實(shí)驗(yàn)八質(zhì)粒DNA的小量制備ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量制備的小量制備普通操作步驟：普通操作步驟：培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增搜集和裂解細(xì)菌搜集和裂解細(xì)菌分別質(zhì)粒分別質(zhì)粒DNA堿變性法堿變性法煮沸法煮沸法去污劑法去污劑法有機(jī)溶劑法有機(jī)溶劑法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膙掌握堿裂解法提取質(zhì)粒掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理的原理v熟習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒熟習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法的方法分別質(zhì)粒分別質(zhì)粒DNA需求去除的：需求去除的：v大腸桿菌染色體大腸桿菌染色體DNAv蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)vRNA二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理堿變性法抽提質(zhì)粒的原理堿變性法抽提質(zhì)粒的原理v堿變性抽提質(zhì)粒堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體是基于染色體

2、DNA與質(zhì)粒與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差別而到達(dá)分別目的。的變性與復(fù)性的差別而到達(dá)分別目的。v在在EDTA、溶菌酶和外表活性劑的存在下，經(jīng)、溶菌酶和外表活性劑的存在下，經(jīng)堿處置溶菌，堿處置溶菌，v同時在同時在pH高達(dá)高達(dá)12.012.6 的堿性條件下，染色體的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋構(gòu)造解開而變性。質(zhì)粒的氫鍵斷裂，雙螺旋構(gòu)造解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分別。的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分別。v當(dāng)以當(dāng)以pH4.8的的KAc高鹽緩沖液去調(diào)理其高鹽緩沖液去調(diào)理其pH至中性至中性時，變性的質(zhì)粒時，變

3、性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保管在又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保管在溶液中，而染色體溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而構(gòu)成纏連的網(wǎng)不能復(fù)性而構(gòu)成纏連的網(wǎng)狀構(gòu)造。狀構(gòu)造。v經(jīng)過離心，染色體經(jīng)過離心，染色體DNA、不穩(wěn)定的大分子、不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一同沉淀下來而被除去。復(fù)合物等一同沉淀下來而被除去。v降解的小分子降解的小分子RNA可經(jīng)過可經(jīng)過Rnase A處置去除處置去除v未除凈的蛋白質(zhì)可經(jīng)過苯酚未除凈的蛋白質(zhì)可經(jīng)過苯酚/氯仿抽提除去。氯仿抽提除去。三、實(shí)驗(yàn)資料三、實(shí)驗(yàn)資料vLB液體培育基、氨芐青霉素液體培育基、氨芐青霉素 v溶液溶液、RNase A 、預(yù)冷無水乙醇、預(yù)冷無

4、水乙醇 、70%乙醇、乙醇、 TE緩沖液緩沖液vDH5-pCR2.1-Rv1791提質(zhì)粒用溶液提質(zhì)粒用溶液、v溶液溶液細(xì)菌重懸液：細(xì)菌重懸液：v 50mM Tris-HClv 10mM EDTAv pH 7.5v溶液溶液(細(xì)菌裂解液：細(xì)菌裂解液：v 0.4M NaOHv 2% SDSv溶液溶液:v 1.32M KAcv pH 4.8 (用醋酸調(diào)用醋酸調(diào)四、實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟四、實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟1. 挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落至挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌落至2ml LB培育液中含培育液中含Amp 100g/ml， 37，250rpm，培育過夜。，培育過夜。2. 取取1.5ml培育物至指形管中，培育物至指形管中，12

5、,000rpm，30s。3. 吸去上清，使沉淀盡能夠枯燥。吸去上清，使沉淀盡能夠枯燥。4. 將細(xì)菌沉淀懸浮于將細(xì)菌沉淀懸浮于200l預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液中，猛烈振蕩。中，猛烈振蕩。5. 加加200l溶液溶液新穎配制，蓋緊管口，快速顛倒新穎配制，蓋緊管口，快速顛倒5次以混勻內(nèi)容物。冰上放置。次以混勻內(nèi)容物。冰上放置。6. 參與參與200l溶液溶液冰上預(yù)冷，蓋緊管口，溫暖振冰上預(yù)冷，蓋緊管口，溫暖振蕩，冰上放置蕩，冰上放置3-5min。7. 4，12,000rpm，5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。中。8. 參與等體積酚參與等體積酚/氯仿氯仿1:1，振蕩混勻，振蕩混勻，4

6、， 12,000rpm ，2min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。(此步也可不做此步也可不做)9. 參與參與2倍體積的無水乙醇，室溫靜置倍體積的無水乙醇，室溫靜置2min。10. 4，12,000rpm ，5min。11. 棄上清，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體棄上清，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體 。12. 用用1ml 70%乙醇洗滌質(zhì)粒乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，棄上清，吸沉淀，棄上清，吸干，在空氣中枯燥干，在空氣中枯燥10min。13. 參與參與30l TE緩沖液含緩沖液含20g/ml RNase A ，不含，不含DNA酶，使酶，使DNA完全溶解。完全溶解。14. 37 ，保溫，保溫30min，消化，消化RNA，取出置，取出置-20保管。保管。五五.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果v經(jīng)過凝膠電泳和紫外分光法檢測抽提的質(zhì)粒經(jīng)過