微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、*有限公司文件名稱文件編碼ZL-SOP-031-01微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程制定人日期審核人日期審核人日期批準(zhǔn)人日期頒發(fā)部門質(zhì)量管理科分發(fā)數(shù)量份生效日期分發(fā)部門：質(zhì)量管理科、中心化驗(yàn)室1 .目的：建立微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程， 規(guī)范微生物限度檢查法檢驗(yàn)操作， 保證檢 驗(yàn)的質(zhì)量。2 .范圍：適于本公司原輔料、成品的微生物限度的檢查操作。3 .責(zé)任：質(zhì)量管理科、中心化驗(yàn)室、檢驗(yàn)員。4 .檢驗(yàn)依據(jù)：中國藥典2015年版四部非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法操作方法。5 .內(nèi)容：需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)及大腸埃希菌檢測5.1 簡述需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是檢測非規(guī)定滅菌制劑及原、輔料受微生物污 染程度

2、的方法。也是用于評價(jià)生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、 環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)均采用平板菌落計(jì)數(shù)法，這是活菌計(jì)數(shù)的方法 之一，也是目前國際上許多國家常用的一種方法。以在瓊脂平板上的需氧菌、霉菌和酵母菌形成一個(gè)獨(dú)立可見的菌落為計(jì)數(shù)依據(jù)。該法測定結(jié)果只反映在該規(guī)定條件下所文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01生長的需氧菌、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。不包括對營養(yǎng)、氧氣、溫度、pH和其他因素有特殊要求的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。一個(gè)需氧菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一個(gè)或多個(gè)菌細(xì)胞生長繁殖而 成。因此供試品中所測得的菌落數(shù)，實(shí)

3、際為菌落形成單位數(shù)（colony forming unity , cfu ）,不應(yīng)理解為需氧菌、霉菌、酵母菌的個(gè)數(shù)。5.2 設(shè)備、儀器設(shè)備潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物限度檢查應(yīng)有單獨(dú)的潔凈實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)潔凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有獨(dú)立的凈化 空氣系統(tǒng)。結(jié)構(gòu)和要求潔凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采光良好、避免潮濕、遠(yuǎn)離廁所及污染區(qū)。操 作間與緩沖問之間應(yīng)有樣品傳遞艙，出入操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對。 潔凈實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墻壁與地面、天花板連接處應(yīng)呈凹弧形，無縫 隙，不留死角。操作間內(nèi)不應(yīng)安裝下水道。潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于 300LX溫度、濕度潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度應(yīng)控制在

4、1826C,相對濕度最好在40% 60%。操作間 操作間應(yīng)安裝空氣除菌過濾層流裝置。潔凈度不應(yīng)低于C級，局部潔凈度為A級（或放置同等級凈化工作臺）。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng) 保持對環(huán)境形成正壓，不低于10Pa,操作間與緩沖間也應(yīng)保持相對正壓。操作臺上 備有藥物天平，乙醇燈，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳頭等。緩沖間 緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆和無菌衣、帽、口罩、鞋套等。潔凈級別及檢查方法通常采用塵粒數(shù)及浮游菌數(shù)或沉降菌數(shù)測定法（參 照醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家 標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。 不同潔凈級別的微粒、浮游菌和沉降菌標(biāo)準(zhǔn)見下表 1。表1文件名稱微生物限度檢

5、查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01潔凈區(qū)微生物監(jiān)測的動(dòng)態(tài)標(biāo)準(zhǔn)如下：4清凈度皴別平浮游即 cfu/巾、沉降菌中 0f5 /4小時(shí)反表面微生物產(chǎn)接觸（然5時(shí)心北 /碟口5指手套 叁出/手妾/A敏w<1/<l¥<1B級產(chǎn)5 rW5C級一IOOp5 g2"P口如5 g一.表2:潔凈度靛別產(chǎn)懸浮粒子最大允許數(shù)/立方米4靜態(tài)/動(dòng)態(tài)券0.5壯腑>5. OU m1%法人5 |x舊尸>5. 0 * m/a皴%35202 O352 g20B級*，352 g2M352口。皿290加C霰C2死3中2。03D熟：35 和 QQ329UQg不作規(guī)定0不作規(guī)

