piRNA的生物合成及其在生殖細(xì)胞中的功能

1、piRNA的生物合成及其在生殖細(xì)胞中的功能Carla Klattenhoff and William Theurkauf* 小干擾RNA和微小RNA是由雙鏈的RNA前體經(jīng)核酸內(nèi)切酶Dicer切割生成的，并與Argonaute家族蛋白共同作用破壞轉(zhuǎn)錄物或沉默翻譯。一類清楚的RNA核苷酸長(zhǎng)度為24-30個(gè)，通過(guò)Dicer依賴型機(jī)制生產(chǎn)，與Argonaute蛋白家族中的Piwi蛋白結(jié)合。關(guān)于蒼蠅、魚和小鼠的研究暗示了Piwi蛋白結(jié)合RNAs（piRNA）在生殖細(xì)胞發(fā)育、沉默自私DNA元件和維持種系DNA完整性中的功能。然而，無(wú)論是piRNA染色質(zhì)主要控制機(jī)制、基因轉(zhuǎn)錄、RNA穩(wěn)定性或RNA翻譯，還是

2、piRNA的生物合成都不是很清楚。在這里，我們回顧了近期的關(guān)于piRNA生成和功能的研究，并討論關(guān)于這個(gè)耐人尋味的新型小RNA的懸而未決的問(wèn)題。前言1993年，安布羅斯和他的同事發(fā)現(xiàn)，線蟲的lin-4基因通過(guò)負(fù)調(diào)控編碼一個(gè)小調(diào)控RNA并與lin-14的轉(zhuǎn)錄單元互補(bǔ)（Lee等人，1993）。這些開創(chuàng)性的研究確定了第一個(gè)微小RNA（miRNA）。在動(dòng)物和植物實(shí)驗(yàn)室中，非編碼的小RNA隨后成為強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具和關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)節(jié)者（Baulcombe，2004；漢農(nóng)，2002；Kloosterman和Plasterk，2006；梅洛和康特，2004）。目前，21個(gè)核苷酸（nt）的小干擾RNAs（siRNA

3、s）被頻繁用于實(shí)驗(yàn)性的操縱基因表達(dá)，它是通過(guò)Dicer核酸內(nèi)切酶處理長(zhǎng)雙鏈RNA（dsRNA）的前體得到的，隨后形成中間體RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。該中間體取代RNA的其中一條鏈（被稱為“過(guò)客鏈”），并產(chǎn)生成熟的RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），其中包含一條能夠與Argonaute蛋白家族結(jié)合的單鏈（“引導(dǎo)鏈”）。當(dāng)siRNA的引導(dǎo)鏈與靶RNA完全互補(bǔ)時(shí)，Argonaute蛋白識(shí)別特異性序列并切割（Hannon，2002；Meister和Tuschl，2004）。在體內(nèi)，siRNA途徑會(huì)降低病毒生命周期中RNA中間體的產(chǎn)生，因此在限制病毒感染中起重要作用（Wang等，2006）。通過(guò)比較，miR

4、NA是從由染色體基因編碼的莖環(huán)轉(zhuǎn)錄物中衍生出來(lái)的。初級(jí)莖環(huán)RNA（priRNA）是在細(xì)胞核中由Drosha核糖核酸酶催化產(chǎn)生premiRNAs，然后從細(xì)胞核中出來(lái)并在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶內(nèi)切酶催化裂解，從而生成22 nt的成熟miRNA。這些miRNA與Argonaute蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)靶基因活性的同源依賴性下調(diào)。miRNA與其目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物間的不完全堿基配對(duì)將會(huì)誘導(dǎo)翻譯沉默，而完美的堿基配對(duì)將觸發(fā)RNA破壞。在miRNA途徑突變的突變體中，發(fā)育破壞并且經(jīng)常導(dǎo)致胚胎致死（Du和Zamore，2005；Kloosterman和Plasterk，2006）。最近的研究發(fā)現(xiàn)了一類新的24-30 nt的R

