幾種膠體金技術(shù)詳解

1、膠體金免疫分析技術(shù)詳解隨著免疫分析日益廣泛應(yīng)用于以臨床為主以及非臨床領(lǐng)域的診斷工業(yè)，免疫分析正在向兩個(gè)方向發(fā)展：一類為全自動(dòng)化的免疫分析；另一類為以硝酸纖維膜為載體的快速免疫分析。前者需要價(jià)格昂貴的全自動(dòng)儀器及與儀器嚴(yán)格配套的各種試劑盒，目前只能在醫(yī)療及檢測(cè)中心應(yīng)用，雖也能較快速給出結(jié)果，但仍需一定時(shí)間，不適合遠(yuǎn)離醫(yī)療及檢測(cè)中心的地區(qū)，更不能用于“患者床旁檢驗(yàn)”和普查的需要，在酶免疫分析的基礎(chǔ)上，主要以硝酸纖維素膜為載體的快速診斷方法迅速和廣泛地發(fā)展起來。這類方法目前在文獻(xiàn)及市場(chǎng)上的命名還很不統(tǒng)一。它實(shí)際上屬于快速斑點(diǎn)免疫結(jié)合分析，主要有以下兩種方法：斑點(diǎn)免疫滲濾分析DIFA和斑點(diǎn)免疫層析分析

2、 DICA。本篇主要介紹以金作為標(biāo)志物的膠體金免疫分析技術(shù)。金標(biāo)記免疫分析技術(shù)也稱免疫膠體金技術(shù)，是于1971年建立的一種信號(hào)顯示技術(shù)。此技術(shù)最初用于免疫電鏡檢查，由膠體金顆粒標(biāo)記抗原或抗體，與組織或細(xì)胞中相應(yīng)的抗體或抗原相結(jié)合， 在電子顯微鏡的檢查時(shí)可起特異的示蹤作用。此后，此技術(shù)與銀染技術(shù)相結(jié)合建立的免疫金銀染色法，使抗原抗體特異反應(yīng)信號(hào)可在光學(xué)顯微鏡下觀察。近10多年來，利用硝酸纖維素膜（N。等為固相載體，以膠體金標(biāo)記的抗原或抗體與特異配體的反應(yīng)在膜上進(jìn)行，建立了快速的金標(biāo)記免疫滲濾技術(shù)和金標(biāo)記免疫層析技術(shù)，并在傳染病、心血管病、風(fēng)濕病、自身免疫病的免疫學(xué)檢測(cè)中廣 泛應(yīng)用。膠體金是指金微

3、小粒子（0-100nm）分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系，通常指金以微小粒子 分散在溶液中所形成的金溶膠，用此金溶膠標(biāo)記蛋白質(zhì)（抗原、抗體或 SPA SPG,膠體金顆粒具 有高電子密度的特性，故在金標(biāo)蛋白的抗原抗體結(jié)合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的標(biāo)記處大量聚集時(shí)，可在載體膜上呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，從而用于抗原或抗體物質(zhì)的半定量或定性。與ELISA不同之處便是反應(yīng)時(shí)間大大縮短，僅需要數(shù)分鐘就完成了 ELISA需數(shù)小時(shí)才能顯示的結(jié)果。因?yàn)樵贕IFA和GICA中，高濃度的抗體集中固定在纖維素的微孔中，待測(cè)抗原在滲濾或?qū)游?時(shí)，流經(jīng)微孔與固定的高濃度抗體緊密接觸，很快完成免疫結(jié)合反應(yīng)

4、。這就是以膜為基礎(chǔ)的膠體金快速免疫結(jié)合分析中的免疫濃縮作用。在ELISA中，待測(cè)抗原要在液相中經(jīng)過擴(kuò)散作用，逐漸與吸附在固相表面的抗體結(jié)合。同時(shí)，標(biāo)記抗體也需要同樣的擴(kuò)散結(jié)合過程形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，故需時(shí)間較長(zhǎng)。故此技術(shù)做到了名副其實(shí)的POCT原理：將氯金酸（HAuC用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒（膠體金）蛋白(SPA或抗體，用于免疫印跡、免疫組織化學(xué)定位或快速免疫滲濾、免疫層析實(shí)驗(yàn)。金標(biāo)記免疫滲濾技術(shù)的原理同一般的免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，也是用已知抗原或抗體包被NC膜，再用金標(biāo)記抗體或抗原來進(jìn)行快速快速測(cè)定，陽(yáng)性時(shí)斑點(diǎn)呈膠體金的紅色。改進(jìn)之處為采用了滲濾裝置，更加簡(jiǎn)便。金標(biāo)記免疫層析則是

