【醫(yī)療藥品管理】磺胺類藥物

1、磺胺類藥物(Sulfonamides, SAs)是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱,其通過干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)對氨基 苯甲酸的利用而發(fā)揮抑菌作用,后者是微生物生長必需物質(zhì)葉 酸的組成局部.自20世紀(jì)30年代研究證實(shí)了 SAs抑菌的根本結(jié) 構(gòu)后,相繼合成了各種SAs,由于其抗菌譜廣,價(jià)格低廉,目前 仍是獸醫(yī)臨床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中最常用的藥物添加劑之一,但也帶來了食品平安和環(huán)境污染等系列問題.研究說明與其它常用抗生素相比,SAs可能更易誘導(dǎo)菌株應(yīng) 選擇壓力而產(chǎn)生耐藥性.此外,SAs藥物還會導(dǎo)致過敏反響、 尿和 造血功能紊亂等副作用.如磺胺二甲基嚅咤等可能誘發(fā)嚙齒類動 物如鼠的甲狀腺增生,對其激素樣

2、效應(yīng)和潛在致癌性質(zhì)正在進(jìn) 一步研究中.由于SAs在體內(nèi)作用和代謝的時(shí)間較長,通過任何 途徑攝入的磺胺都有可能在人體中蓄積,蓄積濃度超過一定值 時(shí)將對人體機(jī)能造成損害.因此,聯(lián)合國食品法典委員會(CAC) 和許多國家規(guī)定,食品和飼料中SAs總量以及磺胺二甲基嚅咤等 單個(gè)SAs的量均不得超過011mg/kg .而且伴隨獸藥殘留毒理學(xué) 的開展和風(fēng)險(xiǎn)分析手段的進(jìn)步,各國對SAs在動物源性食品中的 殘留限量做出了越來越嚴(yán)格的規(guī)定,如日本對食用動物肌肉中 磺胺二甲基喀咤的最大殘留限量規(guī)定為方法檢測低限,即0101mg/kg.關(guān)于SAs殘留的檢測從早期的分光光度法、熒光法、薄層色 譜法到近些年的液相色譜法、

3、氣相色譜 -質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法和超臨界流體色譜法,幾乎所有的分析理論 和技術(shù)在SAs殘留分析中都得到了研究和應(yīng)用,其中采用最多的 篩選方法是反相高效液相色譜法(HPLC),后來開展的酶聯(lián)免疫 吸附測試方法(EL ISA)作為篩選方法也得到了廣泛的應(yīng)用.但 是這些檢測方法都存在處理方法繁瑣,操作時(shí)間長及只能檢測 單個(gè)磺胺類藥物的問題.基于細(xì)菌受體分析的Charm n放射免疫法的樣品前處理提取方法簡便,具有靈敏度高,特異性強(qiáng)的特 點(diǎn),并且可以檢測磺胺類殘留總量,已經(jīng)為歐盟國家和美國FDA 認(rèn)可并且應(yīng)用于初篩分析,目前國內(nèi)尚未見有關(guān)鰻魚的檢測報(bào) 道.本研究建立了鰻魚中磺胺類殘留C

4、harm n放射免疫檢測方法.1材料和方法1 . 1 設(shè)備和材料Charm 6600 /7600 分析儀:美國Charm 公司生產(chǎn)；IEC離心; 均質(zhì)器；渦旋混合器；恒溫孵育器(65 ±1C; 80 ±2 C);閃 爍液加液器;50mL離心管；硼硅玻璃試管及試管塞；pH試條； 藥片壓桿.1 . 2 樣品和試劑1.2.1 檢測基質(zhì)鰻魚1.2.2 檢測試劑磺胺類Charm II檢測試劑盒；閃爍液(Optifluor);陰性對照液；多抗標(biāo)準(zhǔn)品.以上試劑均由美國Charm公司提供.1.2.3 磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品磺胺甲基喀咤SM1、磺胺二甲基喀咤SM2、磺胺間甲氧喀咤SMM、磺胺間二甲

5、氧喘 咤SDM、磺胺嘍嗯咻SQX、磺胺甲嚷二嚏STZ、磺胺 叱咤SPD 、磺胺異嗯嚏SIZ、磺胺甲基異嗯嚏SMZ、 磺胺喀咤SD、磺胺嚷嚏ST、磺胺甲氧噠嗪SMP、磺 胺氯噠嗪SCP o以上標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司提供.1.2.4 恩諾沙星、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、螺旋霉素、 林可霉素、四環(huán)霉素、氯霉素、紅霉素、青霉素 G標(biāo)準(zhǔn)品. 以上標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司提供.1 . 3 方法1.1. 1測試原理測定的根底是競爭性受體免疫反響. 用3H 標(biāo)記的磺胺二 甲喀咤示蹤劑與樣品中磺胺類藥物的競爭結(jié)合試劑 微生物細(xì) 胞上的特異性受體上的磺胺結(jié)合位點(diǎn),當(dāng)樣品中殘留磺胺類藥 物時(shí),殘留物與受體上的結(jié)合位點(diǎn)

