苷酸序列中間插入有與氨基酸編碼無關(guān)的DNA間隔區(qū)，使一個基因分隔成不連續(xù)的若干區(qū)段。我們稱這種編碼序列不連續(xù)的間斷基因為斷裂基因(split gene)。有人認為斷裂基因是近二三十年來在生物學(xué)上最驚人的發(fā)現(xiàn)之一。斷裂基因最初是在腺病毒中發(fā)現(xiàn)的，1977年提出科學(xué)報告。3、基因的現(xiàn)代概念（1）移動基因（2）斷裂基因（3）假基因（4）重復(fù)序列及重復(fù)基因（5）重疊基因（3）假基因n1977年，GJacq等人根據(jù)對非洲爪蟾5S rRNA基因簇的研究，首次提出了假基因的概念。他們

49、的研究發(fā)現(xiàn)，這個5S rRNA基因，與一個基本上相同、但又不完全相同的5S rRNA基因的復(fù)本序列直接相鄰。由于在體內(nèi)從未檢出過這段5S rRNA基因復(fù)本序列的mRNA分子，說明它是沒有表達活性的。 因因此，此， Jacq等人特稱之為假基因(pseudogene)?，F(xiàn)已在大多數(shù)真核生物中發(fā)現(xiàn)了假基因，這是一種核苷酸序列同其相應(yīng)的正常功能基因基本相同、但卻不能合成出功能蛋白質(zhì)的失活基因。3、基因的現(xiàn)代概念（1）移動基因（2）斷裂基因（3）假基因（4）重復(fù)序列及重復(fù)基因（5）重疊基因（4）重復(fù)序列及重復(fù)基因n比較真核和原核的基因結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的真核生物(除單細胞的酵母以外)的基因組DNA中，

50、都具有重復(fù)序列(repeated sequence)。而且在有些例子中，重復(fù)序列的拷貝數(shù)可高達百萬份以上。在人DNA中，重復(fù)序列(至少具有20份拷貝)的DNA占總DNA的30%左右。n根據(jù)對多種生物DNA所作的詳細分析表明，在真核基因組存在有四種不同類型的DNA序列： （4）重復(fù)序列及重復(fù)基因 （1） 不重復(fù)的唯一序列（只有一個拷貝）； （2） 低度重復(fù)序列（10個拷貝）； （3） 中度重復(fù)序列（10到幾百個拷貝）； （4） 高度重復(fù)序列（幾百個到幾百萬個拷貝）。 當然，這種分類的界限是人為劃分的，所以在作這些類型的一般性概述時，要特別留心它的具體內(nèi)容。此外，由于通常研究的都是二倍體細胞，因此

51、一種不重復(fù)的唯一序列，實際上是存在著2個拷貝。 3、基因的現(xiàn)代概念（1）移動基因（2）斷裂基因（3）假基因（4）重復(fù)序列及重復(fù)基因（5）重疊基因（5）重疊基因n英國劍橋分子生物學(xué)家F. Sanger(1977)在分析了一種小的單鏈DNA噬菌體X174的全序列后，驚奇地發(fā)現(xiàn)在5386個核苷酸中組成了11個基因，通過對這11個基因編碼的氨基酸總數(shù)，按三聯(lián)體密碼子的原則計算，其所需核苷酸數(shù)超過5386個。后來Sanger實驗室的G. G. Garrell等發(fā)現(xiàn)X174基因組中有些密碼是重讀的，從而形成重疊基因(overlapping gene)。所謂重疊基因是指兩個或兩個以上的基因共有一段DNA序列

52、，或是指一段DNA序列為兩個或兩個以上基因的組成部分。（5）重疊基因n重疊基因的重疊方式可以有許多種，如小基因包含在大基因之內(nèi)、前后兩個基因的首尾重疊甚至三個基因重疊、操縱子重疊、或反向重疊(DNA雙鏈都轉(zhuǎn)錄，密碼讀框相同，但方向不同)。如在噬菌體X174中(圖1-23)，基因B完全包含在基因A之內(nèi)，基因A與基因K共用一段序列，基因D和E的讀碼框相差一個堿基。雖然這些基因使用的是同樣的DNA序列，但它們表達時使用的讀碼框不同，因而表達出來的是不同的蛋白質(zhì)。重疊基因現(xiàn)象反映了原核生物利用有限的遺傳物質(zhì)表達更多生物功能的能力。 （5）重疊基因 圖1-23噬菌體X174的重疊基因（5）重疊基因n在原

