端粒酶活性檢測(cè)方法

1、1/ 3端粒酶活性檢測(cè)方法1.端粒重復(fù)序列延伸法端粒酶在體外可以以其自身 RNA 的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的 末端添加6 個(gè)堿基的重復(fù)序列，用聚丙烯酰胺(PAGE 凝膠電泳可顯示 6 個(gè)堿基 差異的梯帶。1994年 Kim 建立了基于 PCR 基礎(chǔ)上的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法 (Telomeric Repeat AmplificationProtoc01 . TRAP)首先合成一個(gè) 18nt 的 TS 做上游引物，端粒酶結(jié)合 TS 末端的 GTT 并合成 AGGGTrAG 然后每經(jīng)過(guò)一次轉(zhuǎn)位合成一個(gè) GGTTAG 勺 6 堿基重復(fù) 序列，端粒酶滅活后，加入一個(gè) 24nt 的 CX 做下游引

2、物，經(jīng)過(guò)多次變性-退火-延 伸，擴(kuò)增端粒酶延伸產(chǎn)物。1994 年 Kim 創(chuàng)建了該方法，它與 DNA 聚合酶分析方 法相似，如；把核酸提取物、代表脊椎動(dòng)物端粒重復(fù)序列的單鏈DNA 前體(T1 AGGG 和放射標(biāo)記的磷酸脫氧核糖一起孵育，然后通過(guò)放射自顯影檢測(cè)凝 膠上新添加的 DNA 重復(fù)序列。此方法是最早建立的方法，它穩(wěn)定性好。其缺點(diǎn) 是，需要樣本量大，敏感性差，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不適合臨床標(biāo)本的大量檢測(cè)，檢 測(cè)時(shí)需同位素量較大。此法已基本被淘汰2.TRAP 法及其改進(jìn)(關(guān)鍵是我們有沒(méi)有 PCF 擴(kuò)增機(jī)、電泳自顯影及圖像分 析)其基本原理是利用 CHAPS 去污劑提取端粒酶后，將反應(yīng)體系中下游引物

3、CX(5-(CCATTA)3CCCTAA3用石蠟層與其他反應(yīng)隔開(kāi)，在石蠟層上利用端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性在非端粒核酸.TS(5.AACCGTCGAGCAGT3T-)引物 3末端合成端粒重復(fù)序列，然后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行 PCRT增，石蠟層在高溫時(shí)溶化，CX 引物加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系中含有(a-32P)dGTP 或(a-32P) CTP 由于端粒酶每合成一個(gè) TTAGGG 就需要 RNA 模板重新定位，因2/ 3此，反應(yīng)產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳上顯示為相隔6bp 的梯狀條帶，TRAP 法由于利用 PcR 技術(shù)對(duì)端粒酶合成的端粒 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，因此能從 104 個(gè)正常細(xì)胞中檢出混雜在其中的一個(gè)腫瘤

4、細(xì)胞，這大大提高了檢測(cè)的敏感性、速度和效果。此方法較可靠，目前應(yīng)用最多。但 TRAP方法的缺點(diǎn)在于： 電泳結(jié)果與端粒酶活性程度呈非線(xiàn)性相關(guān)，使得測(cè)定端粒酶相對(duì)活性較困難； 8h 至兩天，時(shí)間太長(zhǎng)改進(jìn)法一：TRAP 銀染法們利用銀離子與 DNA 結(jié)合的原理，把 TrAP 反應(yīng)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行銀染顯示梯狀條帶，此方法的結(jié)果與同位素TRAP 方法一樣可靠、靈敏。法二：接近閃爍分析法為了解決聚丙烯酰胺凝膠電泳操作繁瑣等問(wèn)題，有人利用接近閃爍分析技術(shù)，在 96 孔板上進(jìn)行.TRAP 操作，使大規(guī)模篩選臨床標(biāo)本成為可能，其基本原理是將 CX 引物.5端用生物紊標(biāo)記，2siMe-3HTTP 取代

5、a 一 32PdGTR PcR 擴(kuò)增 31 個(gè)循環(huán)，吸取反應(yīng)物與鏈霉抗生素蛋白包被的液態(tài)微球相混合，由于生物素 3H 標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物與微球相結(jié)合，因此當(dāng)其接近反應(yīng)發(fā)生器時(shí)，能激發(fā)含有3H 的核酸液閃，從而產(chǎn)生信號(hào)，并由液閃3/ 3計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，未結(jié)合 3H 標(biāo)記的游離核酸其能量被吸收在分析緩沖液中，不能激發(fā)液閃，故不會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。xx：TRAPELISA&CTRAELISA 試劑盒）先擴(kuò)增，引物 TS 含生物素，擴(kuò)增產(chǎn)物與包被有親和素的微孔板結(jié)合，并與 含地高辛標(biāo)記的探針雜交，酶標(biāo)記抗地高辛抗體與之結(jié)合而顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定 結(jié)果，根據(jù)顏色的深淺進(jìn)行半定量分析。TrAP 的幾種方法的具體步驟我也有，但比較復(fù)雜，不好寫(xiě)出來(lái)，字母混亂