免疫組化全過程

1、組織取材組織取材順序據(jù)動(dòng)物死后組織結(jié)構(gòu)改變的速度的快慢來定如消化管 一肝脾等多血期管及神經(jīng)組織 一*其他組織.（消化管在血液循環(huán)停止后，黏膜很快發(fā)生自溶現(xiàn)象）.取材大?。呵腥〗M織小而薄,以2 X1.5 xo.3cm為佳管狀臟器取材：輸尿管、輸精管、動(dòng)靜脈、神經(jīng)、脊髓等應(yīng)取1-1.5cm長分段固定。最好先平攤在吸水紙上再固定，以防因固定劑的作用而變形。組織固定組織固定越新鮮越好，最好在離體后30s-1mi n;固定組織塊不宜過大，一般以 0.5 X0.5 X0.3cm為好；固定時(shí)間一般不超過 24h （厚度不超過4mm ），固定后的組織可暫保存于 70 %酒精 中。固定液的量與組織比為20:1甚

2、至30:1 ;固定液有：10 %中性福爾馬林固定液；95 %乙醇；丙酮；10%醋酸；2.5 %重鉻酸鉀; 多聚甲醛固定液；其中10 %中性福爾馬林固定液和多聚甲醛固定液在我實(shí)驗(yàn)室最常 用。10 %中性福爾馬林固定液：多聚甲醛固定液甲醛溶液（37 % -40 %）100ml多聚甲醛4g蒸餾水900ml蒸餾水100ml=磷酸二氫鈉3.5g磷酸二氫鈉3.5g溶液磷酸氫二鈉6.5g磷酸氫二鈉6.5 gJ固定、脫水、透明（二院人類組織參數(shù)）甲醛（I）2h k 甲醛（）2h 85%酒精40mi n 85 %酒精40mi n-90%酒精 40mi n5%酒精40min5%酒精 30mi n100 %酒精 1

3、h 一 00 %酒精 1h 一二甲苯（I）30mi n 二甲苯（D）30min 二甲苯（川） 1h * 浸蠟（I）30min * 浸蠟（） 1h *浸蠟（川）1h;包埋步驟 準(zhǔn)備包埋蠟：一般應(yīng)用硬蠟（5658 C或6062 C）為好，所用的石蠟要求透明無 雜質(zhì)，新的石蠟要反復(fù)熔凝，并有一定的粘韌性，可以加一些蜂蠟。蠟的熔點(diǎn)應(yīng)與組織的硬度相適應(yīng)。包埋用過的石蠟可以反復(fù)使用。 準(zhǔn)備包埋框：可以用金屬的，也可以用硬紙摺疊。 點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好無齒尖鑷子，需作標(biāo)記應(yīng)先寫好標(biāo)簽。 在金屬框中倒入硬蠟，然后用無齒鑷子取組織塊放入石蠟中，置好方向。可室溫下 冷卻。 包埋框或紙盒內(nèi)的蠟逐漸凝結(jié)，若表面已凝結(jié)形

4、成一層固體狀，即可放入冷水中， 加速其凝固。 待蠟塊完全凝固以后，便可拆卸包埋框架，或拆開紙盒，取出蠟塊。注意事項(xiàng) 包埋時(shí)夾取組織的鑷子，用酒精燈隨時(shí)燒熱，以免石蠟?zāi)Y(jié)后粘附在鑷子上，造成 蠟塊凝固不均勻。 包埋操作要迅速，組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時(shí)間應(yīng)盡量縮短 包埋后的蠟塊應(yīng)呈均質(zhì)半透明狀，如果出現(xiàn)白色混濁狀，一般出現(xiàn)在組織周圍或組 織的底部，應(yīng)考慮這樣幾個(gè)方面的問題： a.脫水不徹底。b.包埋蠟溫度低了，組織進(jìn) 行包埋時(shí)，包埋框中的蠟已成凝結(jié)狀。 c組織內(nèi)還殘留有較多的透明劑， d.石蠟不純 包埋箱中的溫度必須保持恒定。 如包埋得不好，可將蠟塊溶化，重新浸蠟和包埋切片、貼片與烤片均

5、在中心實(shí)驗(yàn)室有專門老師操作。注：在切片前要將蠟塊在-20度冰箱中至少放置30min，以增加硬度?？酒瑴囟纫诉x擇 58-60度的恒溫箱中2-4h。免疫組化步驟（有兩步法和三步法，我實(shí)驗(yàn)室常用ABC法，以下為ABC法。）二甲苯（I）10min k 二甲苯（） 10min 二甲苯（川） 10min 0 %酒精（I） 10min 一 00 %酒精（） 10min 5 %酒精 5min 一 5 %酒精5min 5 %酒精 3min 蒸餾水 10mi n 檸檬酸高壓抗原修復(fù) 3mi n pbs洗3 X5min 加A液（過氧化氫酶阻斷劑）30min 37 度 （擦凈周圍組織液體）I阻斷非特異（濕盒預(yù)熱）pb

6、s洗3 X5min 力口 B液（與二抗來源相同的動(dòng)物非免疫血清或5 % BSA）（擦凈周圍組織液體）30min 37度 加一抗（抗體完全覆蓋組織）4度過夜 次日,取出復(fù)（甩掉B液）溫 Pbs 洗 3 X5min * 加 C 液（二抗） 30min 37 度一pbs 洗 3X5min（擦凈周圍組織液體）*加D液（鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶）30min 37度 一pbs洗3 X5min（擦凈周圍組織液體）k DAB顯色3min 自來水終止顯色一蘇木素染核 8min 鹽酒分化30s *（沖掉殘液）碳酸鋰返藍(lán) 5min 自來水沖洗5min 一 梯度酒精過一遍（約 30s） 100 %酒精(I)(n)各

7、 5min 一二甲苯(I)(H)各 5min 一 中性樹膠封片，平置 1-2 天。載玻片處理：將載玻片置入鉻硫酸過夜，次晨用水沖洗，放入烤箱中烘干待用；涂多聚賴氨酸：1.將濃縮型多聚賴氨酸稀釋為即用型，比例1:10 ；2. 將即用型的多聚賴氨酸滴一滴在載玻片上，再取一張載玻片，兩張 載玻片正面相互輕輕一摩擦就均勻涂好了；或?qū)⑤d玻片浸在即用型 多聚賴氨酸中5min即可；3. 放入烤箱中烘干待用。抗原修復(fù)方法有 水浴法、高壓法、微波法。我實(shí)驗(yàn)室常用高壓法。檸檬酸抗原修復(fù)步驟：1. 取適量的檸檬酸抗原修復(fù)液(800-1500ml ;稀釋比為1:250 )于壓力鍋中，將壓力鍋置于電磁爐上，大功率加熱至沸騰.2. 將切片置于耐高溫塑料染色架上