甲狀腺功能亢進(jìn)肝陽上亢證大鼠下丘腦組織蛋白質(zhì)差異表達(dá)的觀察

1、甲狀腺功能亢進(jìn)肝陽上亢證大鼠下丘腦組織蛋白質(zhì)差異表達(dá)的觀察 作者：周凌燕,陳澤奇,李煒,李智,顏永平【摘要】 目的 利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,觀察甲狀腺功能亢進(jìn)(簡稱“甲亢”)肝陽上亢證大鼠與正常大鼠下丘腦組織的雙向凝膠蛋白圖譜,尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。方法 左甲狀腺素鈉(L-T4)和附子湯灌胃造成甲亢肝陽上亢證模型,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較模型組與正常組中下丘腦的差異蛋白質(zhì),結(jié)合生物信息學(xué)對其進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果 兩組蛋白斑點(diǎn)總體分布相似,主要分布在等電點(diǎn)pI 38,分子量Mr 14.475 kD；分析發(fā)現(xiàn),模型組與正常組相比有18個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)和24個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào),進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定,其中7個(gè)蛋白質(zhì)分別為NS

2、FL1 輔助因子、硫氧還蛋白、泛素羧基末端水解酶同工酶L1、血小板活化因子乙?；饷窱B-亞單位、谷氨酸脫氫酶前體、二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2和微管蛋白。結(jié)論 模型組與正常組相比,有18個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)上調(diào),有24個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)下調(diào),經(jīng)質(zhì)譜鑒定了其中部分蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的變化可能與甲亢肝陽上亢證的形成密切相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 甲狀腺功能亢進(jìn)；肝陽上亢證；下丘腦；蛋白質(zhì)組學(xué)；動物模型 Observation of Differential Protein of Hypothalamus in the Hyperthyroidism Rats with Hyperactivity of Liver-Yang ZHO

3、U Ling-yan, CHEN Ze-qi, LI Wei, et al (Chinese Traditional and Westenr Modern Medicine Research Institute of Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China Abstract：Objective Utilization of proteome method, by observing differences on protein expression of hypothalamus in the hyp

4、erthyroidism rats with hyperactivity of liver-yang and normal rats, to search the differential protein. Methods Models of animal were prepared by ip L-T4 and Fuzi Decoction. Both the quantitative and qualitative changes of the protein expression were compared between model group and treated group by

5、 protein technique. Results Proteins were mainly displayed at range of pI 38, Mr (14.475)kD. 18 protein increased and 24 protein decreased in model group compared with treated group, included Thioredoxin, Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1, Platelet-activating factor acetylhydrolase IB

6、 gamma subunit, glutamate dehydrogenase, dihydropyrimidinase-related protein 2, NSFL1 cofactor p47, Tubulin beta 5. Conclusion There were 18 spots high expressed and 24 spots low expressed in the hyperthyroidism with hyperactivity of liver-yang, that maybe related with the 甲狀腺功能亢進(jìn)(簡稱“甲亢”)是由于多種病因引起甲狀

7、腺激素分泌過多,而導(dǎo)致基礎(chǔ)代謝增加、自主神經(jīng)功能失常、甲狀腺腫大等為特征的常見內(nèi)分泌疾病。在中醫(yī)學(xué)中,甲亢屬于癭病范疇,早在公元前3世紀(jì),就已有關(guān)于癭病的記載。目前,臨床上各醫(yī)家對甲亢的辨證分型各不相同,但大多數(shù)認(rèn)為肝陽上亢證為甲亢常見證型1-2。由于甲狀腺功能主要受下丘腦、垂體的調(diào)節(jié),因此,筆者擬應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),通過觀察甲亢肝陽上亢證大鼠與正常大鼠下丘腦組織蛋白質(zhì)雙向凝膠圖譜,以期尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 動物 正常SD(sprague dawley)大鼠20只,雌雄各半,8周齡,體重(190±10)g,中南大學(xué)湘雅醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供。1.2 藥物 附子湯：

