膳食纖維的測定

1、粗纖維”一詞最早用于營養(yǎng)學研究，并被認為是對人體不起營養(yǎng)作用的一種非營養(yǎng)成分。然而近年來分析技術(shù)的發(fā)展和對這種非營養(yǎng)素”認識的提高，粗纖維”也被 膳食纖維”所替代，而且賦予更豐富的內(nèi)容。膳食纖維大致分為二類，一類為可溶性的，一 類為不可溶性的，二者合并即為總的膳食纖維。它主要包括植物細胞壁的成分如纖維素、 半纖維素、果膠、木質(zhì)素、角質(zhì)和二氧化硅等成分，最早曾有中型洗滌劑法和酸性洗滌 劑法等，測定結(jié)果常不能包括全部。本章所介紹的Englist建立的、AOAC推薦的方法。它主要測定為可溶性的膳食纖維、不可溶性膳食纖維和總膳食纖維三種。膳食纖維實際上屬于碳水化合物的范疇。膳食纖維的物化特性主要包括

2、5個方面：（1）很高的持水力。（2）對陽離子有結(jié)合和交換能力。（3）對有機化合物有吸附螯合作用。（4）具有類似填充劑的充盈作用。（5）可改變腸道系統(tǒng)中的微生物群系組成。膳食纖維的測定方法主要有三種，包括非酶-重量法、酶重量法和酶化學法。非酶重量法是一個比較古老的方法，只能用于粗纖維的測定。 而中性洗滌劑法也只能測定不溶性的膳食纖維。酶重量法卻可以測定總膳食纖維（包括可溶和不可溶性膳食纖維），也是AOAC的標準方法。酶化學法是 AOAC最新承認的另一個標準方法，但此法易受儀 器條件的限制，不適用于普通實驗室。目前國標采用的還是中性洗滌劑法，食物成分表 中列出的數(shù)據(jù)都是不溶性膳食纖維，所以下文先介

3、紹不溶性膳食纖維的測定方法。（一）中性洗滌劑法1. 原理在中性洗滌劑的消化作用下， 樣品中的糖、淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)被溶解除去，不能消化的殘渣為不溶性膳食纖維，主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、角質(zhì)和二氧 化硅等，并包括不溶性灰分。2. 適用范圍GB 1239490適用于各類植物性食物和含有植物性食物的混合食物中不溶性膳食 纖維的測定。3儀器（1）烘箱：110 130C。(2) 恒溫箱：(372 C。(3) 纖維測定儀。(4) 如沒有纖維測定儀，可由下列部件組成：電熱板：帶控溫裝置。高型無嘴燒杯：600mL。玻料坩堝：容量 50mL,孔徑4060“?；亓骼淠b置。抽濾裝置：由抽濾瓶、抽濾墊

4、及水泵組成。4試劑實驗用水均為蒸餾水，試劑不加說明均為分析純試劑。(1) 無水亞硫酸鈉。(2) 石油醚：沸程 3060 C。(3) 丙酮。(4) 甲苯。(5) 中性洗滌劑溶液：將 18.61gEDTA二鈉鹽和6.81g +水合四硼酸鈉置于燒杯中，加水約150mL,加熱使之溶解，將30g月桂基硫酸鈉和10mL乙二醇獨乙醚溶于約 700mL 熱水中，合并上述兩液，再將 4.56g無水磷酸氫二鈉溶于150mL熱水中，再并入上述溶 液中，用磷酸調(diào)節(jié)上述混合液至pH6.97.1，最后加水至1000mL。(6) 磷酸鹽緩沖液：由38.7mL 0.1mol/L磷酸氫二鈉和61.3mL 0.1mol/L磷酸二