5、NA，其由無(wú)Dicer依賴性機(jī)制催化，并產(chǎn)生能夠與Argonaute蛋白家族中的Piwi蛋白結(jié)合（Aravin等，2006；Brennecke等，2007；Girard等，2006；Grivna等，2006；Gunawardane等，2007；Houwing等，2007；Lau等，2006；Saito等，2006；Vagin等，2006；Watanabe等，2006）。其對(duì)于雌雄果蠅生育能力是必不可少的（Lin和Spradling，1997）。在一些系統(tǒng)中，這些與Piwi蛋白相互作用的RNA（piRNA）主要是從轉(zhuǎn)座子和其他重復(fù)序列元件中衍生而來(lái)的（Brennecke等，2007；Gunawa

6、rdane等，2007年；Saito等，2006），從而導(dǎo)致它們?cè)x為重復(fù)序列偶聯(lián)的小干擾RNA（rasiRNAs）（Aravin等，2003）?，F(xiàn)在已很清楚，piRNA即可以從重復(fù)序列也可以從復(fù)雜的DNA序列元素中衍生出來(lái)（Aravin等，2007；Brennecke等，2007；Houwing等，2007），并且piRNA包含rasiRNAs。因此，我們?cè)谙旅娴挠懻撝惺褂酶ㄓ玫男g(shù)語(yǔ)piRNA。小鼠、果蠅和斑馬魚的遺傳學(xué)研究表明，piRNA在種系發(fā)展中是至關(guān)重要的（Carmell等，2007；Chen等，2007；Cook等，2004；Cox等，1998；考克斯人，2000；Deng和L

7、in，2002；Gillespie和Berg，1995；Houwing等，2007；Kuramochi-Miyagawa，等，2004；Pane等，2007；Schupbach和Wieschaus，1991）。然而，參與piRNA合成的蛋白質(zhì)揭示，其能夠在體細(xì)胞中調(diào)控基因表達(dá)（Grimaud等，2006；Pal-Bhadra等，2002；Pal-Bhadra等，2004），以及影響學(xué)習(xí)和記憶（Ashraf等，2006），這表明piRNA可能對(duì)生物進(jìn)程造成較廣泛的影響。piRNA的合成piRNA的長(zhǎng)度24-30 nt表明，他們不由Dicer酶（切割雙鏈前體產(chǎn)生21-22 nt的產(chǎn)物）產(chǎn)生的（Be

8、rnstein等，2001）。最近的基因研究一致表明，piRNA是通過(guò)一個(gè)切酶非依賴性過(guò)程產(chǎn)生的（Houwing等，2007；Vagin等，2006年）。在果蠅中，從其基因組的起源和與Argonaute蛋白的結(jié)合研究中，能夠洞察piRNA的合成機(jī)制（Aravin等，2006；Brennecke等，2007；Girard等，2006；Grivna等，2006年；Gunawardane等，2007；Houwing等，2007；Lau等，2006；Saito等，2006；Vagin等，2006）。在果蠅卵巢中，絕大多數(shù)piRNA來(lái)自于一定數(shù)量的近著絲粒和端粒，這些位點(diǎn)富含反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列（Brenn

9、ecke等，2007）。絕大多數(shù)piRNA是從反義鏈上的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列派生得到，并且這些RNA優(yōu)先與Argonaute蛋白家族的Piwi蛋白和Aubergine蛋白（Aub）結(jié)合。相反，piRNA的正義鏈優(yōu)先與Argonaute蛋白3（Ago3）結(jié)合（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）。Piwi蛋白、Aub蛋白和Ago3蛋白，與piRNA形成復(fù)合體，可以切割靶RNA引導(dǎo)鏈在第10和11個(gè)堿基之間的位點(diǎn)（Gunawardane等，2007；Saito等，2006）。在果蠅中，從相反鏈獲得的piRNA顯然具有一個(gè)10 nt的重疊。此外，反義piRNA與Piwi和