6、淀沉降菌數(shù)測定（R法）?潔凈實(shí)驗(yàn)室操作臺消毒擦拭處理后，先啟動(dòng)層流凈化裝置30min,將備妥的營養(yǎng)胰酪大豆陳平板3個(gè)（經(jīng)3035c預(yù)培養(yǎng)48h,證明無菌落生長）。以無菌 方式（或經(jīng)傳遞箱）移人操作間，置凈化臺左、中、右各 1個(gè)，開蓋，暴露30min后 將蓋蓋上。在3035c培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48h,取出檢查。3個(gè)平板生長的平均菌落 數(shù)不超過1個(gè)。?操作間和凈化工作臺要定期檢測其潔凈度，分別應(yīng)達(dá)到C級和A級。如菌落數(shù)或微粒數(shù)超標(biāo)，應(yīng)清洗過濾系統(tǒng)中的過濾設(shè)施，必要時(shí)予以更換。?在每次操作前、后用0.25 %新潔爾滅溶液或5 %來蘇爾（甲酚皂）或其他適宜消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角，然后啟動(dòng)層流凈

7、化裝置。?陽性菌實(shí)驗(yàn)室涉及實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控菌株的分離鑒定、樣品陽性菌株的分離分析、方法驗(yàn)證試驗(yàn)中的陽性菌操作等實(shí)驗(yàn)活動(dòng)， 應(yīng)在專門的陽性菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 除另 有規(guī)定外，陽性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國家II級生物安全標(biāo)準(zhǔn)， 陽性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備生物安 全柜。陽性菌操作不得在供試品檢驗(yàn)用潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01潔凈實(shí)驗(yàn)室、陽性菌實(shí)驗(yàn)室與洗刷、滅菌、消毒、培養(yǎng)及結(jié)果觀察的工 作間等設(shè)施應(yīng)相對集中，布局合理，避免污染，便于管理。儀器恒溫培養(yǎng)箱（3035）、生化培養(yǎng)箱（2025C）、微波爐、勻漿儀（3000 8000 r /min）或康氏振蕩器、恒溫水浴、電

8、熱干燥箱（100300C）、電冰箱、離 心機(jī)、離心管、微孔濾膜及薄膜過濾器、蒸汽滅菌器（使用時(shí)要進(jìn)行滅菌效果檢查并 應(yīng)定期請有關(guān)部門檢定）。菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡（40X1500X）、電子天平或藥物天平（感量0.1g） , pH計(jì)。玻璃器皿 錐形瓶（250300ml、500ml內(nèi)裝玻璃珠若干）、培養(yǎng)皿（9cn）、 量筒（100ml, 500m1）、試管（18mrK 180mm 及塞、吸管（1m1 分度 0.0l , 10m1 分 度0.1 ）、注射器（20ml或30m1、涂布棒、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消 毒缸（帶蓋）、不銹鋼桶（帶蓋）。玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，吸管、量筒不掛水滴， 無殘留抗

9、菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管筒內(nèi)或 牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)， 尚需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時(shí)供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿， 均于160c干熱滅菌2h或高壓蒸汽121c滅菌30min,烘干備用。用具 大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%75%乙醇溶液浸泡）。無菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備 用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。 接種環(huán)（白鉞金或鍥銘合金，環(huán)徑4 5mm長度610cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅 菌銀子、滅

10、菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗 手盆、陶瓦蓋（12cm）、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。5.3 試液、稀釋劑和試劑試液0.25 %新潔爾滅溶液或5%來蘇爾（甲酚皂）（供洗手、擦拭操作臺面用）。 75%乙醇溶液。碘酊或碘伏溶液。稀釋劑和試劑稀釋劑配制后，采用高壓蒸汽滅菌法滅菌。0.9 %無菌氯化鈉溶液。文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01pH7.0無菌氯化鈉一蛋白凍緩沖液。無菌聚山梨酯80氯化鈉一蛋白凍緩沖液。無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液。pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液。5.4 培養(yǎng)基胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基。R2

11、 A瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基制備注意事項(xiàng)：采用干燥培養(yǎng)基，按說明配制，應(yīng)對滅菌后的培養(yǎng)基pH進(jìn)行校驗(yàn)。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測定，以確定配制時(shí)瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng) 為化學(xué)純以上。配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀。如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，滅菌后使用。培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的 2/3,以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子 必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落造成染菌。培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225C,防止被污染，可在3周內(nèi)用畢；保存 于密閉容器中，可在1月內(nèi)使用。制備好的培養(yǎng)基放置時(shí)間不宜過長，以免水分散 失及染菌。宜采用用水浴或微波爐加熱熔化瓊脂培養(yǎng)基，勿用電爐直接

