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文檔簡介
1、題目:目的基因雙酶切和電泳純化膠回收一. 實驗?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)雙酶切法獲取目的基因片段的原理和方法;2. 練習(xí)DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。3. 學(xué)習(xí)核酸瓊脂糖膠回收的原理和方法。二. 實驗原理1. 限制性核酸內(nèi)切酶:生物體內(nèi)能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。由于這種切割作用是在 DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的,故名限制性內(nèi)切酶(簡稱限制酶)。2. 切割序列:(1) Bam HI切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端:5' ? G J GATCC? 3' 5'? G GATCC?3'3' ? CCTAGt G ? 5' 3'? C
2、CTAG G?5'(2) Eco R I切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端:5' ?GJ AATTC?3' 5' ?G AATTC?3'3' ?CTTAAf G ?5' 3'? CTTAA G?5'3. 為什么要選擇表達(dá)載體質(zhì)粒 pET-28a ?pET原核表達(dá)質(zhì)粒是最有效的原核表達(dá)系統(tǒng)之一。目的基因被 克隆到pET質(zhì)粒載體上,受噬菌體 T7強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制;表 達(dá)由宿主細(xì)胞提供的 T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。宿主菌帶有受lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因,可以通過IPTG來啟動表達(dá)。充分誘導(dǎo)時,幾乎所有的細(xì)胞資源都用
3、于表達(dá) 目的蛋白;誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾小時,目的蛋白通??梢哉嫉郊?xì)胞總蛋 白的50%以上。4. 限制性內(nèi)切酶的選擇:選擇BamHI、Notl兩個位點由于實驗中須將質(zhì)粒 pEGFP-N3上所需的目的基因切下并連接到 載體質(zhì)粒pET-28a上,所以選擇的限制酶需滿足以下幾個要求:一. 選擇兩種在質(zhì)粒 pEGFP-N3和載體質(zhì)粒pET-28a上都有酶切 位點的限制性酶切酶,以保證切下的目的基因和載體質(zhì)粒分別都 有兩個不同的末端,這樣可以防止:(1) 質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化;(2) 質(zhì)粒與質(zhì)粒、目的基因與目的基因相互自身連接;(3) 質(zhì)粒與目的基因反向連接)二. 兩種限制性內(nèi)切酶的酶切位點需滿足:(1)
4、不破壞目的基因;(2) 在質(zhì)粒pEGFP-N3和載體質(zhì)粒pET-28a上都有且只有一 個酶切位點;(3) 在載體質(zhì)粒上的切割位點距離盡量短些,并且不破壞載體質(zhì)粒的啟動子等關(guān)鍵序列。載體質(zhì)粒pET-28a和質(zhì)粒pEGFP-N3的酶切位點示意圖:&W Ilk ?'. > I ! a'l £*|片+血IQi I#b<17i .Eu 14 331唱.一巒+Xh# I門亦Hind3 IjlTW缽 l<|M| 日tp k-faiNta Ipji:Nd» Inv- IM* Ijh.IlHWni W*iHt1CM»Ejod&Z b