10、Aub結(jié)合表明，其更傾向與結(jié)合在5端有一個(gè)U殘基的序列；而正義piRNA與Ago3結(jié)合是因?yàn)槠湫蛄型诘?0位有一個(gè)A殘基（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）?；谶@些觀察，這兩個(gè)團(tuán)隊(duì)同時(shí)提出了piRNA合成的“乒乓”模型，其中Ago3與正義鏈piRNA結(jié)合并催化反義鏈，其在A:U堿基對(duì)處進(jìn)行切割并產(chǎn)生具有5端的反義piRNA（圖1）（Brennecke等，2007；Gunawardane等，2007）。這個(gè)具有5端的裂解產(chǎn)物擬與Aub或Piwi蛋白結(jié)合，在核酸水解處理3端后，產(chǎn)生成熟的23-30 nt的反義piRNA（圖1B）。而后，成熟的反義piRNA-

11、Argonaute復(fù)合物結(jié)合并切割RNA的正義鏈，沉默基因表達(dá)和產(chǎn)生的5端的能與Ago3結(jié)合的正義piRNA前體（圖1D）。3端的成熟正義piRNA繼續(xù)反應(yīng)，完成循環(huán)（圖1E）。該模型是基于在果蠅中的研究，但最近的研究結(jié)果表明，一個(gè)類似機(jī)制可能在小鼠中存在（Aravin等，2007）。圖1，piRNA合成的乒乓球模型。（A）Argonaute家族蛋白中的Piwi蛋白類的Argonaute蛋白3（Ago3）與正義鏈piRNA（藍(lán)色）結(jié)合，并指導(dǎo)靶反義鏈轉(zhuǎn)錄物（紅色）的裂解，產(chǎn)生5'端反義鏈piRNA。（B）Aubergine（Aub）和Piwi蛋白（未示出）與所得到的piRNA前體結(jié)合，

12、然后剪切形成piRNA的最終長(zhǎng)度。這步驟可能是由假定的核酸酶Squash和Zucchini來(lái)催化。（C）果蠅的Hen1甲基化piRNA的3'端（3OME）。（D）Aub-反義鏈piRNA復(fù)合體催化正義轉(zhuǎn)錄物（藍(lán)色）的裂解，產(chǎn)生5'端的正義piRNA。（E）Ago3與修剪的和（F）甲基化后的piRNA前體結(jié)合，即為反義鏈piRNA。根據(jù)Brennecke等人提出的模型（Brennecke等，2007）。在piRNA合成的“乒乓”模型中，調(diào)解一些擬議的步驟的蛋白質(zhì)尚未確定，但最近的研究結(jié)果可能有助于填補(bǔ)其中的一些空白。例如，在果蠅中突變zucchini和squash的基因會(huì)擾亂pi

13、RNA的生產(chǎn)，并導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的損失沉默，而這兩個(gè)基因都編碼假定的核酸酶（Pane等，2007）。因此，zucchini和squash可切割3端以產(chǎn)生成熟piRNA（圖1）。此外，成熟piRNA的3端被甲基化（Kirin和Mourelatos，2007；Ohara等，2007）。在果蠅中，該反應(yīng)是由Hen1編碼的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶（也稱為DmHen1和Pimet）進(jìn)行的，當(dāng)piRNA與Argonautes蛋白結(jié)合后再甲基化（Horwich等，2007；Saito等，2007）。Hen1基因突變的果蠅突變體其piRNA的長(zhǎng)度和穩(wěn)態(tài)水平將減少，這表明甲基化限制3端加工和增加了piRNA的穩(wěn)定性（H