12、熔化瓊脂培養(yǎng) 基，以免營養(yǎng)成份過度受熱而破壞。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng) 8h內(nèi)一次用完，剩余培養(yǎng)基 不宜再用。5.5 供試品抽樣、保存及檢驗(yàn)量抽樣一般采用隨機(jī)抽樣方法，其抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量的 35倍量（以備復(fù)試或 留樣觀察）。抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠罚瑧?yīng)選取有疑問的樣品。機(jī)械損傷、 明顯破裂的包裝不得作為樣品。文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01凡能從藥品外觀看出長蛾、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格品，無需再抽樣檢驗(yàn)。保存供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品 內(nèi)污染菌因保存條件不妥致死，損傷或繁殖。供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原

13、包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟。包裝已開啟的樣品不 得作為供試品進(jìn)行檢查。檢驗(yàn)量?純化水檢驗(yàn)量為10ml。?利福平檢驗(yàn)量為20g。（其中10g用于陽性對照試驗(yàn)）。5.6 試驗(yàn)準(zhǔn)備將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管（1ml、10m1、 量筒、稀釋劑等移至潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先做好計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠 用量，避免操作中出入潔凈實(shí)驗(yàn)室。編號后將全部外包裝（牛皮紙）去掉。開啟潔凈實(shí)驗(yàn)室空氣過濾裝置，并使其工作不低于 30min。操作人員用肥皂或適宜消毒液洗手， 進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用0.25% 新潔爾滅溶液或5%來蘇爾（甲酚皂）或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無菌 衣、帽、口

14、罩、手套。操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試 品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)銀或剪將供試品啟封。5.7 供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。液體供試品：取純化水10ml,加pH7.0無菌氯化鈉一蛋白凍緩沖液至 100ml,混勻，作為供試液。固體供試品： 取利福平10g,加pH7.0無菌氯化鈉一蛋白凍緩沖液至 100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為供試液。常用的方法如下：稀釋法 取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供 試品含量減少至不具抑菌作用。用平板法測定菌數(shù)時(shí)，1ml供試液可等量分注多

15、個(gè)平文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01皿；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的 制劑。薄膜過濾法 見需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。5.8 供試液的釋稀(10倍遞增稀釋法)取23支滅菌試管，分別加入9mlpH7.0氯化鈉蛋白凍緩沖液滅菌稀 釋劑(此時(shí)操作一般為：左手執(zhí)試管并將塞打開，傾斜，右手執(zhí) 10ml吸管吸量。切 勿在酒精燈火焰的正上方操作，以免火焰將供試液中的菌細(xì)胞殺滅)。加稀釋劑后， 試管案應(yīng)立即塞上。另取1支1ml滅菌吸管吸1:10均勻供試液1ml,加入裝有9mlpH7.0氯化 鈉蛋白凍緩沖液滅菌稀釋劑的試管中，混勻，即

16、得 1:100供試液。以此類推，根 據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1:103、1:104等適宜稀釋級。每遞增l稀釋級，必須另換一支吸管。稀釋時(shí)，吸管插入第 1級稀釋液內(nèi) 不低于液面2.5cm,反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許， 然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，吸管移至第2級稀釋管的內(nèi)壁近液面 處(勿接觸液面)緩慢地放出全部供試液(吸管內(nèi)應(yīng)無黏附或殘留液體)，然后將吸 管放入消毒液缸內(nèi)。5.9 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證由于某些供試品具有抗菌活性，在建立測定方法或原測定法的檢驗(yàn)條件發(fā) 生改變時(shí)，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠 性進(jìn)行驗(yàn)證。對各試驗(yàn)菌

17、的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證用菌株大腸埃希菌 Escherichia coli CMCC(B) 44102,金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CCMCC(B) 26003,枯草芽抱桿菌 Bacillus subtilis CMCC(B)63501,白色念珠菌 Candida albicans CMCC(F)98001, 銅 綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa CMCC(B)10104 , 乙型副傷寒沙門菌 Salmonella paratyphi CMCC(B)50094,黑曲霉 Aspergillus nigerCMCC(F)98003 菌液制備

18、 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、銅綠假單 胞菌、沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上， 3035c培養(yǎng)1824h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025c培養(yǎng)2448h。上述培養(yǎng)物用0.9 %無菌氯化鈉文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)57天,加入35ml含0.05 % (ml /ml聚山梨酯80 的0.9 %無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，用適宜方法吸出抱子懸