6、結(jié)合,從而阻止了 3H 標(biāo)記 的磺胺類藥物與結(jié)合劑位點(diǎn)的結(jié)合.樣品中的磺胺類藥物含量越高競爭的結(jié)合位點(diǎn)越多,3H 標(biāo)記磺胺二甲喀咤的那么越少,用 Charm II分析儀測定樣品中的3H 含量的cpm 每分鐘脈沖 數(shù)值,cpm值越低那么樣品中的磺胺類藥物殘留量越高.1.3. 2提取步驟1取50mL離心管,參加10g均質(zhì)好的鰻魚糜樣.(2)力口入30mLMSU提取緩沖液,強(qiáng)力振蕩離心管10min后進(jìn)入步驟(3).(3)將離心管置80 ± 2 C孵育器內(nèi)孵育45min.(4)再將離心管置冰水內(nèi)10min.(5)于 1750g ( IEC 離心機(jī) 313 X 1000 rpm) 離心 10m

7、in .(6)吸出上層液用于測試.注意不要將漂浮的脂肪顆粒混入上清 液內(nèi).1.4. 3測定步驟 用藥片壓桿的平端,將白色藥片(受體試劑片)壓入一潔凈的 玻璃試管內(nèi).(2)加300山 蒸儲水到試管內(nèi)用渦旋混合器振蕩 10 s至藥片破 碎.(3)用加樣器加4mL樣品到試管內(nèi).(每一樣品用一新加液吸 嘴).(4)用筆的平端,壓入粉紅色藥片(3H 標(biāo)記的磺胺二甲嚅咤).用振蕩器振蕩大約15 s o置65 ±1 C孵育器內(nèi),孵育3min.(6) 1750g ( IEC 離心機(jī) 313 X 1000 rpm) 離心 3min .(7)離心停止后立即取出試管,倒掉上層液,用棉簽去除試管內(nèi) 的脂肪環(huán)

8、并吸干管壁內(nèi)的殘漬,不要接觸沉淀物.(8)加300山蒸儲水到試管內(nèi),振蕩使沉淀物完全破碎.(9)力口3mL閃爍液到試管內(nèi)渦旋混勻至試管內(nèi)沒有不均一的云絮狀物.(10)試管放入Charm II /7600分析儀內(nèi).(11)按Charm II /7600 分析儀操作程序選項(xiàng)(檢測限制點(diǎn)需預(yù)先設(shè)定并輸入儀器),讀3H 項(xiàng)的cpm值.1.3.4 陽性結(jié)果確實(shí)定樣品的cpm 限制點(diǎn)時(shí),需要重新檢測樣品及同時(shí)測定一 個(gè)陰性質(zhì)控和一個(gè)陽性質(zhì)控,以確定試劑和設(shè)備是否工作正常. 通常情況下：(1)測試的陰性質(zhì)控應(yīng)該是陰性質(zhì)控平均值土20% (每一試劑盒都會給出陰性質(zhì)控平均值,平均值一般為運(yùn)行三份陰性質(zhì)控液 的c

9、pm值的平均數(shù)).(2)測試的陽性質(zhì)控應(yīng)該小于限制點(diǎn).如果重測樣品的cpm 控制點(diǎn)且(1) ( 2)兩條件符合,那么判定樣品陽性.1.3.5 限制點(diǎn)的建立在6份無磺胺類殘留的鰻魚樣品中參加測試所要求的抗 生素濃度(參照試劑盒說明書).根據(jù)分析程序運(yùn)行(見11313方 法).得出6個(gè)cpm值,計(jì)算其平均值.平均值的130%即為此類 樣品的限制點(diǎn).2結(jié)果與分析211抗原抗體競爭性反響標(biāo)準(zhǔn)曲線將濃度為1000聞/L的多抗標(biāo)準(zhǔn)品添參加陰性鰻魚樣品中, 添加濃度分別為 10、20、30、40、50、80、100、150、200閨/kg,按11313測定步驟檢測其cpm值,結(jié)果如圖1和圖2添加濃度fWU加