5、piwt-;-Ad ATM EM*Bus ii.rI g :氐*刊.廠r呂J MM 9忙*Tlhlll I.J1MI藝陌I .供坤 PtpG lluai圖一、pET-28a的酶切位點示意圖圖二、質(zhì)粒pEGFP-N3勺酶切位點示意圖HlW1E51671 EGFP'伽 B刪HIXm II Bsp2i I 加 I 加II 伽I0 AGATCTCGAGCAAGCTTCGAATTCT GCA GTCGAC GGTACC GCGGGC CCG GGA TCC ATC GCC ACCATG GTG fiffHTXho Hi/iillil Ml P$t Sa/1如 |&/I36II圖三、pEG
6、FP-N3 MCS多酶切位點示意圖5. 瓊脂糖凝膠回收(1 )在酶切的過程中,除產(chǎn)生我們所需要的目的片段外,還會產(chǎn)生一些小片段,這些小片段可能會與載體連接,從而產(chǎn)生干擾,去除這些小片段的最好方法就是進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳;(2)不同分子量 的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳中 由于泳動速度 不一 樣而分離,通過回收可用于后續(xù)實驗;(3) 本次實驗 使用試劑盒 進(jìn)行膠回收,按說明書進(jìn)行操作,可以用溶劑使瓊脂糖融化,再經(jīng)過吸附管吸附目標(biāo)DNA沖洗,溶解后得到高純度的目的基因片段。(4) 硅膠樹脂在高鹽離子濃度下可以高效專一的吸附DNA通過離心可將DNA片段沉淀下來,在堿性低鹽濃度下其與DNA的結(jié)合能力會急劇
7、降低,使用弱堿溶液如 TE (pH8.0 )等可以從硅膠離心柱洗脫得到 純凈的DNA片段;三. 實驗材料及設(shè)備1. 實驗材料:已經(jīng)提取好的PEGFP-N3質(zhì)粒,1.5ml塑料離心管若干,EP管架,微量取液器和取液器吸頭,常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒、試劑瓶等),錐形瓶,一次性手套2. 實驗儀器:(1) 恒溫?fù)u床,高壓滅菌鍋,超凈工作臺,10、100、1000卩L取液 器各一支,移液槍頭若干,臺式高速離心機,制冰機,漩渦器;(2) 電泳儀,電泳槽,樣品槽模板(梳子),有機玻璃內(nèi)槽,水平儀, 取液器,微波爐,凝膠成像系統(tǒng)。3. 實驗試劑:(1) 目的基因的雙酶切a. 核酸外切酶:Not I Bam
8、 H I酶(置于冰盒中)b. 10X buffer(with BSA) , ddH2O(2) DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測與純化a. gene Green( DNA染 料)b. 1 x TAE緩沖液c. 上樣緩沖液(6Loading Buffer )(3) 膠回收目的基因片段a.膠回收試劑盒一套,ddH2O四. 實驗方法及步驟1. 目的基因雙酶切a) 分別取兩支0.2mlEP管做上記號:如;EP管EP管10 x buffer2卩L /10x buffer2卩L /(with BSA)3 卩 l + 3 卩 l ddl12Oth BSA)3 卩 l + 3 卩 l ddNot I1卩LNot I1卩
9、LBam H I2 卩 L / 2(1LBam H I2 卩 L / 2(1LpET-28a15 卩 L / 20(1LPEGFP-N315 卩 L / 20(1Lb)兩個EP管中分別配置下列的 20 (老師提供)/30卩L(自提)體 系:(本次實驗使用20卩L體系)c)將兩只EP管混勻后瞬時離心,放入恒溫培養(yǎng)箱37度酶切1h;d)酶切體系(20 卩 L+4 卩 I Loading Buffer/ 30 卩 L+6 卩 I LoadingBuffer )全部加入點樣孔進(jìn)行電泳(自行配制40ml 1%電泳凝膠液做膠),Marker DNA加5卩l(xiāng),電泳結(jié)束后對目的基因片段進(jìn)行 膠回收。切膠前請先
10、稱量裝膠的1.5ml離心管重量并做記錄,標(biāo)記好離心管,裝膠后在進(jìn)行稱量,算出膠的重量;e)切膠時,帶好護(hù)目鏡。在紫外線燈照射下清晰可見目的基因片段,亮度較高,邊際清晰,回收得到含有目的基因片段的瓊脂膠,稱 重。f)按照回收試劑盒步驟切膠回收所需目的基因片段;g)將提取好的目的基因上交保存;2. DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測a)瓊脂糖凝膠板的制備b)稱取0.3g瓊脂糖,置于錐形瓶中,加入 30mL1x TAE緩沖液,微 波爐加熱直至瓊脂糖溶解;c)待膠液冷卻到65度(不燙手為宜),加入1卩L Gene green混勻, 攪拌器上攪拌排除氣泡,緩慢倒入事先準(zhǔn)備的制膠有機玻璃槽(插入樣品槽模板梳子)內(nèi),