19、液至無菌試管 內(nèi)，用含0.05 % (ml/ml)聚山梨酯80的0.9 %無菌氯化鈉溶液制成每1ml含抱子 數(shù)50l00cfu 的抱子懸液。菌懸液制備后，若在室溫下放置應(yīng)在 2h內(nèi)使用，若保存在28 c的菌懸 液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉菌的抱子懸液保存在 28C,可在驗(yàn)證過的貯存期 內(nèi)替代對應(yīng)量的新鮮抱子懸液使用。驗(yàn)證方法 驗(yàn)證試驗(yàn)分4組，至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì) 算供試品組和對照組試驗(yàn)的菌回收率。供試品組 取最低稀釋級的供試液，按每1ml供試液加入50l00cfu試 驗(yàn)菌，按菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌數(shù)。平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)菌液、供試液各1ml分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基；

20、薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取供試液2ml過濾，沖洗液沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌?；罹M取上述試驗(yàn)菌液，測定其加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。供試品對照組 取最低稀釋級的供試液1ml,按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品 本底菌數(shù)。稀釋劑對照組為考察供試液制備過程中對微生物影響的程度，可用相應(yīng) 的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml含50l00cfu ,按供試品組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌數(shù)。結(jié)果判定對照組的菌回收率均應(yīng)不低于 70%。若供試品組的菌回收率均不 低于70%,則可按該供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)法測定供試品純化水的需氧菌總數(shù)， 利福平的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)總數(shù)和大腸埃希菌數(shù)

21、；若任一次試驗(yàn)中供試品 組的菌回收率低于70%,應(yīng)建立新的方法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的需氧菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)及大腸埃希菌數(shù)同時(shí) 進(jìn)行。注意事項(xiàng)所用標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代次數(shù)不得超過 5代。以冷凍干燥的原始菌種開啟后 轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，其培養(yǎng)物為第一代。文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01黑曲霉菌的菌液制備將黑曲霉菌接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于2025c培養(yǎng)57天，使大量的抱子產(chǎn)生。加入 35ml含0.05 % （ ml/m1）聚 山梨酯80的0.9 %無菌氯化鈉溶液，用無菌玻棒或接種環(huán)輕輕將抱子洗脫。然后可 用一支10ml無菌球形毛細(xì)吸

22、管，其管口用無菌棉花或紗布包扎且能過濾菌絲的裝置， 吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，將抱子懸液稀釋至每毫升含50100cfu。做試驗(yàn)菌的回收率試驗(yàn)時(shí)，加入菌量 50100cfu為宜。加菌量過多，如 薄膜法，菌落擁擠，則不好計(jì)數(shù)；加菌量過少，則誤差較大。進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，若因沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導(dǎo)致微 生物回收的失敗，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。此時(shí)更高稀釋級供試液的確認(rèn)要從低往高的稀釋級進(jìn)行，但最高稀釋級供試液選擇應(yīng)根據(jù)供試品應(yīng)符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，如供試品應(yīng)符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是1克細(xì)菌數(shù)不得過1000cfu,那么最高稀釋級是1:10-3。

23、若采用允許的最高稀釋級供試液進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)還存在一株或多株試驗(yàn)菌 的回收率達(dá)不到要求，那么應(yīng)選擇回收情況最接近要求的方法進(jìn)行供試品的檢測。如某種產(chǎn)品對某試驗(yàn)菌有較強(qiáng)的抑菌性能，采用薄膜過濾法的回收率為40%,而采用培養(yǎng)基稀釋法的回收率為30%,那么應(yīng)選擇薄膜過濾法進(jìn)行該供試品的檢測。在此 情況下，生產(chǎn)單位或研制單位應(yīng)根據(jù)原輔料的微生物質(zhì)量、生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特性進(jìn)行 產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評估，以保證檢驗(yàn)方法的可靠性，從而保證產(chǎn)品質(zhì)量。5.10 檢查法平皿法在上述進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級吸管，吸取該稀釋級供試 液各1ml至每個(gè)直徑90mm勺滅菌平皿中，或從高稀釋級至低稀釋級吸液時(shí)可用 1支 吸管吸供