14、orwich等，2007）。甲基化作用也可能影響了piRNA途徑中piRNA與其余組分之間的相互作用。然而，果蠅hen1突變體是可行和可育，這表明該基因修飾對(duì)于piRNA功能不是必不可少的（Saito等，2007）。在果蠅中，遺傳篩選已經(jīng)確定了幾個(gè)額外的對(duì)于piRNA合成或功能所必需的因素。例如，armitage和spindle E基因編碼的假定解旋酶是piRNA合成和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默所必需的（Aravin等，2004；Vagin等，2006）。在piRNA合成過(guò)程中，這些蛋白質(zhì)可以展開雙鏈中間體形態(tài)，識(shí)別靶基因，或者裂解。相反地，cutoff基因是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默所必需的，但不是piRNA合

15、成必需的（Chen等，2007）。酵母的同源Cutoff曾揭示了RNA衰變（Kim等，2004；Xue等，2000）。因此，通過(guò)增強(qiáng)piRNA-Argonaute蛋白復(fù)合物的活性，Cutoff可能有助于基因沉默。piRNA路徑的條塊分割 近日，果蠅的Tudor結(jié)構(gòu)域蛋白Krimper已經(jīng)被證明與抑制逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和piRNA基因的產(chǎn)生有關(guān)。這種蛋白質(zhì)是類核周體的一個(gè)組成部分，即已經(jīng)證實(shí)與RNA加工種系特異性核周結(jié)構(gòu)和krimper蛋白突變阻斷類核周體形成有關(guān)。有趣的是，許多與piRNA路徑相關(guān)蛋白積聚在類核周體中，這是突變的滋卵細(xì)胞。果蠅卵母細(xì)胞是由帶有15個(gè)與合成RNAs和蛋白有關(guān)的滋卵細(xì)胞通

16、過(guò)環(huán)狀管道運(yùn)輸至卵母細(xì)胞而形成。類核周體最初在電子顯微照片確定為圍繞滋卵細(xì)胞核非晶電子致密的云。在解旋酶和核酸酶作用下，類核周體中富集了Argonautes蛋白家族中的Piwi亞家族 ：Aub和AGO3。與大多數(shù)piRNA基因路徑相關(guān)的蛋白，果蠅的Piwi幾乎完全被滋卵細(xì)胞同化。這些觀察表明，piRNA的產(chǎn)物和功能可能會(huì)被割裂開來(lái)。 piRNA與Argonaute蛋白的復(fù)合物似乎在該途徑中是具有催化活性的效應(yīng)的，而這些定位研究表明的Piwi介導(dǎo)了核函數(shù)的piRNA的途徑，Ago3和Aub驅(qū)動(dòng)細(xì)胞質(zhì)功能。根據(jù)對(duì)正義鏈與反義鏈Argonaute蛋白的復(fù)合物在類核周體的性質(zhì)，我們推測(cè)出piRNA的生

17、源論機(jī)制。在這個(gè)模型中，piRNA的前導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物正義鏈被輸出到類核周體，在那里它們被Aub-反義piRNA基因復(fù)合物裂解，沉默靶基因的表達(dá)和產(chǎn)生的有義鏈的piRNA前體。這些與Ago3相關(guān)的有義鏈前體被修剪到成熟的長(zhǎng)度。Ago3-有義鏈復(fù)合物催化裂解反義鏈轉(zhuǎn)錄物，產(chǎn)生了與Aub和Piwi相關(guān)的piRNA前體。成熟的Aub復(fù)合物依然留在類核周體中發(fā)揮裂解正義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，促使piRNA 合成的作用，而成熟的Piwi復(fù)合物則被運(yùn)送至細(xì)胞核中介導(dǎo)異染色質(zhì)組裝和轉(zhuǎn)錄沉默，或共同轉(zhuǎn)錄RNA的破壞。雖然該模型是高度投機(jī)性，但也提出了一些明確的預(yù)測(cè)，因此可以作為對(duì)piRNA的生源論進(jìn)一步研究一個(gè)有用的框架。在果