11、靜置30min左右,輕輕晃動拔出梳子;3. 加樣酶切體系(20 卩 L+4 卩 I Loading Buffer/ 30 卩 L+6 卩 I Loading Buffer )全部加入點樣孔進(jìn)行電泳(自行配制40ml 1%電泳凝膠液做膠),Marker DNA加5卩l(xiāng)4. 電泳將電泳槽與電泳儀接通,調(diào)節(jié)電壓為100V左右,直至緩沖液的藍(lán)色指示劑移動到距離膠板邊沿約12cm處,停止電泳。5. 觀察和拍照將膠板小心取出,放入凝膠成像系統(tǒng)中,調(diào)節(jié)位置居中,波長為 254nm的紫外燈下,觀察凝膠中 DNA存在處顯示出熒光條帶。五. 實驗結(jié)果A 帶:15000bppEGFP-N3目的基因片段B 帶 lOO
12、OObpC 帶 7500bpD 帶 5000bpE 帶 3000bpF 帶 lOOObpG 帶 250bp圖1雙酶切體系處理pEGFP-N3與pET-28a質(zhì)粒凝膠電泳紫外熒光檢測結(jié)果說明:從左到右依次為:pET-28a、pEGFP-N3、DL15000Maker、pEGFP-N3、DL15000Maker由圖可知,pEGFP-N3泳道呈現(xiàn)為十分清晰的雙條帶,上部為酶切 后的pEGFP-N3質(zhì)粒,下部為目的基因片段,無拖影,無雜帶,說明 目的基因純度較高,數(shù)量較多,前一實驗提取的質(zhì)粒純度較高。與 Marker比照,酶切理論上會產(chǎn)生約4000bp和約800bp的條帶,預(yù)期分子量基本符合對應(yīng)的分子
13、量條帶,實驗結(jié)果較好。pET-28a泳道共產(chǎn)生了四條條帶,除了最上層清晰的5000bp條帶,還應(yīng)該出現(xiàn)30bp的條帶,但該條帶由于分子量太小,很有可能 已經(jīng)脫出瓊脂膠,無法在結(jié)果上顯示,所以另外的三個條帶推測為前 一次實驗提純質(zhì)粒時混入的RNA或其他雜質(zhì)。切膠時,帶好護(hù)目鏡。在紫外線燈照射下清晰可見目的基因片 段,亮度較高,邊際清晰,回收得到含有目的基因片段的瓊脂膠,稱 重結(jié)果為約1.1g。膠回收完成后,得到少量溶有目的基因片段的PE管一支。六. 結(jié)果討論與結(jié)論:1. 實驗結(jié)論:根據(jù)瓊脂糖電泳紫外熒光檢測結(jié)果可見,各泳道拖影現(xiàn)象不明 顯,pEGFP-N3泳道條帶清晰,無扭曲現(xiàn)象,無雜帶,酶切結(jié)
14、果較 好;pET-28a泳道由于只是切開一個缺口,理論上只應(yīng)該有一個清晰 條帶,實驗結(jié)果符合預(yù)期。和Marker對照分子量符合理論結(jié)果,實驗結(jié)果良好,可繼續(xù)用于下一次實驗。2. 討論一:影響酶切效率的因素有哪些?答:DNA的質(zhì)量,限制性內(nèi)切酶活性,酶的用量,酶切時間,酶切溫度,緩沖液的條件3. 討論二:在實驗操作中,取用酶試劑時操作應(yīng)注意哪些方面?答:(1)放在冰上使用,讓酶一直處于低溫環(huán)境,保持活性;(2)取用不同的酶時要換新槍頭,不要污染酶試劑。4. 討論三:實驗操作中,怎樣能使微量的試劑混合均勻?答:(1)加入試劑時,盡量在管底部加入;(2)可進(jìn)行瞬時離心。5. 討論四:本次實驗酶切結(jié)果較好,可能是哪些原因?答:(1)在酶切之前,輕柔混勻酶與質(zhì)粒多次, 加快反應(yīng),提高效率;(2)適當(dāng)延長酶切的時間,保證反應(yīng)的完成度。(3)前一次提取的質(zhì)粒數(shù)量和質(zhì)量較高, 提高了本次實驗的成功率。6. 討論五:膠回收時的注意事項?(1)檢測時用小梳子,減少損耗(2)回收提純時用大梳子,提高效率(3)稱取膠的重量,是為了確定 PC溶液的質(zhì)量,避免浪 費和其他不可預(yù)知的影響。(4)用平衡液處理吸附柱,直接影響后續(xù)的實
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