24、試液各1ml至每個(gè)滅菌平皿中。每一稀釋級每種培養(yǎng)基至少注23個(gè)平皿（一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注皿時(shí)，將 1ml供試液慢慢全部 注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。陰性對照： 待各級稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管吸取試驗(yàn)用稀 釋劑（pH7.0氯化鈉蛋白月S緩沖液）各1ml,分別注入6個(gè)平皿中。其中2個(gè)作需 氧菌數(shù)陰性對照；2個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對照，另2個(gè)作大腸埃希菌數(shù)陰性對照。文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01傾注培養(yǎng)基：將預(yù)先配制好的需氧菌計(jì)數(shù)用的胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基;霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基； 大腸埃希

25、菌計(jì)數(shù)用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基熔 化，冷至約45c時(shí)，傾注上述各個(gè)平皿約15ml,以順時(shí)針或反時(shí)針方向快速旋轉(zhuǎn)平 皿，使供試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻，蓋上陶瓦蓋，或半蓋蓋，除去冷凝水后，再移 去陶瓦蓋后，蓋上平皿蓋置操作平臺上待凝。在旋轉(zhuǎn)平皿時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及 皿蓋上。培養(yǎng) 需氧菌計(jì)數(shù)平板倒置于3035c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3大。霉菌、酵母 菌計(jì)數(shù)平板倒置于2025c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天,必要時(shí)延長至7天。大腸埃希菌計(jì) 數(shù)平板倒置于3035c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。逐日觀察菌落生長情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。菌落計(jì)數(shù)?一般將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)

26、和平皿邊緣生長的菌落。注意需氧菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之間，以及菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、 油滴等的區(qū)別。必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察，或挑取可疑物涂片鏡檢。?供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點(diǎn)計(jì)在需氧菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定， 并須觀察菌落特征及染 色形態(tài)。?若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以 2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)；若平板生長有鏈狀或片狀、云霧狀菌落，菌落間無明顯界線，一條鏈、 片作為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈、片上出現(xiàn)性狀與鏈、片狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng) 分別計(jì)數(shù)，若生長蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落

27、， 其外緣有若干性狀相似的單 個(gè)菌落，一般不宜作為計(jì)數(shù)用。?菌落生長呈蔓延趨勢者，需氧菌需在 24h ,霉菌需在48h做初步點(diǎn)計(jì)（點(diǎn)計(jì)霉菌菌落時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)平板，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)，否則使早期形成的抱子散落在平板的其 他部位，又萌生新的霉菌菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差）。在培養(yǎng)3大點(diǎn)計(jì)需氧菌，培養(yǎng)5大點(diǎn)計(jì)霉菌時(shí)，如菌落極小，不易辨認(rèn)，需 氧菌計(jì)數(shù)可延長培養(yǎng)時(shí)間至5天。在特殊情況下，若胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上長有 霉菌和酵母菌、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上長有需氧菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、 需氧菌菌落數(shù)。然后將胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或沙氏葡萄糖瓊脂文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP

28、-031-01培養(yǎng)基上的需氧菌數(shù)，與沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或胰酪大豆陳瓊 脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)多的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。大腸埃希菌檢查確認(rèn)：稱取利福平 10g,加入PH7.0無菌氯化鈉-蛋白陳緩沖 液至100ml混勻，量取1ml接種到9ml胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中，混勻，3035c 培養(yǎng)24小時(shí)。取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244c培養(yǎng) 48小時(shí)。用接種環(huán)挑取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平皿上， 3035c 培養(yǎng)48小時(shí).每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備3個(gè)平板。觀察是否有菌落生長觀察有無鮮桃紅色或微紅色、中心深桃紅色、圓形、扁

29、 平、邊緣整齊、表面光滑、濕潤的菌落形成。若有，挑取34個(gè)疑似大腸埃希菌菌落，分別接種在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上 在35c下培養(yǎng)1824h,進(jìn)行純培養(yǎng)。將疑似大腸桿菌的培養(yǎng)物涂片進(jìn)行革蘭染色，經(jīng)鏡檢證明為G-無芽抱短桿菌的，應(yīng)繼續(xù)做生化試驗(yàn)。生化試驗(yàn)?發(fā)酵試驗(yàn)將上述純培養(yǎng)物接種在乳糖發(fā)酵管中，在 35 c下培養(yǎng)2448h。凡大腸埃希菌， 可發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。?靛基質(zhì)試驗(yàn)將上述純培養(yǎng)物接種在蛋白陳水培養(yǎng)基中，在35c下培養(yǎng)(48 ± 2)h .加入0.30.5mL靛基質(zhì)試液(對二甲基氨基苯甲醛)，觀察液面。液面呈玫瑰紅色為陽性反應(yīng)， 呈試劑本色為陰性反應(yīng)。?甲基紅試驗(yàn)將純培養(yǎng)物接種在磷酸鹽

