食品中大黃酚和橙黃決明素的測定(BJS201916)

1、附件 1食品中大黃酚和橙黃決明素的測定BJS 2019161 范圍本方法規(guī)定了食品（含保健食品）中大黃酚和橙黃決明素的高效液相色譜測定方法。本方法適用于飲料、代用茶等食品及片劑、膠囊、顆粒劑、口服液等劑型的保健食品中大黃酚和橙黃決明素的含量測定。2 原理試樣經(jīng)甲醇回流提取后，再以稀鹽酸水解，二氯甲烷萃取， 采用配有二極管陣列檢測器或紫外檢測器的高效液相色譜儀檢測，外標法定量。3 試劑和材料除另有說明外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682 規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1甲醇（ CH 3OH) ：色譜純。3.1.2乙腈（ C2H3N）：色譜純。3.1.3磷酸（ H 3PO4）。

2、3.1.4二氯甲烷（ CH2CL 2）。3.1.5鹽酸（ HCL ）。3.1.6無水乙醇（ CH 3CH2OH ）。1乙酸乙酯（ C4H 8O2）。甲酸（ CH2O2）。3.2 試劑配制3.2.1磷酸水溶液（ 0.1%）：取磷酸（ 3.1.3）1.0mL ，加水定容至 1000mL 。3.2.2稀鹽酸：取鹽酸（ 3.1.5） 234mL ，用水溶解并定容至1000mL 。3.2.3無水乙醇 -乙酸乙酯（ 2+1 ）混合溶液：取無水乙醇500mL 與乙酸乙酯 250mL ，混勻。甲酸水溶液（0.1%）：取甲酸（）1.0mL ，加水稀釋并定容至1000mL 。3.3 標準品橙黃決明素、大黃酚的標準

3、品的分子式、相對分子量、CAS 登錄號見附錄A 表 A.1 。橙黃決明素的純度98%，大黃酚的純度99%。3.4 標準溶液配制標準儲備液(100 g/mL)：分別稱取大黃酚、橙黃決明素（3.3）各0.0100g （精確至0.0001g），置 100mL 棕色量瓶中，用無水乙醇-乙酸乙酯（ 2+1 ）混合溶液（）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100g/mL的標準儲備液，0 4冷藏保存，有效期6 個月?；旌?標準 中間液（ 20 g/mL）：分 別準確吸取 大黃酚、橙 黃決明素標 準儲備液(100 各 5mL ，置同一25mL 棕色量瓶中，用無水乙醇-乙酸乙酯（ 2+1 ）混合溶液（）稀釋至刻

4、度，搖勻。0 4冷藏保存，有效期1 個月?；旌蠘藴使ぷ饕海悍謩e準確吸取不同體積的混合標準中間液，用無水乙醇-乙酸乙酯（ 2+1 ）混合溶液（）稀釋成一系列標準工作液，該標準系列中大黃酚和橙黃決明素濃度為 0.2 g/mL、 0.5 g/mL、 2.0 g/mL、 4.0 g/mL、 10.0 g/mL 、 20.0 g/mL。臨用新制。4 儀器和設備4.1 高效液相色譜儀：配有二極管陣列檢測器或紫外檢測器。24.2 超聲波清洗器。4.3 高速萬能粉碎機。4.4 分析天平：感量分別為0.01g 和 0.01mg。4.5 電熱恒溫水浴鍋。4.6 旋轉蒸發(fā)儀。4.7 氮吹儀。5 分析步驟5.1 試樣

5、制備固態(tài)試樣或半固態(tài)試樣取適量固態(tài)試樣（代用茶及片劑、膠囊內(nèi)容物、顆粒劑等保健食品）混勻，研細，或取適量半固態(tài)試樣（軟膠囊內(nèi)容物）混勻，稱取0.5g 1g（精確至0.001g），置平底燒瓶中，加入甲醇50mL ，混勻，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25mL 于平底燒瓶中，蒸干（或氮吹至干），加入稀鹽酸（）30mL ，超聲 2min ，加熱回流水解1h，立即冷卻，置于分液漏斗中，先用少量水洗滌燒瓶，再用少量二氯甲烷洗滌燒瓶，并入分液漏斗中，酸液再用二氯甲烷振搖提取4 次，用量依次為40mL 、30mL 、30mL 、20mL ，合并二氯

6、甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣用無水乙醇 -乙酸乙酯（ 2:1）混合溶液（）溶解，轉移至25mL 容量瓶中，定容至刻度，溶液經(jīng) 0.45 m 有機系微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，根據(jù)實際濃度適當稀釋至標準曲線線性范圍內(nèi)，備用。液態(tài)試樣取適量試樣（飲料、口服液）混勻，準確吸取2.0 5.0mL ，置平底燒瓶中，水浴蒸干，3加入稀鹽酸（） 10mL，超聲 2min，加熱回流水解1h，立即冷卻，置于分液漏斗中，用少量水洗滌燒瓶，再用少量二氯甲烷洗滌燒瓶，并入分液漏斗中，酸液再用二氯甲烷振搖提取 4 次，用量依次為 15mL 、 10mL 、 10mL、 10mL ，合并二氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣用

