凝膠遷移實驗(EMSA)實驗方法(共4頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上凝膠遷移實驗（EMSA）實驗方法凝膠遷移實驗有稱凝膠阻滯實驗或電泳遷移率實驗（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一種用于蛋白與核算相互作用的技術(shù)。最初是用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗，也可應(yīng)用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。一、實驗原理EMSA主要基于蛋白-探針復(fù)合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據(jù)實驗設(shè)計特異性和非特異性探針，當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物；這種復(fù)合物由于分子量大，在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結(jié)合蛋白的

2、探針則較快；孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后，蛋白-探針復(fù)合物會在膜靠前的位置形成一條帶，說明有蛋白與目標(biāo)探針發(fā)送互作。二、實驗操作步驟1、實驗前準(zhǔn)備（1）合理的實驗方案根據(jù)研究目的合理設(shè)計特異性探針實驗組以及非特異性探針對照組，如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等。（2）樣本制備可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對樣本蛋白進行定量，實驗中等量加入蛋白。（3）探針制備根據(jù)實驗要求設(shè)計不同的探針并添加標(biāo)記，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商業(yè)化的抗體也可以直接購買?，F(xiàn)在大多數(shù)實驗室已經(jīng)不再使用放射性標(biāo)記，生物素使用相對較多。2、形成蛋白-探針

3、復(fù)合物（1）在0.5ml離心管中按順序?qū)⑾铝薪M份混勻：蛋白樣本（2-5g）Xlpoly d(I-C)1lBinding Buffer2lNuclease-Free ddH2OXl總體積9l（2）冰浴5min后，加入1探針。（對照組加1ul對照探針）（3）PCR儀中室溫（20-23）溫育30min。3、制備凝膠，電泳（1）制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠：（注意根據(jù)試劑情況按比例調(diào)整總體積）5XTBE1ml30%Acrylamide/Bis2.2mldeionized,sterilewater6.62ml80%Glycerol80l10%AP90lTEMED10l總體積10ml（2）按標(biāo)準(zhǔn)步驟制

4、備凝膠。（3）加樣前先在預(yù)冷的0.5X TBE buffer中120V預(yù)電泳10min，與電泳完畢后沖洗加樣孔。（4）混合樣本及電泳緩沖液，點樣電泳。（5）將電泳槽置于冰上或者4環(huán)境中， 恒壓100V進行電泳，直至緩沖液指示帶距離凝膠底部23cm為止。（大約50-60min，根據(jù)實際情況調(diào)整電泳時間及電壓；電泳時間不宜過長）4、轉(zhuǎn)膜（1）在預(yù)冷的0.5XTBE中浸泡凝膠，膜，濾紙和纖維墊。（2） 按如下順序組裝“三明治”：纖維墊，濾紙，凝膠，膜，濾紙，纖維墊。注意電極，確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。（3）在預(yù)冷的0.5XTBE中進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜裝置應(yīng)置于冰上或者低溫室中，恒壓60V轉(zhuǎn)膜1h。（注

5、意根據(jù)實際情況調(diào)整電壓及時間）。5、檢測（1）去除轉(zhuǎn)好的膜，放入合適的盛有緩沖液的容器中，沖洗。（注意整個檢測過程避免膜干燥）（2）去掉沖洗緩沖液，加入封閉液后輕微震蕩，室溫封閉20min。（3）加入適量的HRP酶標(biāo)記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP conjugate），室溫震蕩孵育45min。（勿將酶標(biāo)記物直接加到膜上）（4）去掉酶聯(lián)物稀釋液，用洗滌緩沖液洗膜三次，每次室溫輕微震蕩1 0min。（5）配置反應(yīng)底物，均勻加至膜上，室溫孵育5min。（可以在加完底物后，用薄膜輕輕覆蓋在膜上，是底物均勻覆蓋，注意不要產(chǎn)生氣泡）（6） 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像（曝光時間的長短可以根據(jù)