18、蠅的遺傳研究中，小鼠和斑馬魚的研究已經(jīng)提供了洞察了piRNA的生物學(xué)功能，并突出這些RNA在生殖細(xì)胞發(fā)展的重要意義。piRNA途徑突變的表型在這些系統(tǒng)概括如下。3、 圖解Fig.B:（1）-（2）正義鏈被轉(zhuǎn)錄并從細(xì)胞核中輸出；（3）-（4）在類核周體中，Aub-piRNA復(fù)合物降解正義鏈轉(zhuǎn)錄物，產(chǎn)生與Ago3相關(guān)的piRNA復(fù)合物；（5）-（6）Ago3-piRNA復(fù)合物降解反義鏈轉(zhuǎn)錄物，產(chǎn)生與Aub和Piwi相關(guān)的piRNA復(fù)合物；（7）Aub-piRNA復(fù)合物仍然留在類核周體中繼續(xù)降解正義鏈復(fù)合物；（8）Piwi-piRNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核中，介導(dǎo)位于常染色質(zhì)和異染色質(zhì)上的同源基因。雌果蠅

19、的干細(xì)胞分化和胚軸特化piRNA通路的突變基因首次被發(fā)現(xiàn)是在果蠅中，通過(guò)突變破壞卵子產(chǎn)生和胚軸特化 (Gillespie and Berg, 1995;Schupbach and Wieschaus, 1991)。果蠅的卵子發(fā)生始于胚胎干細(xì)胞分裂,產(chǎn)生一個(gè)成包囊細(xì)胞，這個(gè)成包囊細(xì)胞經(jīng)過(guò)四次不完整的胞質(zhì)分裂，產(chǎn)生16個(gè)有相互聯(lián)系的細(xì)胞，一個(gè)卵母細(xì)胞和15營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(for a review, see Spradling, 1993)。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為卵母細(xì)胞提供大部分的RNA和蛋白質(zhì)成分，但是大部分仍然保持轉(zhuǎn)錄沉默。果蠅的胚軸特化取決于在卵母細(xì)胞中少數(shù)形態(tài)形成的RNA的不對(duì)稱定位。這些RNA是從營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞

20、轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞的，它們是由交互與極化微管細(xì)胞骨架定位的。微管極化是由一連串的germline-to-soma和soma-to-germline信號(hào)控制的(reviewed by Grunert and St Johnston, 1996)。piRNA通路基因的突變破壞干細(xì)胞維持和卵母細(xì)胞生產(chǎn),以及形態(tài)形成的RNA在卵母細(xì)胞胚軸特化期間的定位Chen et al., 2007; Cook et al.,2004; Cox et al., 1998; Cox et al., 2000; Gillespie and Berg, 1995; Lin and Spradling, 1997; Pane

21、et al., 2007; Schupbach and Wieschaus, 1991)。piwi基因編碼的四種piwi類Argonautes家族(Cox et al., 1998)。piwi的突變導(dǎo)致在卵子發(fā)生時(shí)有嚴(yán)重缺陷,包括胚胎干細(xì)胞的損失(圖3)( Cox et al., 1998; Cox et al., 2000; Lin and Spradling, 1997)?？寺〉难芯勘砻?在體細(xì)胞中，干細(xì)胞維持和分裂需要來(lái)自干細(xì)胞基因群的piwi的表達(dá)。相比之下，piwi在生殖系的損失,會(huì)降低細(xì)胞分裂效率,但不會(huì)導(dǎo)致失去干細(xì)胞或在卵子發(fā)生成團(tuán)現(xiàn)象(Cox et al., 2000)。在其他

22、piRNA通路基因的中突變,包括西葫蘆、南瓜、也會(huì)導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞損失(Chen et al., 2007; Pane et al., 2007)。目前尚不清楚這些基因是否是必需的在生殖系細(xì)胞,體細(xì)胞或兩者都有。piwi和piRNA通路以及生殖干細(xì)胞分裂和維持的分子功能尚未定義。在果蠅大多數(shù)的piRNA基因突變，包括茄子，紡錘絲 E，阿米蒂奇，漩渦，krimper，西葫蘆，破壞的前后RNA定位(Cook et al., 2004; Gillespie and Berg, 1995; Pane et al., 2007; Schupbach and Wieschaus, 199