53、核生物中，重疊基因是一種較為普遍的現(xiàn)象。1978年猴病毒SV40基因組全序列發(fā)表后，發(fā)現(xiàn)編碼病毒外殼蛋白的三個基因VP1、VP2和VP3都有重疊部分。在真核生物甚至高等真核生物包括人的基因組中也偶爾發(fā)現(xiàn)有重疊基因。1998年12月公布的秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis elegans)全基因組序列分析表明，有的內(nèi)含子序列中包含了tRNA基因，且tRNA基因的轉(zhuǎn)錄方向不一定與它所包含的基因的轉(zhuǎn)錄方向相同。 第一講 基因工程概論1、現(xiàn)代生物技術(shù)重塑自然生命2、基因研究的發(fā)展3、基因的現(xiàn)代概念4、基因工程的誕生與發(fā)展5、基因工程的應(yīng)用6、基因工程的安全性4、基因工程的誕生與發(fā)展（1）基因

54、工程誕生的理論基礎(chǔ)（2）基因工程誕生的技術(shù)突破（3）基因工程的誕生（4）基因工程的基本概念與內(nèi)容A. DNA是遺傳物質(zhì)1952年Alfred Hershy和Marsha Chase進一步證明遺傳物質(zhì)是DNA。1944年 Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。（a a）肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗（b b）噬菌體轉(zhuǎn)染實驗噬菌體轉(zhuǎn)染實驗（1）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機制。B. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)1958年，Crick提出遺傳信息傳遞的“中心法則”

55、DNA RNA protein1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等終于破譯了64個遺傳密碼C. 中心法則和遺傳密碼基因工程的理論依據(jù)基因工程的理論依據(jù)n不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)n基因是可切割的基因是可切割的n基因是可以轉(zhuǎn)移的基因是可以轉(zhuǎn)移的n多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系n遺傳密碼是通用的遺傳密碼是通用的n基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代4、基因工程的誕生與發(fā)展（1）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)（2）基因工程誕生的技術(shù)突破（3）基因工程的誕生（4）基因工程的基本概念

56、與內(nèi)容A. 限制性內(nèi)切酶(restriction enzymes)1970年H.O. Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。Werner Arber 理論預(yù)見限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片斷Hamilton O. Smith 得到第一個限制酶1978年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎（2）基因工程誕生的技術(shù)突破B. DNA連接酶(ligase)1967年5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。C. 載體(vector)1972年前后使用小分子量的細菌質(zhì)粒和噬菌體作載體。在細菌細胞里的大量擴增。D. 感受態(tài)體系1970年M. Mandel和A. Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣

57、處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S. Cohen發(fā)現(xiàn)這種處理過的細菌同樣能吸收質(zhì)粒DNA。E. 瓊脂糖凝膠電泳1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長度的DNA分離開。F. DNA測序技術(shù)1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert發(fā)明了DNA快速測序技術(shù)。1980年Nobel化學(xué)獎4、基因工程的誕生與發(fā)展（1）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)（2）基因工程誕生的技術(shù)突破（3）基因工程的誕生（4）基因工程的基本概念與內(nèi)容1980年Nobel化學(xué)獎1972年斯坦福大學(xué)的Paul Berg小組完成了首次體外重組實驗：A. Berg的開創(chuàng)性實驗將SV40的DNA片斷與噬

58、菌體的DNA片斷連接起來。（用DNA末端轉(zhuǎn)移酶，而非限制性內(nèi)切酶）（3）基因工程的誕生1973年斯坦福大學(xué)的S. Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101連接成重組質(zhì)粒，具有雙重抗藥性。后來又把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實驗。Stanley Cohen 1986 Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎Herb Boyer4、基因工程的誕生與發(fā)展（1）基因工程誕生的理論基礎(chǔ)（2）基因工程誕生的技術(shù)突破（3）基因工程的誕生（4）基因工程的基本概念與內(nèi)容

59、（4）基因工程的基本概念與內(nèi)容A 重組DNA技術(shù)的基本定義B 基因工程的基本定義C 重組DNA技術(shù)與基因工程的基本用途D 基因工程的基本形式E 基因工程的特征F 基因工程的主要操作內(nèi)容A 重組DNA技術(shù)的基本定義（4） 基因工程的基本概念與內(nèi)容重組DNA技術(shù)是指將一種生物體(供體)的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體(受體)內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。B 基因工程的基本定義（4） 基因工程的基本概念與內(nèi)容基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下

60、游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。C 重組DNA技術(shù)與基因工程的基本用途（4） 基因工程的基本概念與內(nèi)容分離、擴增、鑒定、研究、整理生物信息資源大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)設(shè)計、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)工程細胞基因工程蛋白質(zhì)工程途徑工程發(fā)酵工程細胞工程分離工程酶酶工程分離工程野生細胞野生細胞生物活性物質(zhì)生物活性物質(zhì)D 基因工程的基本形式（4） 基因工程的基本概念與內(nèi)容第一代基因工程(經(jīng)典基因工程) 蛋白多肽基因的高效表達第二代基因工程(蛋白質(zhì)工程)