5、氫鈉 混合而成，pH為7。(7) 2.5% a淀粉酶溶液：稱取2.5g a淀粉酶(Sigma公司，VI-A型，產(chǎn)品號6880) 溶于100mLpH7的磷酸鹽緩沖溶液中，離心，過濾，濾過的酶液備用。(8) 耐熱玻璃棉：耐熱 130C，美國Corning玻璃廠出品，PYREX牌。5. 操作步驟(1) 樣品制備： 糧食：磨粉，過20目篩(1mm),貯于塑料瓶內(nèi)，蓋緊瓶塞保存，備用。 蔬菜及其他植物性食物：取其可食部，用水洗凈，紗布吸去水分，打碎，沸合 均勻后備用。 脂肪含量超過10%樣品：需先去除脂肪，即樣品1.00g，用石油醚提取3次，每次10mL。(2) 取樣0.51.0g，力口 100mL中性

6、洗滌劑溶液，再加 0.5g無水硫酸鈉。(3) 電爐加熱，5min內(nèi)使其煮沸，移至電熱板上，保持微沸1h。(4) 于玻料坩堝中鋪1g玻璃棉，移至烘箱中，110 C4h,取出置干燥器中，晾至 室溫，萬分之一天平稱重，得 ml。(5) 將煮沸后樣品趁熱倒入濾器，用水泵抽濾。用600mL熱水(90100C),分 數(shù)次洗燒杯及濾器，抽干。洗凈濾器下部的液體和泡沫，塞上橡皮塞。(6 )于濾器中加酶液，液面需覆蓋纖維，用細針擠壓掉其中氣泡，加幾滴甲苯， 蓋上表玻皿，37 C恒溫箱中過夜。(7) 取出濾器，除去底部塞子，抽去酶液， 并用300mL熱水分數(shù)次洗去殘留酶液，用碘液檢查，如有殘留，繼續(xù)加酶水解，如淀

7、粉已除盡，抽干，再以丙酮洗2次。(8) 將濾器置烘箱中，110C 4h,取出，置干燥器中，晾至室溫，精確稱重，得m2。6. 計算式中3樣品中不溶性膳食纖維的含量，；ml濾器加玻璃棉的質(zhì)量，g;m2 濾器加玻璃棉及樣品中纖維的質(zhì)量，g;m樣品質(zhì)量，go7. 注意事項(1 )因酶配成溶液后其活力會隨時間延長而下降，從而影響酶解效力，所以酶溶 液需當天現(xiàn)配。(2) 過濾時若遇到操作困難，可采取滴加淀粉酶和將樣品稱重減少至0.3g的方法 來加快過濾。(3) 每次實驗用完的坩堝去除玻璃棉，若玻板上殘渣較多，可用重鉻酸鉀洗液浸 泡數(shù)小時后取出，用水沖洗干凈以備下次實驗使用。(二)酶重量法1. 原理樣品分別

8、用a淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶進行酶解消化以去除蛋白質(zhì)和可消化的淀粉?？偵攀忱w維(TDF)是先酶解，然后用乙醇沉淀，再將沉淀物過濾，將TDF殘渣用乙醇和丙酮沖洗，干燥稱重。不溶性和可溶性膳食纖維(IDF和SDF是酶解后將IDF過濾，過濾后的殘渣用熱水沖洗，經(jīng)干燥后稱重。SDF是將上述濾出液用4倍量的95%乙醇沉淀，然后再過濾，干燥，稱重。TDF IDF和SDF量通過蛋白質(zhì)、灰分含量進行校正。2. 適用范圍本方法適用于各類植物性食物和保健食品(AOAC991.43)。3儀器(1) 燒杯：400mL或600mL高腳型。(2) 過濾用坩堝：玻料濾板，美國試驗和材料學會 (ASTM) 4060 口m,