23、1). 這些變異不破壞前的bicoid mRNA定位或者不阻止卵母細(xì)胞的發(fā)展。因此,這些基因最初被認(rèn)為是控制特定團(tuán)體基因的表達(dá)，這些基因?qū)τ谇昂笞笥彝穪?lái)說(shuō)是必需的(Cook et al., 2004)。然而,后來(lái)的研究表明,引人注目的胚軸特化缺陷與piRNA相關(guān)突變是有關(guān)的，是DNA損傷信號(hào)的二次結(jié)果(Chen et al.,2007; Klattenhoff et al., 2007; Pane et al., 2007)。這些研究表明，piRNAs主要功能在維持胚胎DNA的完整性。piRNAs和DNA損傷信號(hào)之間的聯(lián)系是由果蠅減數(shù)分裂DNA修復(fù)基因的研究得來(lái)的。減數(shù)分裂重組需要DNA斷裂

24、形成的Spol1核酸酶(Cao et al., 1990 ),Schupbach和他的同事們已經(jīng)表明,破壞減數(shù)分裂DNA斷裂修復(fù)的突變,也會(huì)破壞前后和背腹胚軸特化(Abdu et al., 2002; Ghabrial et al., 1998)。值得注意的是,果蠅的胚胎發(fā)育缺陷通過(guò)mei-41和mnk(也稱為loki-果蠅)中的突變與顯著抑制的修復(fù)突變有聯(lián)系, mei-41和mnk各自地編碼ATR和chk2 kinases,這是在DNA損傷信號(hào)中的功能,并通過(guò)mei-W68的突變(Abdu et al., 2002; Ghabrial et al., 1998)編碼the fly

25、Spo11 homolog(McKim和Hayashi-Hagihara,1998)。未修復(fù)的減數(shù)分裂突變出現(xiàn)激活A(yù)TR和Chk2 kinases,這也反過(guò)來(lái)觸發(fā)胚軸特化缺陷。最近的研究表明，胚軸特化影響在 阿米蒂奇，茄子，西葫蘆的缺陷，也會(huì)受到mei-41 和mnk的抑制(Chen et al., 2007; Klattenhoff et al., 2007; Pane et al., 2007)。此外，rmitage，茄子和紡錘絲 E基因突變導(dǎo)致H2Av (-H2Av) 磷酸化蛋白在胚胎細(xì)胞核的顯著積累(fig。3 b);這些焦點(diǎn)通常與破壞DNA雙鏈聯(lián)系在一起 (Mod

26、esti Kanaar,2001)。值得注意的是, mei-W68(Spo11)沒(méi)有受到抑制是與 armitage或-H2Av foci 的形成相關(guān)聯(lián)的 (Klattenhoff et al .,2007)。piRNA突變,如DNA修復(fù)基因突變,從而通過(guò)活化ATR/Chk2 通路破壞胚軸特化。然而,與DNA修復(fù)通路突變不同,減數(shù)分裂不是損害的來(lái)源。所有的果蠅piRNA通路的突變導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的超表達(dá)(Aravin et al., 2001; Chen et al., 2007; Kalmykova et al., 2005; Pane et al., 2007; Sarot

27、 et al., 2004; Vagin et al., 2006)，在男性生殖系中piwi突變體已被證明至少轉(zhuǎn)移一類轉(zhuǎn)座子(Kalmykova et al .,2005)。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移可以引起DNA損傷(Belgnaoui et al .,2006;Gasior et al .,2006),和在piRNA突變體中轉(zhuǎn)座子高效率插入，這個(gè)可以破壞DNA修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致激活A(yù)TR和Chk2。然而，沒(méi)有直接證據(jù)證明在女性生殖細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移，當(dāng)piRNA通路部分被破壞的時(shí)候，會(huì)有轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移，并且這個(gè)途徑可以更直接參與DNA修復(fù)，或者建立染色質(zhì)結(jié)構(gòu)抵抗傷害。果蠅染色體端粒是由逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子重復(fù)組成