5、利用 NC膜條狀纖維的毛細(xì)管作用，使樣品在涌動(dòng)中與金標(biāo)記物及包被在NC膜上的抗原或抗體結(jié)合，出現(xiàn)呈色的陽(yáng)性信號(hào)。膠體金的制備：在溶液中金顆粒呈圓形，邊緣平整，界線十分清楚。金顆粒表面帶有大量負(fù)電荷，由于靜電的排斥力，使其在水中保持穩(wěn)定狀態(tài)，形成穩(wěn)定的膠體，所以稱其為膠體金。膠體金的制作方法有白磷還原法，抗壞血酸還原法，檸檬酸三鈉還原法和糅酸一檸檬酸三鈉還原法。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例(即增加或減少還原劑的量)可得到所需不同直徑的金顆粒。但前兩種方法制備得到的金顆粒直徑大小不均一，所以目前常用后兩種方法，以檸檬酸三鈉還原法為例。Frens標(biāo)準(zhǔn)方法：(1)取0、01%HAuCl蛤?夜

6、50mL,加熱煮沸，隨即快速加入 1%寧檬酸三鈉溶液 0.5mL.(2)約過25s沸騰的溶液變?yōu)榈{(lán)色，大約再過70s,藍(lán)色突然轉(zhuǎn)變?yōu)榱良t色，(3)繼續(xù)煮沸約5分鐘后結(jié)束反應(yīng)。(4)冷卻后用0.1MK2CO笳液調(diào)至所需 PH值。(5)此后再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或另加入額外的檸檬酸三鈉都不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該法制備得到的金顆粒直徑約為41nm,如前所述，要想得到更大或更小的金顆粒，該方法依然可行，唯一不同的是需要改變加入還原劑的量。另外，采用此標(biāo)準(zhǔn)方法所需反應(yīng)時(shí)間最短。附注：有研究者已經(jīng)注意到影響膠體金質(zhì)量及其穩(wěn)定性的幾種因素，制備過程中器具若全部使用干凈的玻璃器皿，溶液一律用0.2濾膜過濾后使用，水用玻璃

7、三蒸水，推薦使用超純水，采取這些措施后制得的膠體金很穩(wěn)定。這些措施表明即使很微量的污物都會(huì)對(duì)膠體金制備帶來不良影響。雖然經(jīng)常可見推薦使用硅化玻璃器皿的說法，其實(shí)使用普通玻璃器皿同樣也能制出高質(zhì)量高穩(wěn)定性的膠體金。免疫金的制備膠體金與抗原(或抗體)的結(jié)合物稱為免疫金或膠體金標(biāo)記物，在免疫組織化學(xué)技術(shù)中，又習(xí)慣稱之為金探針。pH和膠體金標(biāo)記蛋白的原理是：在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)所帶正電荷 基團(tuán)之間產(chǎn)生靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對(duì)所標(biāo)記蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。環(huán)境 離子強(qiáng)度是影響膠體金與抗原（抗體）吸附的主要因素，膠體金顆粒的大小、蛋白質(zhì)的分子量及濃度等也影響蛋白質(zhì)的吸

