人源M2三聯(lián)體靶抗原BPOE2融合蛋白的克隆表達(dá)與鑒定

1、人源M2三聯(lián)體靶抗原BPO-E2融合蛋白的克隆表達(dá)與鑒定 作者:周曄，姚定康，陳燕，蔣天舒，蔣廷旺，吳傳勇，陳波，鄧安梅摘要 目的 用基因工程的方法克隆表達(dá)抗線粒體抗體二亞型（AMA-M2）的3個(gè)靶抗原側(cè)鏈二氧酸脫氫酶復(fù)合體E2（BCOADC-E2）、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2（PDC-E2）、2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2（OGDC-E2）及其連接形成的三聯(lián)體BPO-E2融合蛋白，以用于人原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）的早期發(fā)現(xiàn)和臨床診斷。方法 針對(duì)BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，從正常人的淋巴細(xì)胞中提取RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR方法擴(kuò)增得到相應(yīng)的基因片段，經(jīng)測(cè)

2、定序列驗(yàn)證后插入表達(dá)載體pET28a（+），構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a(+）-BCOADC-E2、pET28a(+)-PDC-E2、pET28a(+)-OGDC-E2、pET28a(+)-BPO-E2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)。表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE、Western-blot等鑒定。結(jié)果 經(jīng)核苷酸序列測(cè)定和酶切鑒定結(jié)果表明，成功地構(gòu)建了4種重組質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得4種融合蛋白。經(jīng)免疫學(xué)鑒定，重組抗原片段具有AMA-M2的免疫原性。結(jié)論 重組表達(dá)的融合蛋白將有利于原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）的實(shí)驗(yàn)室診斷。 關(guān)鍵詞 肝硬化，膽汁性；自身抗原；重組融合蛋白質(zhì)類

3、cDNA cloning and expression of autoantigen BPO-E2 Abstract Objective To express BPOE2 recombinant fusion protein in E.coli.in order to be used in early diagnosis of PBC.Methods The cDNA encoding BCOADC-E2，PDC-E2 and OGDC-E2 were obtained by RT-PCR，confirmed by DNA sequencing，subcloned unidirectional

4、ly into the bacterial expression plasmid pET28a(+) and then transformed into E.coli.，BL21(DE3) to express the recombinant fusion protein induced by IPTG.Results The recombinant fusion protein exhibited the antigenicity of AMA-M2 by western blotting.Conclusion The BPO-E2 recombinant fusion protein co

5、uld be used for diagnosis of PBC. Key words liver cirrhosis，biliary;autoantigens;recombinant fusion proteins 原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC)是一種以肝內(nèi)中、小膽管的非化膿性進(jìn)行性炎性損傷為特征，最終導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭的典型自身免疫性疾?。ˋID）1，2。在PBC患者體內(nèi)可檢出多種自身抗體，如抗核抗體（ANA）、抗線粒體抗體（AMA）、抗平滑肌抗體（SMA）、抗肝腎微粒體抗體（LKM）等，其中最主要的抗體是AMA3，4。AMA分為M1M9共

6、9個(gè)亞型，而只有M2為PBC特異抗體。AMA-M2抗體對(duì)PBC檢測(cè)的敏感性達(dá)93%以上，特異性幾乎達(dá)100%5。M2抗體的靶抗原為線粒體上的2-氧酸脫氫酶復(fù)合體（2-OADC）的一些組分：丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2（PDC-E2）、2-氧酸脫氫酶復(fù)合體E2（BCOADC-E2）、2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2（OGDC-E2）等。筆者用基因工程的方法表達(dá)BPO-E2融合蛋白，為PBC的早期發(fā)現(xiàn)和特異性診斷提供有效手段。 1 資料與方法 1.1 一般資料 1.1.1 血清標(biāo)本 22例血清來(lái)源于我院住院病人，經(jīng)德國(guó)Euroimmun公司免疫印跡試劑盒測(cè)定，M2抗體為陽(yáng)性。 1.1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄酶

7、、PCR擴(kuò)增試劑盒、RNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品。各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。pET-28a（+）質(zhì)粒及大腸桿菌BL21（DE3）購(gòu)自Novagen公司。間接免疫熒光法測(cè)定AMA試劑盒購(gòu)自Euroinmun公司。 1.1.3 引物 參照人BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2全序列，設(shè)計(jì)引物。BCOADC-E2正向引物：5-ATCGCATCCGCACAGGTTGTTCAGTTCAT-3；BCOADC-E2反向引物：5-TAATTTTTGCA TGCACGGCGAACTGCAGGAGT-3。PDC-E2正向引物：5-TTCGCCGTGCAAAAAT

8、TAT ACACTGGTATCCTG -3; PDC-E2反向引物：5-ACAGCTGTGAGCTCTAAATCTGTTACTTCGGTTG-3。OGDC-E2正向引物：5-CAGATT TAGAGCTCACAGCTGTATGCAAGGATGA-3；OGDC-E2反向引物：5-ATCGCGTCGACAGGAGCAGCACCATG TTTCC-3。 1.2 方法 1.2.1 基因克隆操作 用淋巴細(xì)胞分離液從健康人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，得到的白細(xì)胞抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。pET-28a（+）質(zhì)粒分別用BamH1和Sph1、Sph1和Sac1、Sac1和Sal1、BamH1和Sal1雙酶切

9、后，經(jīng)T4DNA連接酶的作用將BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、BPO-E2的cDNA對(duì)應(yīng)定向插入其中。送上海生工生物工程技術(shù)公司測(cè)定序列進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94變性1min，56退火1min，72延伸1min，35個(gè)循環(huán)后再進(jìn)行72延伸5min。 1.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和鑒定 將重組質(zhì)粒用氯化鈣轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入宿主菌BL21（DE3），加入LB培養(yǎng)液37震蕩培養(yǎng)45min后涂布于LB平板上（含終濃度100g/ml卡那霉素）培養(yǎng)過(guò)夜。抽提質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察重組質(zhì)粒和酶切后的產(chǎn)物，見(jiàn)圖1。注:Lane 1：pET28a(+)質(zhì)粒;Lane 2：BamH1和Sp

10、h1酶切后的pET28a(+)-BCOADC-E2質(zhì)粒;Lane 3：Sph1和Sac1酶切后的pET28a(+)-PDC-E2質(zhì)粒;Lane 4：Sac1和Sal1酶切后的pET28a(+)-OGDC-E2質(zhì)粒;Lane 5：BamH1和Sal1酶切后的pET28a(+)-BPO-E2質(zhì)粒M. DNA Marker DL2000圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖 1.2.3 重組融合蛋白的收集和純化 次日挑取轉(zhuǎn)化平皿上的菌落，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37搖床培養(yǎng)擴(kuò)增至A600為0.4左右，加入終濃度為0.1mg/ml的異丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG），誘導(dǎo)表達(dá)4h，4離心收集菌液。將

11、菌液反復(fù)凍融4次，經(jīng)超聲破碎儀以300W，15s，破碎4次，以上操作在冰浴中進(jìn)行。然后在4，10000g離心15min，收集沉淀，以含0.5%TritonX-100，10mmol/L EDTA的緩沖液洗滌后，用100l裂解緩沖液（含0.1mmol/L PMSF，8mol/L尿素，10mmol/L DTT)溶解包涵體，室溫放置1h。再加入900l氧化還原緩沖液，最后離心取上清液。將上清液流經(jīng)PBS平衡后的GST親合層析柱，經(jīng)PBS 20ml洗滌后，用5mmol/L還原型谷胱甘肽溶液洗脫，收集洗脫液進(jìn)行15%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺膠電泳（SDS-PAGE）分析。 1.2.4 重組蛋白抗原性的鑒

12、定 BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2、BPO-E2重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)印，200mA，40V，2h。將轉(zhuǎn)印后的NC膜剪成條帶，用含5%BSA的PBS封閉1h，與11000稀釋的人M2陽(yáng)性血清為一抗反應(yīng)2h，充分洗滌后與11000稀釋的HRP標(biāo)記的免抗人IgG二抗反應(yīng)2h，再次洗滌后加入3，3-二氨聯(lián)苯胺底物及雙氧水反應(yīng)顯色。 2 結(jié)果 2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 按上述條件擴(kuò)增出379bp、442bp、279bp的片段，經(jīng)DNA測(cè)序表明它們是BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-F2基因的精確拷貝。 2.2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR從正常人外周

13、血單個(gè)核細(xì)胞中擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，克隆入表達(dá)載體pET28a(+)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a（+）-BCOADC-E2、pET28a（+）-PDC-E2、pET28a（+）-OGDC-E2、pET28a（+）-BPO-E2，重組載體用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1，序列經(jīng)測(cè)定完全正確。再將表達(dá)4種融合蛋白的重組體導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）中。 2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組質(zhì)粒的工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，在細(xì)菌裂解液（上清液）中可見(jiàn)有一條明顯的額外蛋白帶，相對(duì)分子量為14×103（BCOADC）、18×103（PDC）、10×

14、103（OGDC）、42×103（BPO）（見(jiàn)圖2）。注:Lane 1：含pET28a(+)質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液;Lane 2：含BCOADC重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液;Lane 3：含PDC重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液；Lane 4：含OGDC重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液;Lane 5：含BPO重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解液M. Protein Marker圖2 融合蛋白的12%SDS-PAGE電泳圖 2.4 重組蛋白抗原性的鑒定 選取22例M2陽(yáng)性的病人血清，采用Western-blot方法進(jìn)行檢測(cè)，抗BCOADC-E2抗體陽(yáng)性19例，陽(yáng)性率為86.4%；抗PDC-E2抗體陽(yáng)性為21例，陽(yáng)性率為95.5%；抗OGD

15、C-E2抗體陽(yáng)性18例，陽(yáng)性率為81.8%；抗BPO-E2抗體全部為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100%。 3 討論 PBC好發(fā)于中老年婦女，男女發(fā)病比率約為110，起病隱匿，病程緩慢，病程中可有瘙癢、黃疸、脂肪代謝紊亂、肝脾腫大和貧血，晚期出現(xiàn)肝硬化和肝功能衰竭的各種臨床表現(xiàn)。肝功能檢查ALP和-GT明顯升高，血清膽紅素升高，以直接膽紅素升高為主。據(jù)國(guó)外研究報(bào)道，PBC發(fā)病率約為（224）/10萬(wàn)，年發(fā)病率為（0.43.0）/10萬(wàn)，且該數(shù)值有逐年遞增趨勢(shì)6。近年來(lái)國(guó)內(nèi)PBC發(fā)病率亦不斷增加7，中國(guó)PBC人群的易感基因是HLA-DRB1*078，但尚不清楚，這是PBC發(fā)病數(shù)真正增加還是對(duì)該病的認(rèn)識(shí)加強(qiáng)，診

16、斷增加所致。因此，對(duì)PBC的早期發(fā)現(xiàn)和臨床診斷顯得尤為重要。AMA中只有M2抗體為PBC特異性抗體，其他亞型可見(jiàn)于很多疾病如藥物損害、心肌病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及一些感染如結(jié)核、梅毒等。間接免疫熒光法無(wú)法對(duì)AMA分型，用于診斷PBC的特異性差。本試驗(yàn)檢測(cè)的22例M2陽(yáng)性的病人血清中，全部與BPO-E2融合蛋白反應(yīng)。M2抗原在細(xì)胞內(nèi)含量較少，傳統(tǒng)生物化學(xué)方法提純和制備抗原有很大的局限性，操作復(fù)雜、成本高，很難獲得純化的線粒體抗原，影響檢測(cè)結(jié)果。而利用本方法可大量獲得所需抗原，可用于PBC的免疫學(xué)診斷，為PBC的早期發(fā)現(xiàn)和臨床診斷提供有力工具。參考文獻(xiàn) 1 Charatcharoenwitthaya

17、P，Lindor KD.Current concepts in the pathogenesis of primary biliary cirrhosis.Ann Hepatol，2005，4(3):161-175. 2 Yoneyama K，Yamazaki M，Kogo M.Prognostic factors of primary biliary cirrhosis detected by health screening.Minerva Gastroenterol Dietol，2006，52(1):97-105. 3 Ishibashi H，Shimoda S，Gershwin ME.The immune response to mitochondrial autoantigens.Semin Liver Dis，2005，25(3):337-346. 4 Abdul-Aziz K，F(xiàn)aizal AA.Serological diagnosis of autoimmune hepatobiliary diseases.Saudi Med J，2005，26(12):1875-1881. 5 Persch W，Becker HD.Frequency and prognosis of gas