30、葡萄糖陳水培養(yǎng)基內(nèi)， 在35 c下培養(yǎng)(48 ±2)h，在1ml 培養(yǎng)液中加入l滴甲基紅試劑，立即觀察結(jié)果。呈鮮紅色或橘紅色為陽性反應(yīng)。 呈黃 色為陰性反應(yīng)。?乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(VP試驗(yàn))將純培養(yǎng)物接種在磷酸鹽葡萄糖陳水培養(yǎng)基內(nèi)，在37c下培養(yǎng)(48 ± 2)h ,在2mL培養(yǎng)液中加入a一蔡酚乙醇液 1mL混勻，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 40%的氫氧化鉀溶液 0.4mL后觀察結(jié)果。培養(yǎng)液應(yīng)在加入試劑后的 4h內(nèi)呈紅色為陽性反應(yīng)，無紅色為陰文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01性反應(yīng)。?枸檬酸鹽利用試驗(yàn)將純培養(yǎng)物接種在枸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上,在37c

31、下培養(yǎng)（48 ± 2）h,觀察結(jié)果。 斜面有菌生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性反應(yīng)， 斜面無菌生長培養(yǎng)基仍呈綠色為 陰性反應(yīng)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則?宜選取需氧菌、酵母菌平均菌落數(shù)小于 300cfu、霉菌菌落數(shù)平均數(shù)小于100cfu的平板計(jì)數(shù)作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。? 當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級的平均菌落數(shù)乘以稀釋 倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)有2個(gè)或2個(gè)以上稀釋劑的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以最高的平均 菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)值的值報(bào)告。?如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均茵落數(shù)小于1時(shí)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示例見下表2o

32、表2:需氧數(shù)報(bào)告規(guī)則示例規(guī)則示例各稀釋級（供試液1ml/皿）平均菌落計(jì)數(shù)（cfu ）菌數(shù)報(bào)告數(shù)，-2Cfu/g,ml,10cm原液1:10 ( 1)_ 2 ,一、1:10 (-2)31:10 (-3)16482640242064864003/、口計(jì)4206464000400.50<100500<1006000<107000<1薄膜過濾法薄膜過濾法主要起到富集微生物、分離去除樣品中對微生物生長產(chǎn)生干擾的因素的作用，可以有效提高檢查結(jié)果的靈敏度和可靠性， 是近年來微生物檢查領(lǐng) 域中日益廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)手段。文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-

33、01薄膜過濾法采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45um。濾膜直彳一般為50mm為 便于計(jì)數(shù)，以及減輕供試液堵塞濾膜的情況， 在便于操作的前提下，可以選用直徑更 大的濾膜或薄膜過濾器。采用不同直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜 材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用 適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。液體供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。供試液經(jīng)薄膜過濾 后，需要用沖洗液沖洗濾膜，以濾膜直徑為 50mm勺濾膜計(jì)，每張濾膜每次沖洗量不 超過100ml,總沖洗量不得超過1000ml;其他直徑的濾膜及薄膜過濾器可按膜面積比 例調(diào)整

34、，總的原則是避免大體積、過高流速的沖洗造成濾膜上的微生物受損傷。取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混 勻，過濾。若供試品每1g、1ml所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級的供試液 1ml, 過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，及沖洗 后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸 出粉陳葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板 上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長。陰性對照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml照上述薄膜過濾法操作，作為陰性 對照。陰性對照不得有菌生長。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)

35、條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超 過 100cfu。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于1g、1ml或10cm 2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)； 若濾膜上無菌落生長，以 1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品）， 或1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。培養(yǎng)基稀釋法 取低稀釋級供試液（原液或1:10供試液或其他供試液）2 份，每份各1ml,分別注入平皿中（每皿 0.5ml、0.2ml或 0.2m1）,每1個(gè)平皿 傾注胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基約 15ml20ml,混勻，凝固后， 倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。 每份供試液所加注平板點(diǎn)計(jì)的菌落之和，即為每 lml菌落數(shù)，共 得2組數(shù)據(jù)。以