8、附。一般制備方法為：1、膠體金pH的調(diào)整（用K2CO減HCL溶液調(diào)節(jié)pH至選定值。原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)， 也可以略偏堿。但各標(biāo)記物的最適反應(yīng) pH往往需多次試驗(yàn)才能確定）；2、 蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定（將待標(biāo)記蛋白作一系列稀釋后各取一定量加入裝有一定量膠體金的試管 中，然后分別加入 NaCl溶液，混勻靜置數(shù)小時(shí)，對(duì)照管與加入蛋白量不足的管顏色會(huì)由紅變藍(lán)，而蛋白量足或超過的管保持紅色不變，其中含蛋白最低的一管即為穩(wěn)定膠體金所必須的最適標(biāo)記量。以此比例并增加 10%-20魄口為標(biāo)記全部膠體金溶液所需的蛋白總量）；3、標(biāo)記過程（在電磁攪拌棒下將1/10體積的合適濃度的蛋白質(zhì)溶液加于膠體金溶

9、液中，反應(yīng)一定時(shí)間后加入BSA并調(diào)整至pH8.5,放置室溫繼續(xù)反應(yīng)數(shù)分鐘）；4、離心去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)（各粒徑的金粒子所需的離心轉(zhuǎn)速與時(shí)間均不一樣。離心后去上清液，將沉淀用含PEG BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)至原體積后再離心。如此洗滌 2-4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)）。NO!硝酸纖維素膜（nitrocellulosefiltermembrane ,簡(jiǎn)稱Nd）,在膠體金試紙中用做 C/T線的 承載體，同時(shí)也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。國(guó)NC膜的分類主要有兩種：135s和180s。分類是依據(jù)現(xiàn)在大部分廠商用的4cm膜平均水的層析時(shí)間。換算為孔徑就是 135s=8um, 180s=6um。那么從這個(gè)公式中

10、可以看出，在通過同一長(zhǎng)度位置時(shí)，金溶液通過的速度是快速膜慢速膜。那么通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時(shí)還有一個(gè)問題是，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。所以這里就有一個(gè)讀數(shù)時(shí)間/反應(yīng)靈敏度/非特異性結(jié)合的均衡。綜合以上，結(jié)論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時(shí)也減慢了跑板速度，增加了非特異性結(jié)合的機(jī)會(huì)，也就是假陽(yáng)性的升高。所以要按照試驗(yàn)結(jié)果挑選適合實(shí)際項(xiàng)目的膜，找到合適的平衡點(diǎn)至關(guān)重要。根據(jù)專家研究135s的一般用在雙抗體夾心法，180s的一般用在競(jìng)爭(zhēng)法

11、。膠體金免疫分析技術(shù)一、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)原理：膠體金免疫滲濾分析（DIGFA）原理與操作步驟基本與 ELISA相同：加 樣品于固定有配體（抗體或抗原）的硝酸纖維素膜上，通過滲濾在膜中形成抗體-抗原復(fù)合物，洗滌滲濾后，再加液體的膠體金標(biāo)記抗體。當(dāng)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，在膜上固定有抗體-抗原-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物而呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。技術(shù)類型：1、雙抗體夾心法用抗體結(jié)合在微孔膜中央，滴加待檢標(biāo)本，若標(biāo)本中待測(cè)抗原與膜上抗體上結(jié)合，然后滴加金標(biāo)抗體，再加洗滌劑洗滌后，陽(yáng)性者即在膜中央呈紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）。2、間接法用抗原包被在微孔膜上，滴加待測(cè)標(biāo)本，滴加洗滌劑洗滌后，滴加金標(biāo)抗抗體，加洗滌劑洗滌后，陽(yáng)性者即

12、在膜中央呈紅色斑點(diǎn)（膠體金聚集）。該法由于血清標(biāo)本中非目的性的IgG的干擾，易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，臨床上運(yùn)用較少。裝置示意圖裝置分解圖二、斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)原理：斑點(diǎn)金免疫層析實(shí)驗(yàn)（DICA）是膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)相結(jié)合的以微孔濾膜為載體的快速固相膜免疫分析技術(shù)。與膠體金免疫滲濾實(shí)驗(yàn)的過濾性不同，DICA中滴加在膜一端的標(biāo)本溶液受載體膜的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，猶如層析一般，在移動(dòng)過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體（或抗原）結(jié)合而被固化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分 離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。金標(biāo)記免疫層析試曦裝置分解圖I Cfi技術(shù)類型：1、雙抗體夾心法如上圖所