7、無水乙醇 -乙酸乙酯（ 2:1）混合溶液（）溶解，轉移至 25mL 容量瓶中，定容至刻度，溶液經(jīng) 0.45 m 有機系微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，根據(jù)實際濃度適當稀釋至標準曲線線性范圍內(nèi)，備用。5.2 色譜參考條件5.2.1色譜柱： BDS HYPERSIL C 18（ 4.6mm250mm, 5m）或性能相當者。5.2.2流動相： A 相為甲醇， B 相為 0.1%磷酸水溶液(3.2.1) ，洗脫梯度程序見表 1。5.2.3流速： 1.0mL/min 。5.2.4柱溫： 30。5.2.5檢測波長： 284nm。5.2.6進樣量： 10L。表 1 梯度洗脫程序表梯度時間（ min ）流動相 A（

8、%）流動相 B（%）060401560402290103290103760404060405.3 標準曲線的制作將標準系列工作液（）按液相色譜參考條件（5.2）進行測定，測定相應的色譜峰面積，以標準工作液的濃度（g/mL）為橫坐標，以色譜峰的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。5.4 試樣溶液的測定4將試樣溶液（5.1）按液相色譜參考條件（5.2）進行測定，得到相應樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標準曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。6 結果計算固態(tài)或半固態(tài)試樣中大黃酚和橙黃決明素含量按式（1）計算：C VV11000（ 1）Xm1000V0式中：X 試樣中大黃酚或橙黃決明素的含量，單位

9、為毫克每千克（mg/kg ）；C 試樣中所測的大黃酚或橙黃決明素的濃度，單位為微克每毫升（ g/mL）；V 試樣最終定容體積，單位為毫升（mL ）；V1 最初加入甲醇的體積，單位為毫升（mL ）；V0 試樣加酸水解前取濾液體積，單位為毫升（mL）；m 試樣稱取的質(zhì)量，單位為克（g）；液態(tài)試樣中大黃酚和橙黃決明素含量按式（2）計算：C V1000（ 2）X1000V0式中：X 試樣中大黃酚或橙黃決明素的含量，單位為毫克每升（mg/L ）；C 試樣中所測的大黃酚或橙黃決明素的濃度，單位為微克每毫升（ g/mL）；V 試樣最終定容體積，單位為毫升（mL ）；V0 試樣吸取體積，單位為毫升（mL ）；

10、計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留三位有5效數(shù)字。7 精密度在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。8 檢出限固體或半固體試樣：當稱樣量為0.5g 時，該方法測定條件下，橙黃決明素和大黃酚的檢出限均為4mg/kg ，定量限為12mg/kg 。液體試樣：當取樣量為5mL 時，該方法測定條件下，橙黃決明素和大黃酚的檢出限均為 0.2mg/L ，定量限為0.6mg/L 。6附錄 A化合物相關信息表 A.1 大黃酚和橙黃決明素標準品的中、英文名稱、CAS 登錄號、分子式、相對分子量中文名稱英文名稱CAS 登錄號分子式相對分子量大黃酚C

11、hrysophanol481-74-3C15H10O4254.23橙黃決明素Aurantio-obtusin67979-25-3C17H14O7330.297附錄 B大黃酚和橙黃決明素標準溶液色譜圖mAU252120151050-50.05.010.015.020.025.030.035.0min圖 B.1 混合標準品溶液色譜圖1.橙黃決明素； 2.大黃酚8附錄 C定性確證試驗C.1. 色譜參考條件a) 色譜柱： C18 柱， 1.7 m，1003.0mm（內(nèi)徑），或性能相當者。b) 流動相： A 相為 0.1% 甲酸水溶液（）； B 相為乙腈（）；A+B=40+60 。c) 流速： 0.3m

12、L/min 。d) 柱溫： 35。e) 進樣量： 1L。C.2 質(zhì)譜參考條件f) 離子源：電噴霧離子源 (ESI)。g) 檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM) 。h) 掃描方式：正離子掃描 (ESI+ )。i) 毛細管電壓： 3000V 。j) 噴嘴電壓： 1500V 。k) 霧化氣溫度： 200。l) 霧化氣流速： 14.0 L/min 。m) 霧化氣壓力： 20psi。n) 鞘氣流速： 11.0L/min 。o) 鞘氣溫度： 250。p) 其他質(zhì)譜參數(shù)見表 C.1。表 C.1 化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)母離子子離子碰撞能量保留時間序號化合物名稱電離方式( m/z)(m/z)(V)（min

13、 ）91ESI +330.8297.8*1.298橙黃決明素28269.82ESI +254.9151.9*4.277大黃酚40180.6* 定量離子。注：1.本方法提供質(zhì)譜條件為推薦質(zhì)譜方法條件?？筛鶕?jù)實際情況，選擇響應信號強且無干擾的離子對進行檢測，質(zhì)譜參數(shù)亦可根據(jù)實際可達到最優(yōu)靈敏度的條件進行設定。2.如實際樣品中有檢出，通過保留時間及DAD 光譜圖不能準確定性，可以附錄C 超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法進行確證。C.3 定性判定按照 C.1 和 C.2 的條件測定樣品和混合標準系列工作溶液，記錄樣品和混合標準系列工作溶液中目標物的保留時間。若樣品中檢出與混合標準系列工作溶液中待測物保留時間一致的色譜峰（變化范圍在2.5%之內(nèi)），且其定性離子與濃度相當?shù)臉藴嗜芤褐邢鄳亩ㄐ噪x子的相對豐度相比偏差不超過表2 規(guī)定的范圍，則可以確定樣品中檢出相應的待測物。表 C.2 定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度（%）k 50%50%k20%20%k10%k10%允許的