9、 Pyrex 60mL(Corning No.36060 buchner，或同等的)。如下處理： 在灰化爐525C灰化過夜。爐溫降至 130C以下取出坩堝。 用真空裝置移出硅藻土和灰質(zhì)。 室溫下用2%清洗溶液浸泡1h。 用水和去離子水沖洗坩堝；然后用15mL丙酮沖洗然后風干。 在干燥的坩堝中加0.5g硅藻土，在130 C烘干恒重。 在干燥器中冷卻1h，記錄坩堝加硅藻土質(zhì)量，精確至 0.1mg。(3) 真空裝置： 真空泵或抽氣機作為控制裝置。 1L的厚壁抽濾瓶。 與抽濾瓶相配套的桷皮圈。(4) 振蕩水浴箱： 自動控溫使溫度能保持在(98 2 Co 恒溫控制在60 C。(5) 天平：分析級，精確到

10、 土 0.1mg(6) 馬福爐：溫度控制在(5255 C。(7) 干燥箱：溫度控制在 105C和(1303) C。(8) 干燥器：用二氧化硅或同等的干燥劑。干燥劑兩周一次在130 C烘干過夜。(9) pH計：注意溫控，用pH4.0、7.0和10.0緩沖液標化。(10) 移液管及套頭：容量 100 口 L和5mLo(11) 分配器或量筒： (15 0.5 mL,供分配78%的乙醇、95%的乙醇以及丙酮。 (40 0.5 mL，供分配緩沖液。(12) 磁力攪拌器和攪拌棒。4試劑全過程使用去離子水，試劑不加說明均為分析純度劑。(1) 乙醇溶液： 85 % :力口 895mL95%乙醇在1L量筒中，用

11、水稀釋至刻度。 78 % :加821mL95%乙醇在1L量筒中，用水稀釋至刻度。(2) 丙酮。(3) 供分析用酶：在 05 C下貯存。 熱穩(wěn)定 a淀粉酶溶液：Cat. No. A3306, Sigma Chemical Co, St.Louis, MO63178, 或 Termamyl 300L, Cat. No. 361 6282, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark，或等效 的酶。 蛋白酶：Cat. No. P3910, Sigma Chemical Co.或等效的。當天用 MES/TRIS緩沖 液中現(xiàn)配50mg/mL酶溶液。 淀粉葡糖苷酶溶液： Cat. N

12、o. AMG A9913, Sigma Chemical Co,或等效的。(4) 硅藻土：酸洗(Celite 545 AW, No. C8656, Sigma Chemical Co,或等效的)。(5) 洗滌液：兩者挑一。 鉻酸：120g重鉻酸鈉Na2Cr2O72H2O, 1000mL蒸餾水和1600mL濃硫酸。 實驗室用液體清潔劑，預(yù)備急需清洗的( Micro, International Products Corp.,Trenton, NJ08016,或等效的)。用水配制2%溶液。(6) MES- TRIS緩沖液：0.05mol/L，溫度在 24 C 時 pH 為 8.2。 MES : 2

13、( N-嗎啉代)磺酸基乙烷(No.M 8250, Singma Chemical Co或等效 的)。 TRIS:三羥(羥甲基)氨基甲烷(No.T 1503, Sigma Chemical Co或等效的)。在1.7L的蒸餾水中溶解 19.52gMES和12.2gTRIS用6mol/L NaOH調(diào)pH到8.2，用 水定容至2L注意：24C時的pH為8.2，但是，如果緩沖液溫度在 20C, pH就為8.3, 如果溫度在28C, pH為8.1。為了使溫度在2028C之間，需根據(jù)溫度調(diào)整 pH。(7) HCl溶液：0.561mol/L，加 93.5mL 6mol/L 鹽酸到 700mL 水中，用水定容

14、1L。5. 操作方法(1) 樣品制備： 固體樣品：如果樣品粒度 0.5mm，研磨后過0.30.5mm (4060目)篩。 咼脂肪樣品：如果脂肪含量10%,用石油醚去脂。每克樣品用25mL，每次提取完靜置一會兒再小心將燒杯傾斜，慢慢將石油醚倒出，共洗3次。 高碳水化合物樣品：如果樣品干重含糖50%，用85%乙醇去除糖分，每克樣 品每次10mL,共洗3次輕輕倒出，然后在40C烘箱中不時翻攪干燥過夜， 并研磨過0.5mm 篩。(2) 樣品消化： 準確稱取雙份(1.000 0.005g樣品(ml和m2),置于高腳燒杯中。 在每個燒杯中加入40mL MES TRIS緩沖液，在磁力攪拌器上攪拌直到樣品完全