13、示，G處為金標(biāo)記抗體（免疫金），T處為包被抗體，C處包被抗金標(biāo)抗體，B處為吸水紙。測(cè)試時(shí) A端滴加待測(cè)標(biāo)本，通過層析作用，待測(cè)標(biāo)本向B端移動(dòng)，流經(jīng)G處時(shí)將金標(biāo)抗體復(fù)溶，若待檢標(biāo)本中含有待測(cè)抗原，即形成金標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物，移至 T區(qū)時(shí)形成金標(biāo)抗體-抗原-抗體復(fù)合物，金標(biāo)抗體被固定下來，在T區(qū)顯示紅色線條，呈陽(yáng)性反應(yīng)，多余的金標(biāo)記抗體移至 C區(qū)被抗金標(biāo)抗體捕獲，呈現(xiàn)紅色質(zhì)控線條。2、競(jìng)爭(zhēng)法如上圖所示，G處為金標(biāo)抗體，T處包被標(biāo)準(zhǔn)抗原，C處包被抗抗體，測(cè)試時(shí)待測(cè)樣本加于A端，若待測(cè)標(biāo)本中含有待測(cè)抗原，流經(jīng)G處時(shí)結(jié)合金標(biāo)抗體，當(dāng)混合物移至T處，因無足夠游離的金標(biāo)抗體與膜上的標(biāo)準(zhǔn)抗原結(jié)合，T處無棕紅色

14、線條出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，游離金標(biāo)記或金標(biāo)記復(fù)合物流經(jīng) C處，與該處的抗金標(biāo)抗體結(jié)合出現(xiàn)棕紅色的質(zhì)控帶，若標(biāo)本中不含待測(cè)抗原，金標(biāo)抗體則于T處膜上的標(biāo)準(zhǔn)抗原結(jié)合，在 T處出現(xiàn)棕紅色的線條，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。甲勝瑞,工榻磊就怦丫杭必頰守丫板甲SS1ETM骯體科史90城詼34）免疫層析實(shí)除分析說明圖3、間接法為了消除待測(cè)血清標(biāo)本量的非特異性IgG與特異性IgG競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)記抗人IgG,降低試驗(yàn)敏感性，膠體金間接免疫層析法測(cè)抗體常設(shè)計(jì)成反流免疫層析法?？票炯幽慒畦水豺H恁疲層聽M-蒯優(yōu)東府示一國(guó)測(cè)試卡可分為左右折疊的兩部分，右面中央縱向貼有NC膜條為膜上包被有抗原線 T, E處為含能與蛋白結(jié)合的有色染

15、料的樣本加樣區(qū)，F(xiàn)處為吸水材料；左面中央開有觀察窗口B, C處固定有金標(biāo)記羊抗人抗體，A、D處為吸水材料。測(cè)定時(shí)先將緩沖液加在D處層析至C處使金標(biāo)物復(fù)溶，然后將標(biāo)本加在E處使其與染料一起在膜的層析作用下向F端移動(dòng)，若標(biāo)本中有待測(cè)抗體存在，則于膜上抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，待有色染料延伸至膜上標(biāo)記線G處，在F處加緩沖液，合上測(cè)試卡，A的強(qiáng)大吸水作用使膜上液體反向移動(dòng)，標(biāo)本中非特異性IgG及無關(guān)物被洗回E處，隨后而來的金標(biāo)羊抗人抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，出現(xiàn)棕紅色線條。無棕紅色線條出現(xiàn)則表明 血清中無特異性抗體。該法有效的排除了非特異性抗體對(duì)測(cè)試的干擾。臨床應(yīng)用應(yīng)用圍包括感染性疾病抗原、抗體檢測(cè)

16、，如HBsAg瘧原蟲抗原、TB- Ab、HP-Ab、HIV-Ab等；各種蛋白質(zhì)抗原檢測(cè)，如 AFP CEA肌紅蛋白、肌鈣蛋白、尿微量白蛋白、O睹；激素檢測(cè)，如HCG LH、FSH TSH等；藥物檢測(cè)，如嗎啡、可卡因等。適用圍一般為定性試驗(yàn)。樣本要求：樣本采集后應(yīng)盡快分離血清或血漿以避免溶血。檢測(cè)時(shí)應(yīng)盡量使用新鮮的樣本。樣本若不能及時(shí)送檢，可在2。-8。冷藏3天。長(zhǎng)期保存需冷凍于-20 ° C,忌反復(fù)凍融。發(fā)臭、溶血、脂血、細(xì) 菌污染等異常樣本請(qǐng)勿使用。注意事項(xiàng)：以GICA為例，它將幾種組分優(yōu)化組合成一個(gè)整體的免疫層析分析條，許多條件及條件的組合都會(huì)影響到它的質(zhì)量，包括：（1）硝酸纖維

17、素膜的性能和質(zhì)量，膜孔徑大小及均一性，選定膜孔 徑的適宜性，結(jié)合配體（抗原或抗體）容量的大小，非特異吸附性能，親水性及液體的流動(dòng)性和流 動(dòng)速度的均一性等；（2）捕捉配體的量及質(zhì)量（配體的純度，親和力及滴度）及在膜上配體的包 被量和均一性。配體劃線位置的固定一致性；（3）固相金標(biāo)記膜中的膠體金和配體的含量和比度， 條間的均一性，固相標(biāo)記物的穩(wěn)定性，復(fù)溶性，復(fù)溶速度及流動(dòng)性，所含緩沖物質(zhì)的種類及有效促溶劑的使用等；（4）各種膜，甚至包括樣品墊是否經(jīng)過預(yù)期處理以減少非特異吸附。以上條件都可以綜合影響膠體免疫層析的質(zhì)量控制，主要包括：靈敏度，陰陽(yáng)性界限值（cutoff ）的準(zhǔn)確性和一致性及層析條間的重

18、復(fù)性等。（1）靈敏度：因測(cè)定主要針對(duì)正常人體液中不存在或含量很低的生物活性物質(zhì)的定性結(jié)果。高靈敏度及其重復(fù)性是最重要的質(zhì)量控制指標(biāo)。為此，生產(chǎn)廠家在保證分析條的各種優(yōu)化條件外，還應(yīng)提供能確證靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)品，供操作者檢驗(yàn)其靈敏度和重復(fù)性。另外，還應(yīng)配有相應(yīng)的陽(yáng)性及陰性對(duì)照血清以供對(duì)照之用。（2）陰陽(yáng)性界限值的準(zhǔn)確性和重復(fù)性：避免發(fā)生假陰性或假陽(yáng)性的結(jié)果，保證結(jié)果的正確。生產(chǎn)廠家應(yīng)提供確定界限值的標(biāo)準(zhǔn)品，最好還要提供低于或高于界限值的標(biāo)準(zhǔn)品（注明濃度），以供使用者對(duì)結(jié)果的判斷。所有試劑板均應(yīng)于干燥環(huán)境下恢復(fù)至室溫再拆封使用。應(yīng)用的重點(diǎn)和展望臨床應(yīng)用的重點(diǎn)應(yīng)放在： 急需快速診斷以便進(jìn)行治療的急重癥，如協(xié)助確診急性心肌梗死的急性心梗標(biāo)志物就是很好的例子。有普查意義的檢查和流行病學(xué)調(diào)查：如各種傳染病（病毒性肝炎， 艾滋病，性病及其它各種流行?。┝餍胁≌{(diào)查；某些腫瘤（如前列腺癌，結(jié)腸癌，肝癌，乳腺癌） 的普查及預(yù)防檢查； 圍產(chǎn)期的健康普查等。它可以作為快速的初篩普查手段，對(duì)陽(yáng)性和可疑的結(jié)果 再進(jìn)一步做更細(xì)的可靠的檢查。今后的發(fā)展：（1）全面提高質(zhì)量。突出質(zhì)量控制的保證，為進(jìn)一步發(fā)展打好基礎(chǔ)。（2）提高檢測(cè)的靈敏度。目前檢測(cè)的靈敏度都低于相應(yīng)的定量免疫分析，應(yīng)盡量縮小差距。除使用各種優(yōu)質(zhì)的原料，如膜條，高純度高親和