28、,piRNA突變會(huì)增加這些重復(fù)的數(shù)量(Savitsky et al .,2006)。這些發(fā)現(xiàn)表明,piRNA突變可能導(dǎo)致端粒的保護(hù)的損失，導(dǎo)致識(shí)別染色體末端的DNA斷裂。然而，目前尚不清楚piRNA通路突變的部分破壞是隨機(jī)的，連接到轉(zhuǎn)座子插入，或者受到特殊染色體域的限制，RNA的精確功能在維持胚胎基因組完整性仍有待確定。Oskar 蛋白質(zhì)對(duì)于極點(diǎn)等離子組裝和胚胎模式來(lái)說(shuō)是必不可少的，并且 piRNA通路突變破壞osk mRNA 和蛋白質(zhì)定位(Cook et al., 2004)。osk mRNA的轉(zhuǎn)化以及與它極點(diǎn)定位緊緊的聯(lián)系在一起，它開始于卵子發(fā)生的第九階段(Kim-Ha

29、 et al .,1995;Markussen et al .,1995;Rongo et al .,1995)。在大量piRNA通路突變中的突變導(dǎo)致在前期卵子發(fā)生中的Oskar 蛋白質(zhì)表達(dá)，并且mnk (Chk2)的突變不會(huì)抑制過(guò)早的（不成熟）的 osk mRNA的轉(zhuǎn)化(Cook et al.,2004; Pane et al., 2007)。因此,過(guò)早的（不成熟的）Osk 蛋白質(zhì)積累不是DNA損傷信號(hào)的結(jié)果。Piwi-class-Argonaute-piRNA混合物，就像siRNA or miRNA Argonaute家族的混合物，能夠在試管內(nèi)完美的切開RNA目標(biāo)體(Gunawa

30、rdane et al., 2007; Lau et al., 2006; Saito et al., 2006)。如上所述，miRNA-Argonaute復(fù)合物不能完美的與作為mRNAs 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化沉默的目標(biāo)相配對(duì)(Valencia-Sanchez et al . ,2006)。也因此piRNA-Piwi-class-Argonaute復(fù)合物可能觸發(fā)的轉(zhuǎn)座子沉默形成 不完美匹配的目標(biāo),包括單份基因mRNA如oskar。符合這個(gè)猜測(cè)的是piRNAs的一個(gè)通路與小鼠的多糖體之間的聯(lián)系(Grivna et al .,2006 b)。雄性果蠅中生殖能力和放射性沉默大多數(shù)果蠅的piRNA通路突

31、變都會(huì)降低，這與放射狀蛋白的過(guò)表達(dá)相關(guān)，放射狀蛋白的功能尚不清楚，它由X染色體上的多重基因編碼，這些基因被Y染色體連鎖的放射基因座抑制基因Su(Ste) 所抑制，Su(Ste)包含與放射狀蛋白高度同源的雙向轉(zhuǎn)錄重復(fù)序列，Su(Ste) 基因座的缺失會(huì)導(dǎo)致放射狀蛋白的超表達(dá)，并在睪丸中組裝成晶體，25-27 nt 的piRNAs產(chǎn)生于Su(Ste) 基因座，piRNA通路的突變會(huì)導(dǎo)致放射狀晶體的形成，來(lái)自于Su(Ste)基因座的piRNA會(huì)導(dǎo)致放射狀蛋白的沉默，尚不清楚這是否反映了轉(zhuǎn)錄或后轉(zhuǎn)錄的沉默。放射狀蛋白的單獨(dú)過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致不育，缺點(diǎn)是其他基因的沉默也會(huì)導(dǎo)致雄性生育性。在雄性生殖系，piRN

