第八章分子標(biāo)記及其應(yīng)用

1、第八章 分子標(biāo)記及其應(yīng)用1) 分子標(biāo)記的種類與特點(diǎn)1. 遺傳標(biāo)記的種類與特點(diǎn)遺傳標(biāo)記：指可以穩(wěn)定遺傳的、易于識(shí)別的特殊遺傳多態(tài)性形式。Minisatellites：小衛(wèi)星序列遺傳標(biāo)記的種類與特點(diǎn)1）形態(tài)標(biāo)記：肉眼可見(jiàn)的特征性狀，簡(jiǎn)單實(shí)用，但數(shù)目少，受發(fā)育階段與環(huán)境影響。 2）細(xì)胞標(biāo)記：染色體核型與帶型，受環(huán)境影響小，穩(wěn)定可靠，但耗時(shí)耗力，信息量不足。 3）生化標(biāo)記：貯藏蛋白、同工酶等，信息量較大，取材方便，但不能反映基因組非編碼區(qū)信息，仍受發(fā)育階段與環(huán)境影響。 4）DNA分子標(biāo)記：基因組DNA 水平的變異，理想的遺傳標(biāo)記。2. DNA分子標(biāo)記DNA分子標(biāo)記：簡(jiǎn)稱分子標(biāo)記，指基因組DNA 水平上

2、的任何差異，來(lái)自缺失、插入、置換、顛換、重復(fù)等，通常以分子雜交或凝膠電泳圖譜的形式體現(xiàn)。2.1 分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)1）數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組，理論上檢測(cè)位點(diǎn)近乎無(wú)限；2）穩(wěn)定遺傳，不受環(huán)境、發(fā)育階段和是否表達(dá)等限制;3）多態(tài)性高，自然存在，無(wú)須專門創(chuàng)造；4）表現(xiàn)為“中性”，即不影響性狀的表達(dá)；5）許多為共顯性，能鑒別雜合與純合，提供完整的遺傳信息。 2.2 分子標(biāo)記的類型分三大類: 1) 基于核酸分子雜交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length polymorphism ），限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性2) 基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990

3、s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、 SCAR、STS等3) 基于DNA測(cè)序: 第三代，近年來(lái)SNP和EST,反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等第三節(jié) 分子標(biāo)記的應(yīng)用1. RFLP標(biāo)記RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，1980，Botstein?；驹恚翰煌蚪MDNA經(jīng)特定限制酶消化后產(chǎn)生大小不等的片段，再經(jīng)電泳分離、Southern 印跡雜交和檢測(cè)后，得到特異的RFLP 標(biāo)記，它反映不同DNA對(duì)所用探針限制性酶切片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，實(shí)際是酶切位點(diǎn)的變化和分布情況。關(guān)鍵因素：限制酶：用一種酶切產(chǎn)生的多態(tài)性有限，常用68種

4、酶來(lái)篩選多態(tài)性。探針：常用單拷貝或低拷貝 gDNA或cDNA克隆，否則條帶模糊（smear），不易觀察。RFLP標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）共顯性；2）存在于整個(gè)基因組，位點(diǎn)數(shù)不受限制，?？蓹z測(cè)到14個(gè)基因座；缺點(diǎn)：1）篩選多態(tài)性探針較困難，需一系列探針；2）DNA樣本量要求大，操作較繁雜，耗時(shí)費(fèi)資，同位素污染，現(xiàn)已發(fā)展地高辛等標(biāo)記。2. RAPD 標(biāo)記RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA。1990年提出?；驹? 單引物PCR標(biāo)記 ；不同基因組DNA在隨機(jī)引物Arbitary primer （810bp）結(jié)合位點(diǎn)以及2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間

5、的距離可能不同，導(dǎo)致擴(kuò)增片段數(shù)目和長(zhǎng)度不同，經(jīng)電泳分離顯示出來(lái)，反映基因組相應(yīng)區(qū)域DNA的多態(tài)性。步驟：退火溫度36左右，其余同普通PCR。 RAPD 標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）簡(jiǎn)單快速，模板用量少，無(wú)需同位素；2）無(wú)需基因組序列信息，引物通用；3）成本低。缺點(diǎn)：1）顯性標(biāo)記，不能鑒別雜合子與純合子；2）穩(wěn)定性和重復(fù)性較差；受很多因素影響： 退火延伸溫度，模板濃度，Mg2+濃度，試劑污染，應(yīng)舍重復(fù)3）序列不同但長(zhǎng)度相同的片段共遷移，使多態(tài)性檢測(cè)受限制.只能分開片段長(zhǎng)度不同的dna片段，對(duì)于長(zhǎng)度相同但堿基組成不同的就分不出來(lái)3. AFLP標(biāo)記AFLP (Amplified fragment leng

6、th polymorphism)：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，1992 年提出，RFLP與PCR相結(jié)合的產(chǎn)物?；驹? 基因組DNA限制酶切（1種為常見(jiàn)6堿基切點(diǎn)，另1種為4堿基稀有識(shí)別位點(diǎn)，常為EcoRI（6）/MseI（4） ），酶切后DNA片段連接雙鏈人工接頭（1418bp，核心順序+限制酶識(shí)別序列，隨機(jī)設(shè)計(jì) ），以接頭和相鄰的限制酶位點(diǎn)作為引物結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行 雙引物PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用高分辨力測(cè)序膠分離。此多態(tài)性主要來(lái)自引物3端選擇性核苷酸的變化。AFLP關(guān)鍵技術(shù)：引物的設(shè)計(jì)與組合。引物由三部分組成:1) 5端與人工接頭互補(bǔ);2) 中間部分與限制酶識(shí)別位點(diǎn)互補(bǔ);3) 3端為13個(gè)選擇性核苷酸。

7、AFLP 圖譜常用23個(gè)選擇性堿基，每個(gè)泳道50100條帶AFLP標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1）兼具PCR的高效性與RFLP的準(zhǔn)確性；2）常擴(kuò)增50100條帶，多態(tài)性高，信息量大；3）通過(guò)設(shè)計(jì)不同接頭就可得到不同的引物，無(wú)需基因組序列信息。缺點(diǎn): 1）步驟多，流程長(zhǎng)，重復(fù)性不夠好；2）需放射性同位素或熒光素等標(biāo)記引物，但目前已發(fā)展銀染技術(shù)；3）顯性標(biāo)記。4. SSR標(biāo)記SSR（simple sequence repeat）：簡(jiǎn)單序列重復(fù)，也稱微衛(wèi)星 (microsatelite) DNA，真核基因組中普遍存在，隨機(jī)分布，主要位于非編碼區(qū)；重復(fù)單元25 bp，串聯(lián)重復(fù)1060次，多態(tài)性主要來(lái)自串聯(lián)重復(fù)次

8、數(shù)的不同。SSR標(biāo)記的原理: 不同基因型某一特定位點(diǎn)的SSR長(zhǎng)度不同, 但其側(cè)翼序列往往是保守的單一序列，據(jù)此側(cè)翼序列設(shè)計(jì)雙引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增即可得到長(zhǎng)度不同的SSR片段，產(chǎn)物經(jīng)PAGE或高濃度瓊脂糖凝膠電泳，即可顯示不同基因型在此位點(diǎn)的多態(tài)性。注：一般檢測(cè)的是單一位點(diǎn)的復(fù)等位基因，農(nóng)作物中多數(shù)SSR位點(diǎn)的復(fù)等位基因數(shù)多達(dá)十幾甚至幾十個(gè)，多態(tài)性高。SSR側(cè)翼序列的獲得：（作為設(shè)計(jì)引物的模板）一般程序：1）建立基因組DNA的質(zhì)粒文庫(kù)；2）根據(jù)預(yù)得到的SSR類型設(shè)計(jì)并合成探針，如預(yù)獲得(AT)n/(TA)n，則合成(AT)n探針；3）用探針篩庫(kù)，獲得陽(yáng)性克?。?）對(duì)陽(yáng)性克隆DNA插入序列進(jìn)行測(cè)序。

9、SSR標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：1) 序列短， 多數(shù)小于200bp，易擴(kuò)增；2) 有高度多態(tài)性，信息量大；3) 共顯性。缺點(diǎn)： 須獲得側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，步驟多、費(fèi)用高； 引物具有物種特異性。 5. SNP標(biāo)記SNP (single nucleotide polymorphism)：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性，指不同基因組DNA中某一特定位置上單個(gè)核苷酸的差異，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等，而且其在群體中出現(xiàn)的頻率大于1%（如低于1%，則視為點(diǎn)突變，不可能作為標(biāo)記）。SNP的分布與遺傳效應(yīng)1）分布于編碼區(qū)：即cSNP，功能性變異，可能會(huì)影響蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列和功能。2）分布于非編碼區(qū)：即調(diào)節(jié)區(qū)/基因周邊S

10、NPs，可能影響基因的表達(dá)水平。SNP是決定人類疾病易感性和藥物反應(yīng)差異的主要因素，有些疾病和性狀與SNP有關(guān)，如人鐮刀型細(xì)胞貧血癥。SNP的檢測(cè)方法：有近百種，包括雜交法、熔解法、電泳法、酶學(xué)法、化學(xué)法、物理法、測(cè)序法（最直接）以及它們的組合方法，綜合利用納米材料技術(shù)、多重PCR技術(shù)、各種熒光探針設(shè)計(jì)技術(shù)和各種熒光標(biāo)記技術(shù)等。DNA芯片技術(shù)在高通量檢測(cè)SNP方面顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，最理想、最具有發(fā)展?jié)摿?，但仍存在成本高、重?fù)性不夠好等問(wèn)題。 SNP標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：是覆蓋全基因組、標(biāo)記數(shù)量最大，多態(tài)性最高的標(biāo)記，缺點(diǎn)：SNP技術(shù)主要建立在基因組測(cè)序基礎(chǔ)之上，尚難在未測(cè)序生物上應(yīng)用。6. ISS

11、RISSR：（inter-simple sequence repeat, ISSR）：區(qū)間-簡(jiǎn)單重復(fù)序列。以加錨SSR寡聚核苷酸作引物，對(duì)位于反向排列的SSR之間的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，而不是擴(kuò)增SSR本身，反映SSR區(qū)間多態(tài)性。ISSR引物設(shè)計(jì)：簡(jiǎn)單，無(wú)需知道DNA序列，長(zhǎng)度1618bp，由14bp組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個(gè)非重復(fù)的錨定堿基組成，用以擴(kuò)增兩側(cè)具有反向排列SSR的一段DNA序列，只有與錨定堿基互補(bǔ)的位點(diǎn)才被靶定，提高了擴(kuò)增的轉(zhuǎn)一性。單引物PCR標(biāo)記。7. SCARSCAR（sequence characterized amplification region）：特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記。在

12、對(duì)基因組DNA做了RAPD分析后，將目標(biāo)RAPD片段克隆并進(jìn)行末端測(cè)序；再根據(jù)2端序列設(shè)計(jì)特異引物，即前10個(gè)堿基應(yīng)包括原來(lái)的RAPD引物；用此引物對(duì)基因組DNA再擴(kuò)增，即可將與原來(lái)RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來(lái)。8. STSSTS（sequence-tagged sites）：序列標(biāo)簽位點(diǎn)/序標(biāo)位，是對(duì)以特異引物序列進(jìn)行 PCR擴(kuò)增的一類分子標(biāo)記的總稱，用來(lái)擴(kuò)增、分析基因組中特定區(qū)域的多態(tài)性 第三節(jié) 分子標(biāo)記的應(yīng)用1. 分子遺傳圖譜的構(gòu)建經(jīng)典遺傳圖譜：通過(guò)遺傳重組分析，將基因或形態(tài)、生理和生化等常規(guī)標(biāo)記在染色體上線性排列；標(biāo)記數(shù)量少，圖距大，飽和度低，應(yīng)用價(jià)值有限。分子標(biāo)記遺傳圖譜：構(gòu)

13、建原理同上，利用DNA分子標(biāo)記作圖，高密度圖譜。已構(gòu)建擬南芥、水稻、小麥、玉米、大豆等高密度分子遺傳圖譜，極大地促進(jìn)了基因定位與克隆、物理圖譜的構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇育種等。2. 基因定位與克隆2.1 基因定位質(zhì)量性狀基因定位：常用近等基因系 (NIL，near isogenic lines )分析法和分離集團(tuán)混合分析法 (BSA，Bulked segregation anlysis)。近等基因系：是指兩個(gè)或多個(gè)形態(tài)上相似，遺傳背景相同或相近，只在個(gè)別染色體區(qū)段上存在差異的遺傳材料，通過(guò)雜交和回交獲得。數(shù)量性狀基因座（QTL，quantitative trait loci ）定位：實(shí)質(zhì)上是確定

14、數(shù)量性狀位點(diǎn)基因與分子標(biāo)記間的連鎖關(guān)系，QTL作圖。定位方法：1）單一標(biāo)記定位法（single marker analysis）：利用某個(gè)標(biāo)記與某個(gè)QTL的連鎖關(guān)系，雜交后代出現(xiàn)兩者之間的同分離現(xiàn)象，標(biāo)記的不同基因型在數(shù)量性狀的分布、均值和方差上存在差異，檢驗(yàn)差異確定是否與QTL連鎖2）區(qū)間定位法（interval mapping ，IM）： 利用染色體上一個(gè)QTL兩側(cè)的一對(duì)標(biāo)記，建立個(gè)體數(shù)量性狀測(cè)量值對(duì)雙側(cè)標(biāo)記基因型指示變量的線性回歸關(guān)系，根據(jù)回歸關(guān)系是否顯著確定QTL的存在，位置和效應(yīng)。通過(guò)上述方法，篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)行快速基因定位。2. 2 基因圖位克隆首先鑒定與目的基

15、因緊密連鎖的分子標(biāo)記（通常要求在1cM之內(nèi)），然后由這些標(biāo)記去篩選大片段DNA文庫(kù)(YACs或BACs)，鑒定出與標(biāo)記有關(guān)的克隆，繼之以亞克隆和染色體步查等獲得含目的基因的克隆，再輔之以轉(zhuǎn)化和互補(bǔ)測(cè)驗(yàn)加以確證。（見(jiàn)前面第7章內(nèi)容）圖位克隆的基本流程：1）構(gòu)建遺傳圖譜：目的基因初步定位分子標(biāo)記；2）構(gòu)建物理圖譜：局部區(qū)域的精細(xì)作圖，目的基因精細(xì)定位 (kb/cM)；3）構(gòu)建基因組文庫(kù)：BAC、YAC、Cosmid等；4）染色體步行或登陸：獲得候選克隆 探針；5）篩選基因文庫(kù)：獲得目的克?。?）鑒定目的基因。3. 遺傳多樣性與親緣關(guān)系研究遺傳多樣性: 主要指種內(nèi)不同居群之間或同一居群不同個(gè)體之間的遺傳變異的總和。在植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性與起源演化研究中，根據(jù)不同類型資源間DNA片段的差異，計(jì)算出遺傳距離或相似系數(shù)，構(gòu)建系譜關(guān)系聚類圖，揭示親緣關(guān)系。4. 比較基因組研究比較基因組學(xué)：主要是利用近緣物種間的同源分子標(biāo)記，在相關(guān)物種間進(jìn)行遺傳或物理作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布特點(diǎn)，揭示染色體上基因及其排列順序的相同（共線性）或相似性（同線性），從而對(duì)基因組結(jié)構(gòu)和起源等進(jìn)行進(jìn)化分析。例如，水稻、小麥、玉米等存在高度保守的基因組同線性（序列、拷貝數(shù)、順序）。 5. 分子標(biāo)記輔助選擇分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）：將分子標(biāo)記應(yīng)用于雜交育種后代的選擇，即選