15、分散注意：防止團塊形成，使受試物與酶能充分接觸。 用熱穩(wěn)定的淀粉酶進行酶解處理：加 100 口 I熱穩(wěn)定的淀粉酶溶液，低速攪拌。 用鋁箔片將燒杯蓋住，在 95100C水浴中反應(yīng) 30mi n注意：起始的水浴溫度應(yīng)達到 95C 。 冷卻：所有燒杯從水浴中移出，晾至60 C。打開鋁箔蓋，用刮勺將燒杯邊緣的網(wǎng)狀物以及燒杯底部的膠狀物刮離，以使樣品能夠完全的酶解。用10mL蒸餾水沖洗燒杯壁和刮勺。 用蛋白酶進行酶解處理：在每個燒杯中各加入10 口蛋白酶溶液。用鋁箔蓋住，在60C持續(xù)搖動反應(yīng)30min注意：開始時的水浴溫度應(yīng)達 60C ，使之充分反應(yīng)。 pH測定：30min后，打開鋁箔蓋，攪拌中加入5m

16、L 0.561mol/L HCI至燒杯中。60C時用溶液或1mol/L HCl溶液調(diào)最終pH為4.04.7注意：當溶液為60C時檢測和調(diào) 整pH,因為在較低溫度時pH會偏高。 用淀粉葡糖苷酶溶液酶解處理：攪拌同時加100 口淀粉葡糖苷酶溶液。用鋁箔蓋住，在60C持續(xù)振搖反應(yīng)30min，溫度應(yīng)恒定在60C。(3) 測定： 總的膳食纖維測定：用乙醇沉淀膳食纖維：在每份樣品中，加入預(yù)熱至60 C的95%乙醇225mL，乙醇與樣品的體積比為 4:1。室溫下沉淀1h。過濾裝置：用15mL78%乙醇將硅藻土濕潤和重新分布在已稱重的坩堝中。用適度的抽力把坩堝中的硅藻土吸到玻板上。酶解過濾，用78%乙醇和刮勺

17、移所有內(nèi)容物微粒到坩堝中注意：如果一些樣品形成膠質(zhì)，用刮勺破壞表面，以加速過濾。抽真空，分別用15mL的78%乙醇，95%乙醇和丙酮沖洗殘渣各 2次，將坩堝內(nèi)的 殘渣抽干后在105 C烘干過夜。將坩堝置干燥器中冷卻至室溫。坩堝重量，包括膳食纖 維殘渣和硅藻土，精確稱至 0.1mg。減去坩堝和硅藻土的干重，計算殘渣重。 蛋白質(zhì)和灰分的測定：取成對的樣品中的一份測定蛋白質(zhì)，用本書前述或GB960.52方法測定。用(NX 6.25作為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換系數(shù))。分析灰分時用平行樣的第二份在525C灼燒5h,在干燥器中冷卻，精確稱至0.1mg,減去坩堝和硅藻土的質(zhì)量，即為灰分質(zhì)量。 不溶性膳食纖維測定：稱適量樣品按 進行酶解，過濾前用 3mL水濕潤和重新分布硅藻土在預(yù)先處理好的坩堝上，保持抽氣使坩堝中的硅藻土抽成均勻的一層。過濾并沖洗燒杯，用10mL70C水洗殘渣2次，然后再過濾并用水洗，轉(zhuǎn)移到600mL 高腳燒杯，保留用以測定可溶性膳食纖維，按操作。用抽濾裝置，分別用15mL78%乙醇，95%乙醇和丙酮各沖洗殘渣 2次。注意：應(yīng)及時用 78%乙醇、95%乙