32、A通路突變導(dǎo)致至少一個(gè)子集的轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)，與轉(zhuǎn)座子活化相關(guān)的插入突變也會(huì)導(dǎo)致生殖力的下降。老鼠的雄性生殖系的發(fā)育老鼠的基因組編碼三個(gè)Piwi同源染色體，Miwi, Miwi2 和Mili (也分別稱為Piwil1, Piwil4 和 Piwil2）這三個(gè)在睪丸中表達(dá)量都很高，結(jié)合的piRNAs的Mili 和 Miwi 、Mili 和 Miwi敲除的突變體都會(huì)阻礙piRNAs的產(chǎn)生，三者中每個(gè)基因的單一無(wú)效突變都會(huì)導(dǎo)致雄性不育，老鼠的精子形成是一個(gè)協(xié)調(diào)的過(guò)程，可以分成三個(gè)階段：有絲分裂、減數(shù)分裂和精子形成。在第一階段中，上皮細(xì)胞的基底層干細(xì)胞的內(nèi)部化使得有絲分裂自動(dòng)更新，并形成一群初級(jí)精母細(xì)胞；

33、在第二階段中，初級(jí)精母細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂繼續(xù)發(fā)育，并形成單倍體圓形精細(xì)胞。在減數(shù)分裂前期I的細(xì)線期，重復(fù)的染色體濃縮并開始形成對(duì)，配對(duì)完成后，在偶線期，形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體，并在粗線期發(fā)生交換。雙線期，同源染色體開始分開，最后在濃縮期消退。在第三階段，圓形精細(xì)胞成熟并伸長(zhǎng)，然后釋放到小管腔中，在Mili, Miwi 和 Miwi2 突變體中，睪丸產(chǎn)后約2周內(nèi)是正常的，大致與第一輪減數(shù)分裂期相同，然而，后減數(shù)分裂的細(xì)胞并沒(méi)有形成（圖3C），在粗線期，Mili 和 Miwi2 突變體的發(fā)育受阻,而Miwi 突變體的精母細(xì)胞發(fā)育到一個(gè)圓形精母細(xì)胞階段，但并不形成精子。與Mili和Miwi 蛋白時(shí)空表達(dá)模式相

34、關(guān)的發(fā)育時(shí)間受限，在雄性原生生殖細(xì)胞中，Mili是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的，并出現(xiàn)在粗線期的整個(gè)階段，Miwi只在粗線期中間階段到圓的精細(xì)胞間表達(dá)，精子形成期的Miwi2的時(shí)空表達(dá)模式尚未報(bào)道。每個(gè)基因的突變會(huì)導(dǎo)致雄性生殖細(xì)胞的退化，而體細(xì)胞的影響不大，在染色體聯(lián)會(huì)被破壞和DNA損傷修復(fù)的突變體中存在類似的精子形成抑制表型。此外-H2AX染色很深，表明在Miwi2突變體中可觀察到DNA的斷裂，上述結(jié)果表明，老鼠中piwi突變，正如果蠅piRNA通路的突變，會(huì)導(dǎo)致DNA的損傷，并激活DNA損傷的應(yīng)答，包括生殖系細(xì)胞的凋亡變性。在果蠅piRNA通路的突變體中，生殖系細(xì)胞的DNA損傷與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子超表達(dá)相關(guān)，大多數(shù)piRNAs與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列相聯(lián)系。這些觀察表明，轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)導(dǎo)致生殖系細(xì)胞的DNA損傷，盡管還未得到證明。相反，成年老鼠睪丸中的piRNAs 耗盡了逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列。然而，最新的研究鑒別了粗線期前的包含括大量重復(fù)和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列的Mili相關(guān)的piRNAs，此外，老鼠的Mili 和 Miwi2 突變體逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄的消阻遏作用。因此 piRNA pathway 在沉默逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子過(guò)程中具有保守功能，并防止生殖細(xì)胞系中的DNA損傷。與蒼蠅形成對(duì)比，在老鼠 Piwi 類 Argonaute基因上，雌性生殖細(xì)胞系并不受單突變的影響。在哺乳動(dòng)物雌