36、2份低稀釋級供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。結(jié)果報(bào)告菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告。文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理復(fù)試 供試品需氧菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)其中任一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合格，應(yīng) 從同一批樣品中隨機(jī)重新取2倍的供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩次，以三次檢驗(yàn)結(jié)果 的均值報(bào)告。若3次結(jié)果的平均值超過該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定； 否則，判供試品符合規(guī)定。注意事項(xiàng)菌落計(jì)數(shù)測定每計(jì)數(shù)單位（每皿或每膜）的最適計(jì)數(shù)范圍不宜過低，通常 每計(jì)數(shù)單位不應(yīng)少于25cfu ,低于這一限度越多誤差越大，

37、故應(yīng)根據(jù)實(shí)際微生物限度 標(biāo)準(zhǔn)和污染程度確定適宜的供試液稀釋級數(shù)和計(jì)數(shù)測定方法。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)限度過低或因?yàn)椴僮餍枰┰嚻废♂尦潭冗^高，可以取較大體積供試液通過薄膜過濾法富集計(jì)數(shù)測 定。不同限度標(biāo)準(zhǔn)宜采用的供試液稀釋級及對應(yīng)宜采用的計(jì)數(shù)測定方法見下表3。表3:不同限度標(biāo)準(zhǔn)宜采用的供試液稀釋級及對應(yīng)宜采用的計(jì)數(shù)測定方法限度標(biāo)準(zhǔn) -/ -2cfu / g, ml, 10cm一般23個(gè)供試液稀釋級對應(yīng)宜選用的計(jì)數(shù)測定方法原液1:10 (-1 )1:102 (-2)1:103 (-3)1:104 (-4)<1010100 1000 10000 100000 :平皿法（供試液體積：1ml/皿）；:平皿法（培

38、養(yǎng)基稀釋法供試液體積： 1ml/皿）；:薄膜過濾法（供試液體積可以比較靈活）。文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01供試品檢驗(yàn)全過程必須符合無菌技術(shù)要求。使用滅菌用具時(shí)，不能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過 1h。否則，可能導(dǎo)致微生物 繁殖或死亡而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。供試液稀釋及注皿時(shí)應(yīng)取均勻的供試液，以免造成實(shí)驗(yàn)誤差。為避免細(xì)菌菌落蔓延生長，宜采取下列方法處理：? 開蓋干燥 將已凝固的瓊脂平板開蓋，倒置斜放于凈化工作臺上，開機(jī)12h 后合蓋，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5.11檢驗(yàn)報(bào)告書寫本品按中國藥典20105年版四部微生

39、物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，結(jié)果符 合或不符合規(guī)定。6 .文件變更歷史：編號修訂簡述生效日期7 .附件：附件1:微生物限度檢驗(yàn)原始記錄附件2:潔凈室（區(qū)）沉降菌測試記錄附件3:潔凈室（區(qū)）表面微生物測試記錄附件4:潔凈室（區(qū)）浮游菌測試記錄附件5:空氣潔凈度測試報(bào)告文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SOP-031-01附件1:微生物限度檢驗(yàn)原始記錄ZL-JL-087-00名稱純化水批號來源檢驗(yàn)依據(jù)中國約典2010年版二部收驗(yàn)日期年月日報(bào)告日期4#月日薄膜過濾法檢查需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)：細(xì)菌總數(shù)檢查：胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)基批號：培養(yǎng)溫度（3035 C）：C培養(yǎng)時(shí)間（3天）： 月 日 時(shí)至 月 日時(shí)霉菌和醉母菌總數(shù)檢查：沙氏葡荷糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基，培養(yǎng)基批號：培養(yǎng)溫度（2025C）：C培養(yǎng)時(shí)間（5天）：月 日 時(shí)至 月 日時(shí)供試液制備：取樣品ml_ ，溶于qPH7.0 氯化鈉一蛋白凍緩沖液中制成1:10的供試液項(xiàng)目 取樣"需氧菌總數(shù)培養(yǎng)霉菌和醉母菌總數(shù)培養(yǎng)需氧菌、毒菌 酵母菌總數(shù)（個(gè)/ml）結(jié) 論12平 均12平均總進(jìn)水口純化水儲罐總回水口女一更男一更洗衣間工具清洗1器具清洗1混合內(nèi)包間離心過濾問干燥問工具清洗2器具清洗2陰性對照陽性對照：復(fù)核人：檢驗(yàn)人:第15頁 共20頁*有限公司文件名稱微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼ZL-SO