《細胞生物學實驗》教學大綱 - 蘭州大學生命科學學院

1、細胞生物學實驗教學大綱課程編號： 課程名稱：細胞生物學小實驗選修類型：必修課實驗學時： 36總學分：1考核方式：實驗操作實驗報告考試開課時間：第四學期適合專業(yè)：生命學院全部專業(yè)實驗教材：細胞生物學實驗（第三版），王崇英、高清祥主編，2011，高等教育出版社一、本課程的性質和任務本課程為生物學各專業(yè)的必修基礎課之一，主要從整體、顯微、分子水平觀察細胞的基本形態(tài)結構，將課堂講授的細胞生物學的基礎知識、基本概念和基本理論與實際相結合，同時進行一些相對簡單的實驗技術的操作，培養(yǎng)學生的相關實驗操作技能和初步獨立進行科學研究的能力?？傮w來說包含三個部分：光學顯微鏡的使用、細胞器的定位與觀察及動植物細胞染色

2、體行為。二、教學要求與教學方法1. 學生動手觀察為主，老師講解注釋為輔。2. 實驗從第二周開始，每次3學時，部分實驗整合在一起完成。3. 要求1人1組，獨立完成。4. 要求分期實驗報告，并入最終成績。三、教學學時分配和安排周 次實 驗 內 容學 時第1周普通光學顯微鏡與高爾基體、中心體的觀察3第2周液泡及線粒體的活體染色與觀察3第3周相差顯微鏡與細胞核的活體觀察3第4周熒光顯微鏡與葉綠體的活體觀察3第5周細胞骨架微管、微絲的熒光定位3第6周細胞的生死狀態(tài)鑒定與細胞凋亡3第7周小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測3第8周小鼠睪丸染色體標本的制備3第9周植物根尖的壓片及有絲分裂過程觀察3第10周植物花藥的

3、壓片及減數(shù)分裂過程觀察3第11周植物花藥的壓片及減數(shù)分裂過程觀察3第12周報告基因的細胞水平觀察， 考試3四、教學內容和要求實驗一 普通光學顯微鏡的原理與使用目的要求 理解普通光學顯微鏡的機械系統(tǒng)和光學系統(tǒng)的結構組成及其工作原理；熟練掌握普通光學顯微鏡的使用方法并進行實際操作；了解高爾基體、中心體的形態(tài)結構和分布特點。實驗原理 普通正置顯微鏡的構造：機械部分、照明部分和光學放大。教學內容 了解普通光學顯微鏡的構造，掌握顯微鏡的使用方法和保養(yǎng)措施；觀察和了解高爾基體、中心體的形態(tài)結構和分布特點。實驗材料和用品 顯微鏡，玻片標本，香柏油，混合液，棉花。實驗二 液泡及線粒體的活體染色與觀察目的要求

4、觀察和了解活細胞內液泡和線粒體的形態(tài)結構與分布特點。實驗原理 詹納斯綠（Janus green B）可專一性地對線粒體進行活染,這是由于線粒體內細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài)),呈藍綠色。中性紅（neutral red）對液泡和溶酶體的染色具有專一性，將活細胞中的液泡和溶酶體染成紅色。教學內容 用詹納斯綠對口腔細胞線粒體進行活染并觀察；用中性紅對植物根尖液泡活染并觀察。實驗材料和用品 植物根尖，顯微鏡，詹納斯綠B，中性紅染液。實驗三 相差顯微鏡與細胞核的活體觀察目的要求 了解相差顯微鏡的成像原理，熟練掌握相差顯微鏡的操作，對同一視野下的活細胞進行普通及相差顯微鏡下的

5、觀察比較。實驗原理 相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細節(jié)，適用于對活體細胞生活狀態(tài)下的生長、運動、增殖情況及細微結構的觀察。教學內容 熟悉相差顯微鏡的結構和使用方法；用相差顯微鏡觀察未染色的洋蔥表皮細胞的細胞壁和細胞核特征。實驗材料和用品 洋蔥，相差顯微鏡。實驗四 熒光顯微鏡與葉綠體的活體觀察目的要求 了解熒光顯微鏡的成像原理，熟練掌握熒光顯微鏡的操作。在熒光顯微鏡下觀察植物葉綠體的自發(fā)熒光。實驗原理 熒光顯微鏡利用物質發(fā)出的熒光來成像。細胞的有些物質成分不經過染色就能發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光，如植物細胞的葉綠素。教學內容 熟悉熒光顯微鏡的結構和使用方法；用熒光顯微鏡觀察綠色植物葉片的葉綠體分布和特

6、征。實驗材料和用品 植物葉片，熒光顯微鏡。實驗五 細胞骨架微管、微絲的熒光定位目的要求 掌握微管的間接免疫熒光顯微技術和微絲直接熒光標記定位的原理和方法；觀察微管和微絲在培養(yǎng)細胞中的形態(tài)及分布方式。實驗原理 本實驗采用人的微管蛋白單克隆抗體作為第一抗體與細胞內的微管蛋白結合，再使用FITC標記的山羊抗小鼠二抗與一抗結合，最終在熒光顯微鏡下即可觀察到微管的存在狀態(tài)。鬼筆環(huán)肽（phalloidin）與聚合的微絲具有強親和力，可抑制微絲的解聚，使微絲保持穩(wěn)定狀態(tài)。因此用熒光標記物標記的鬼筆環(huán)肽染色在熒光顯微鏡下可以清晰的顯示細胞內微絲的分布。教學內容 用抗體標記培養(yǎng)細胞的微管、用鬼筆環(huán)肽對微絲進行染

7、色，熒光顯微鏡下觀察細胞骨架。實驗材料和用品細胞爬片，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，熒光顯微鏡，微量加樣器，小鼠抗人tubulin的單克隆抗體，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠的熒光二抗，鬼筆環(huán)肽。實驗六 細胞的生死狀態(tài)鑒定與細胞凋亡目的要求 掌握鑒定細胞生活狀態(tài)的不同染色方法及細胞的狀態(tài)特征，了解凋亡細胞的形態(tài)學特征。實驗原理 臺盼藍是一種陰離子型染料，不能透過完整的細胞膜，所以經臺盼藍染色后只能使死細胞著色，而活細胞不被著色。吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染法也可鑒別死活細胞。AO能透過質膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光；EB僅能透過質膜受損的細胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。

8、細胞凋亡時發(fā)生獨特的形態(tài)變化，主要表現(xiàn)在：細胞體積縮小，染色質凝集并邊緣化，細胞膜完整，但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，凋亡晚期可見膜泡從細胞表面脫落形成凋亡小體。教學內容 用不同染料對培養(yǎng)細胞進行染色，觀察活細胞和死細胞的染色區(qū)別。用經藥物誘導發(fā)生凋亡的培養(yǎng)細胞進行形態(tài)學觀察。實驗材料和用品 HL-60細胞，普通顯微鏡，熒光顯微鏡，離心機，微量移液器，臺盼藍、吖啶橙、溴化乙錠染液。實驗七 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能檢測目的要求 掌握小鼠腹腔巨噬細胞體外吞噬異物能力的測定方法；觀察機體的非特異性免疫現(xiàn)象；掌握小白鼠腹腔注射給藥和小白鼠腹腔巨噬細胞分離方法。實驗原理 侵入機體的病原微生物或其它異物能招引組織中的巨

9、噬細胞，后者細胞膜凹陷伸出偽足包圍異物，并發(fā)生胞吞作用形成吞噬泡，繼而巨噬細胞質中的溶酶體與吞噬泡融合，消化分解異物。教學內容 首先給小鼠腹腔提前注射含有臺盼藍染料的淀粉肉湯，隔天再腹腔注射雞紅細胞作為異物顆粒，斷椎脫臼處死小鼠并剪開腹腔吸取腹腔液進行吞噬觀察。實驗材料和用品 小鼠，1%雞紅細胞，6淀粉肉湯，4臺盼藍(Trypan blue)，：顯微鏡、注射器、滴管、剪刀、鑷子。實驗八 小鼠睪丸染色體標本的制備目的要求 掌握動物生殖細胞減數(shù)分裂過程及各個時期形態(tài)特點，掌握小鼠睪丸減數(shù)分裂標本的制備過程。實驗原理 睪丸是雄性生殖細胞發(fā)育和成熟的部位，是產生精子的器官。睪丸內的曲細精管從外到內分布

10、有精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞以及成熟的精子。取睪丸將曲細精管內的細胞沖出后固定，然后制片染色，可以觀察到動物生殖細胞減數(shù)分裂的不同時相。教學內容 斷椎脫臼處死小鼠并剪開腹腔取睪丸，破碎離心制細胞懸液，滴片Giemsa染色后進行不同類型生殖細胞的觀察，包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精細胞和精子。實驗材料和用品 雄性小鼠， Giemsa染液，顯微鏡，離心機，水浴鍋，酒精燈。實驗九 植物根尖的壓片及有絲分裂過程觀察目的要求 學習并掌握常規(guī)壓片法制備植物染色體標本的基本原理和方法；觀察植物細胞有絲分裂過程中染色體的形態(tài)特征及染色體動態(tài)行為變化。實驗原理 有絲分裂(mit

11、osis)是高等真核生物細胞分裂的主要方式。其特點是細胞通過有絲分裂裝置或紡錘體將遺傳物質精確地等分到兩個子細胞中去，以保證細胞在增殖的過程中保持遺傳穩(wěn)定。傳統(tǒng)上，人們將有絲分裂過程劃分為前期、前中期、中期、后期、末期和胞質分裂6個時期。前5個時期是一個先后連續(xù)的核分裂過程，胞質分裂則相對獨立。教學內容 取植物生長旺盛的分生組織，如根尖、莖尖、愈傷組織等，經過水解軟化細胞壁后進行壓片、或經過酶解和低滲處理制成細胞懸液進行滴片，在普通光學顯微鏡下觀察細胞內的有絲分裂圖像。實驗材料和用品 青稞根尖，混合酶液，卡寶品紅染色液，顯微鏡。實驗十 植物花藥的壓片及減數(shù)分裂過程觀察 目的要求 掌握制備植物細

12、胞減數(shù)分裂標本的壓片技術；了解高等植物細胞減數(shù)分裂過程，觀察染色體的動態(tài)變化；學會區(qū)分植物細胞減數(shù)分裂的各個不同時期。實驗原理 減數(shù)分裂（meiosis）在遺傳上具有重要意義，在分裂過程中包含有同源染色體的配對、交換、分離和非同源染色體的自由組合，是生物遺傳和變異的細胞學基礎。在適當?shù)臅r候采集植物的花蕾，擠出花粉母細胞后直接染色并壓片后制成減數(shù)分裂標本，在顯微鏡下觀察可以看到花粉母細胞減數(shù)分裂的各個時期，研究染色體在形態(tài)和數(shù)量上的動態(tài)變化特點。教學內容 用百合花藥切片對減數(shù)分裂各個時期的形態(tài)特點進行講解；采集不同植物的花蕾，擠出花粉母細胞進行固定和染色，顯微鏡下進行減數(shù)分裂各個時期的觀察，掌握時期觀察。實驗材料和用品 百合花藥切片，開花植物花蕾，卡寶品紅顏色液，顯微鏡。實驗十一 報告基因的細胞水平檢測目的要求 熟悉GUS報告基因的技術原理，了解其在細胞水平上的原位檢測方法。實驗原理 GUS基因存