6、檢測方法不同而進行相應(yīng)調(diào)整）。三、實驗結(jié)果展示（美國Signosis EMSA實驗結(jié)果）四、Super-Shift EMSA非純化的蛋白樣本和一個特定的探針可形成一個或幾個特異的蛋白復(fù)合物。確定復(fù)合物中蛋白的特征可能會困難，可以加入目的蛋白的抗體，進行超遷移實驗，即Super-Shift EMSA。抗體和蛋白/探針復(fù)合物中的蛋白結(jié)合，使復(fù)合物的遷移延遲，形成超遷移。Super-Shift EMSA工作原理；在反應(yīng)體系中，抗體與DNA/蛋白復(fù)合物中的蛋白產(chǎn)生反應(yīng)形成復(fù)合物會引起復(fù)合物的體積變大，在非變性凝膠中的移動變慢而與DNA/蛋白復(fù)合物區(qū)別開。進行Super-Shift EMSA需要考慮以下

7、因素：1）一般先做一般的EMSA測定，成功后才考慮做Super-Shift EMSA實驗。2）不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。3）抗體的濃度要高。一般10-20ul的反應(yīng)液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。3）為減少非特異性反應(yīng)，盡量使用純化的抗體。4）單抗與多抗都可用于Super-Shift EMSA，但多抗可能與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下，雖然看不到Super-Shift的帶，但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。五、常見問題1、為什么看

8、不到遷移帶？ 1）蛋白樣本提取質(zhì)量不高，蛋白降解或者提取量不足。2）樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。3）探針與蛋白無特異性的相互作用。4）轉(zhuǎn)膜效率低，蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。5）曝光或者成像時間過短。在Super-Shift EMSA測定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因： 6）抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA，只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。 7）測定的活化的DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測的構(gòu)成成分存在。此時既看不到Super-Shift的帶，也看不到DNA/蛋

9、白復(fù)合物的量的減少。8）使用的抗體過度稀釋。一般10-20ul的反應(yīng)液需要使用0.5-1ul原倍的抗體 。9）多抗與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下，雖然看不到Super-Shift的帶，但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。2、為什么實驗背景高？1）曝光或者成像時間過長。2）封閉時間不足或者效率不高。3）洗滌效果不佳4）實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態(tài)。3、EMSA測定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針？對每一個特定的結(jié)合蛋白和探針，所用的純化蛋白，部分純化蛋白，粗制核抽提液需作優(yōu)化：一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白:DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白

10、的摩爾數(shù)是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特異的復(fù)合物。部分純化蛋白與粗制核抽提液應(yīng)保存在-80、探針應(yīng)保存在-20以防止降解。無論探針或是結(jié)合蛋白都應(yīng)避免多次凍融。 4、Poly(dI:dC)，非特異性競爭DNA，特異性競爭DNA在EMSA測定中的作用？Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應(yīng)中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與標(biāo)記探針的非特異結(jié)合。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實驗前進行優(yōu)化，一般用量大約在0.05mg/ml左右。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，則

11、普通反應(yīng)中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。為確定所形成的復(fù)合物的特異性，在含或不含增量的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時，作結(jié)合反應(yīng)的競爭實驗。一般，特異競爭探針是非標(biāo)記的DNA，其序列與標(biāo)記探針相同，故能與標(biāo)記探針競爭與結(jié)合蛋白的反應(yīng)。非特異競爭探針的長度組成和DNA探針相同，但序列不同。如果結(jié)合蛋白與標(biāo)記探針的結(jié)合被特異競爭探針抑制，而不受非特異探針的影響表明靶結(jié)合蛋白的存在。特異與非特異性競爭DNA的用量也需優(yōu)化或滴定，但競爭DNA通常是標(biāo)記的探針用量的30-100倍（w/w）。5、用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開？將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合，蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%，在特定條件下可用高或低的濃度。也可將TGE緩沖液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合