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1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)實(shí)驗(yàn)方法凝膠遷移實(shí)驗(yàn)有稱凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一種用于蛋白與核算相互作用的技術(shù)。最初是用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),也可應(yīng)用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。一、實(shí)驗(yàn)原理EMSA主要基于蛋白-探針復(fù)合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性和非特異性探針,當(dāng)核酸探針與樣本蛋白混合孵育時(shí),樣本中可以與核酸探針結(jié)合的蛋白質(zhì)與探針形成蛋白-探針復(fù)合物;這種復(fù)合物由于分子量大,在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)遷移較慢,而沒有結(jié)合蛋白的
2、探針則較快;孵育的樣本在進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜后,蛋白-探針復(fù)合物會(huì)在膜靠前的位置形成一條帶,說明有蛋白與目標(biāo)探針發(fā)送互作。二、實(shí)驗(yàn)操作步驟1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備(1)合理的實(shí)驗(yàn)方案根據(jù)研究目的合理設(shè)計(jì)特異性探針實(shí)驗(yàn)組以及非特異性探針對(duì)照組,如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競(jìng)爭(zhēng)組等。(2)樣本制備可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對(duì)樣本蛋白進(jìn)行定量,實(shí)驗(yàn)中等量加入蛋白。(3)探針制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)不同的探針并添加標(biāo)記,可以合成核酸后自行添加,部分已知蛋白有商業(yè)化的抗體也可以直接購(gòu)買。現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)不再使用放射性標(biāo)記,生物素使用相對(duì)較多。2、形成蛋白-探針
3、復(fù)合物(1)在0.5ml離心管中按順序?qū)⑾铝薪M份混勻:蛋白樣本(2-5g)Xlpoly d(I-C)1lBinding Buffer2lNuclease-Free ddH2OXl總體積9l(2)冰浴5min后,加入1探針。(對(duì)照組加1ul對(duì)照探針)(3)PCR儀中室溫(20-23)溫育30min。3、制備凝膠,電泳(1)制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠:(注意根據(jù)試劑情況按比例調(diào)整總體積)5XTBE1ml30%Acrylamide/Bis2.2mldeionized,sterilewater6.62ml80%Glycerol80l10%AP90lTEMED10l總體積10ml(2)按標(biāo)準(zhǔn)步驟制
4、備凝膠。(3)加樣前先在預(yù)冷的0.5X TBE buffer中120V預(yù)電泳10min,與電泳完畢后沖洗加樣孔。(4)混合樣本及電泳緩沖液,點(diǎn)樣電泳。(5)將電泳槽置于冰上或者4環(huán)境中, 恒壓100V進(jìn)行電泳,直至緩沖液指示帶距離凝膠底部23cm為止。(大約50-60min,根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整電泳時(shí)間及電壓;電泳時(shí)間不宜過長(zhǎng))4、轉(zhuǎn)膜(1)在預(yù)冷的0.5XTBE中浸泡凝膠,膜,濾紙和纖維墊。(2) 按如下順序組裝“三明治”:纖維墊,濾紙,凝膠,膜,濾紙,纖維墊。注意電極,確保凝膠位于陰極、膜位于陽(yáng)極。(3)在預(yù)冷的0.5XTBE中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜裝置應(yīng)置于冰上或者低溫室中,恒壓60V轉(zhuǎn)膜1h。(注
5、意根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整電壓及時(shí)間)。5、檢測(cè)(1)去除轉(zhuǎn)好的膜,放入合適的盛有緩沖液的容器中,沖洗。(注意整個(gè)檢測(cè)過程避免膜干燥)(2)去掉沖洗緩沖液,加入封閉液后輕微震蕩,室溫封閉20min。(3)加入適量的HRP酶標(biāo)記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP conjugate),室溫震蕩孵育45min。(勿將酶標(biāo)記物直接加到膜上)(4)去掉酶聯(lián)物稀釋液,用洗滌緩沖液洗膜三次,每次室溫輕微震蕩1 0min。(5)配置反應(yīng)底物,均勻加至膜上,室溫孵育5min。(可以在加完底物后,用薄膜輕輕覆蓋在膜上,是底物均勻覆蓋,注意不要產(chǎn)生氣泡)(6) 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像(曝光時(shí)間的長(zhǎng)短可以根據(jù)
6、檢測(cè)方法不同而進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整)。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示(美國(guó)Signosis EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果)四、Super-Shift EMSA非純化的蛋白樣本和一個(gè)特定的探針可形成一個(gè)或幾個(gè)特異的蛋白復(fù)合物。確定復(fù)合物中蛋白的特征可能會(huì)困難,可以加入目的蛋白的抗體,進(jìn)行超遷移實(shí)驗(yàn),即Super-Shift EMSA。抗體和蛋白/探針復(fù)合物中的蛋白結(jié)合,使復(fù)合物的遷移延遲,形成超遷移。Super-Shift EMSA工作原理;在反應(yīng)體系中,抗體與DNA/蛋白復(fù)合物中的蛋白產(chǎn)生反應(yīng)形成復(fù)合物會(huì)引起復(fù)合物的體積變大,在非變性凝膠中的移動(dòng)變慢而與DNA/蛋白復(fù)合物區(qū)別開。進(jìn)行Super-Shift EMSA需要考慮以下