10、即愣心圖1娛魚中淖加技二甲噫虎的競爭性RI啟曲段圖2 倏魚中添加事艘二甲嗝咤趨於線任何受體分析的靈敏度都存在限制,Charm n放射免疫分析 中細(xì)菌受體和3H 的磺胺二甲嚅咤抗原的量是固定的.從圖 1 可以看出,當(dāng)樣品中競爭性磺胺二甲嚅咤濃度到達(dá)50聞/kg時(shí),濃度繼續(xù)增加那么其競爭效率下降,表現(xiàn)為斜率絕對值變小,cpm 值讀數(shù)變化很小.抗原質(zhì)量濃度到達(dá)200聞/kg時(shí),分析體系已接近飽和.在磺胺二甲嚅咤添加濃度為1050由/kg的范圍內(nèi),以質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo),以相應(yīng)質(zhì)量濃度的cpm數(shù)值的相對 值即其cpm讀數(shù)與陰性樣品cpm讀數(shù)的比值,B /Bo 為縱坐 標(biāo),得到半對數(shù)曲線,如圖2.由于是

11、以細(xì)菌細(xì)胞壁受體作為抗 原的結(jié)合位點(diǎn),其親和性不均一,而且抗原抗體反響的復(fù)雜性使 得不能得到相關(guān)系數(shù)很高的線形擬合 ,但是從圖2可以看出在添 加濃度為1050聞/kg的范圍內(nèi),分析體系是比擬靈敏的.根據(jù) 實(shí)際情況確定檢測限時(shí),考慮到分析相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,一般要求空 白加標(biāo)樣品與空白樣品的cpm相對值小于016,即鰻魚中磺胺 二甲喀咤檢測濃度須大于11129聞/kg o 2. 2 特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)室選取陰性鰻魚樣品,分別參加13種磺胺類藥物標(biāo) 準(zhǔn)品分別為磺胺甲基喀咤(SM1)、磺胺二甲基喀咤(SM2)、 磺胺間甲氧喀咤(SMM)、磺胺間二甲氧喀咤(SDM)、磺胺嘍 嗯咻(SQX)、磺胺甲嚷二嚏(

12、STZ)、磺胺叱咤(SPD )、磺胺 異嗯嚏(SIZ)、磺胺甲基異嗯嚏(SMZ)、磺胺喀咤(SD)、磺 胺嚷嚏(ST)、磺胺甲氧噠嗪(SMP)、磺胺氯噠嗪(SCP),添 加水平為50聞/kg,測定加標(biāo)后cpm值,與限制點(diǎn)cpm值1357 相比擬,結(jié)果添加13種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測定結(jié)果陽性率為 100% o另外添加恩諾沙星、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、螺旋 霉素、林可霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、青霉素 G的混合標(biāo) 準(zhǔn)品,添加水平為1000 pg/kg,樣品測定結(jié)果均為陰性.上述實(shí) 驗(yàn)驗(yàn)證了 Charm II放射免疫分析法測定鰻魚中磺胺類殘留的特 異性能滿足檢測要求.2. 3 最大殘留限量MRL

13、驗(yàn)證現(xiàn)在日本等一些國家把磺胺類最大殘留限量從100聞/kg降為50聞/kg,我們對放射免疫法在此水平的檢測靈敏度做了 加標(biāo)驗(yàn)證.首先按11315限制點(diǎn)的建立方法確定鰻魚中磺胺類檢 測限為50聞/kg的限制點(diǎn)cpm值是1357.選取陰性樣品,添加 13種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品,添加水平分別為40聞/kg、50聞/kg 和80聞/kg, 測定出的cpm值與限制點(diǎn)cpm值1357進(jìn)行比擬. 如樣品的cpm值大于1357,那么結(jié)果為陰性；如樣品的cpm值小 于1357,那么結(jié)果為陽性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 1 o加標(biāo)水平聞/kg陰性樣品加標(biāo)試驗(yàn)SDSM1SM2SMMSDMSQXSTZSPDSMZSTSMPSCPSIZ混標(biāo)40+50+80+2.4 實(shí)測結(jié)果分析我們應(yīng)用本方法對600余份鰻魚樣品進(jìn)行了磺胺類的初篩 分析,篩選水平為50 pg/kg,對其中篩選陽性的4份鰻魚進(jìn)行 HPLC /UV的分析,均未檢出磺胺類殘留,可見初篩有假陽性可能.原因可能是鰻魚生長的環(huán)境復(fù)雜如：水源、土池的土壤、飼料、用來殺菌的中藥等干擾物質(zhì)造成的影響.另取十份初篩陰性的樣品,經(jīng)HPLC /UV 確認(rèn)均為陰性,假陰性率為0%.3 結(jié)論應(yīng)用Charm II放射免疫分析方法測定鰻魚樣品的磺胺類藥 物殘留,該檢測方法可靠,靈敏度高,特異性強(qiáng),快速簡便,達(dá) 到了日本、歐美等國磺胺類最大殘留限量的檢測要求,能夠進(jìn)行大批量