7、因素:1)一般先做一般的EMSA測(cè)定,成功后才考慮做Super-Shift EMSA實(shí)驗(yàn)。2)不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA,只有對(duì)非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。3)抗體的濃度要高。一般10-20ul的反應(yīng)液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。3)為減少非特異性反應(yīng),盡量使用純化的抗體。4)單抗與多抗都可用于Super-Shift EMSA,但多抗可能與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下,雖然看不到Super-Shift的帶,但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。五、常見問題1、為什么看
8、不到遷移帶? 1)蛋白樣本提取質(zhì)量不高,蛋白降解或者提取量不足。2)樣本中沒有可以與探針結(jié)合的蛋白。3)探針與蛋白無特異性的相互作用。4)轉(zhuǎn)膜效率低,蛋白或者探針未轉(zhuǎn)移到膜上。5)曝光或者成像時(shí)間過短。在Super-Shift EMSA測(cè)定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復(fù)合物帶還可能有以下原因: 6)抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA,只有對(duì)非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應(yīng)的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。 7)測(cè)定的活化的DNA/蛋白復(fù)合物中沒有希望檢測(cè)的構(gòu)成成分存在。此時(shí)既看不到Super-Shift的帶,也看不到DNA/蛋
9、白復(fù)合物的量的減少。8)使用的抗體過度稀釋。一般10-20ul的反應(yīng)液需要使用0.5-1ul原倍的抗體 。9)多抗與DNA/蛋白復(fù)合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下,雖然看不到Super-Shift的帶,但應(yīng)當(dāng)可以看到DAN/蛋白復(fù)合物的電泳帶明顯減少。2、為什么實(shí)驗(yàn)背景高?1)曝光或者成像時(shí)間過長(zhǎng)。2)封閉時(shí)間不足或者效率不高。3)洗滌效果不佳4)實(shí)驗(yàn)過程中膜沒有一直處于濕潤(rùn)狀態(tài)。3、EMSA測(cè)定需要多少量的蛋白與標(biāo)記的探針?對(duì)每一個(gè)特定的結(jié)合蛋白和探針,所用的純化蛋白,部分純化蛋白,粗制核抽提液需作優(yōu)化:一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間,可將蛋白:DNA的等摩爾比調(diào)整為蛋白
10、的摩爾數(shù)是DNA的5倍;用粗制核抽提液,需要2-10ug蛋白形成特異的復(fù)合物。部分純化蛋白與粗制核抽提液應(yīng)保存在-80、探針應(yīng)保存在-20以防止降解。無論探針或是結(jié)合蛋白都應(yīng)避免多次凍融。 4、Poly(dI:dC),非特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA,特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA在EMSA測(cè)定中的作用?Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應(yīng)中加入poly(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與標(biāo)記探針的非特異結(jié)合。結(jié)合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行優(yōu)化,一般用量大約在0.05mg/ml左右。當(dāng)用純化的蛋白作凝膠遷移反應(yīng)時(shí),不必一定加入poly(dI:dC),如加入,則
11、普通反應(yīng)中所用終濃度不超過50-100ng。對(duì)核抽提液,每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。為確定所形成的復(fù)合物的特異性,在含或不含增量的特異競(jìng)爭(zhēng)DNA或非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA時(shí),作結(jié)合反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。一般,特異競(jìng)爭(zhēng)探針是非標(biāo)記的DNA,其序列與標(biāo)記探針相同,故能與標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)與結(jié)合蛋白的反應(yīng)。非特異競(jìng)爭(zhēng)探針的長(zhǎng)度組成和DNA探針相同,但序列不同。如果結(jié)合蛋白與標(biāo)記探針的結(jié)合被特異競(jìng)爭(zhēng)探針抑制,而不受非特異探針的影響表明靶結(jié)合蛋白的存在。特異與非特異性競(jìng)爭(zhēng)DNA的用量也需優(yōu)化或滴定,但競(jìng)爭(zhēng)DNA通常是標(biāo)記的探針用量的30-100倍(w/w)。5、用什么凝膠條件將蛋白質(zhì)/探針復(fù)合物和游離的探針分離開?將結(jié)合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結(jié)合,蛋白/探針復(fù)合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經(jīng)電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%,在特定條件下可用高或低的濃度。也可將TGE緩沖液(12.5mM Tris,pH8.3,95mM 甘氨酸,0.5mM EDTA)用于不穩(wěn)定的蛋白/DNA復(fù)合
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