8、由60 g單味制附子(由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中藥房提供)組成,將藥物浸泡30 min,煎煮2次后再將藥液合并,濃縮為含原藥材0.2 g/mL。1.3 試劑 2-D Quant Kit蛋白質(zhì)定量試劑盒、固相pH梯度干膠條(IPGstrip pH3-10L,24 cm)、IPG緩沖液(pH3-10L)、覆蓋液均由Amershan Biosciences公司提供；二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素(urea)、甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、考馬斯亮藍(lán)、瓊脂糖均由Sigma公司提供；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)由上海伯奧生物制品公司提供；硫酸氨、磷酸、無水甲醇、無水乙醇均由湖南師范

9、大學(xué)試劑廠提供。1.4 儀器 Ettan IPGphor等電聚焦儀, Ettan DALTSystem垂直電泳槽(Amersham公司),Imagescanner掃描儀(Sigma公司),PDQest 7.0分析軟件(Bio-Rad公司),Elx800自動酶標(biāo)儀(Bil-Tek Instru-ments, Inc),Applied Biosystems Voyager- DE STR BiospectrometryTM work statior System 4307 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀(ABI公司提供)。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 甲亢肝陽上亢證模型的復(fù)制 將大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組(

10、各10只)。正常組不做任何處理,每天進(jìn)行正常飲食。模型組參照文獻(xiàn)3-4方法,予附子湯,10 mL/(kg·d)灌胃,相當(dāng)于原藥材2 g/(kg·d),共3周,第11天開始將左甲狀腺素鈉(L-T4)1 mg/(kg·d)體重灌胃,連續(xù)10 d,造成甲亢肝陽上亢證大鼠模型。模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)參照鄢氏等3的方法,包括一般情況和用放射免疫法測T3、T4；其中一般情況有大鼠的外觀、性情變化、肛溫和飲水量的變化(于造模前、后各觀察1次)。2.2 標(biāo)本的準(zhǔn)備 所有動物在處死前均從腹腔注射麻醉劑(10%水合氯醛,2 mg/kg),待動物麻醉后在潔凈的冰臺上取出下丘腦。迅速將下丘腦

11、用冰生理鹽水沖洗干凈,裝在標(biāo)記好的凍存管中液氮保存?zhèn)溆谩?.3 組織蛋白質(zhì)的提取及濃度測定 將處理過的標(biāo)本從液氮罐中取出,置于研磨管,加入組織裂解液0.2 mL(7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,2% NP-40,1% Triton X-100,100 mmol/L DTT,5 mmol/L PMSF,4% CHAPS,0.5 mmol/L EDTA,40 mmol/L Tris,2% pharmalyte)研磨,靜置1 h,12 000 r/min 4 離心60 min,取5 L上清用于2-D Quant Kit蛋白質(zhì)定量試劑盒的微量測試法測定總蛋白質(zhì)濃度,其余上清液凍存于-80 備用

12、。2.4 固相pH梯度雙向凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色 第一向固相pH梯度等電聚焦EPG-DALT,按IPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行。組織總蛋白質(zhì)提取物(含蛋白質(zhì)800 g)與水化液及IPG緩沖液pH 310,2.25 L充分混合,總體積450 L,加入IPG持膠槽,將IPG干膠條去保護(hù)膜膠面朝下,置入持膠槽中,覆蓋一層礦物油,蓋好持膠槽蓋子,置于IPGphor等電聚焦儀的電極板上。水化和聚焦在20 自動進(jìn)行,總電壓時(shí)間積為70 020 Vh,其中水化在30 V低電壓進(jìn)行14 h,然后經(jīng)過100 V 1 h,500 V 1 h,1 000 V 1 h,最后穩(wěn)定在8 000 V下進(jìn)行。平衡：

13、等電聚焦結(jié)束后,迅速取出帶樣品的IPG膠條,分別于20 mL平衡液A和平衡液B中各平衡15 min。第二向垂直板SDS-PAGE電泳：將平衡后IPG的膠條移至0.75 mm厚的12.5%丙烯酰胺膠的上端,并在其酸性端的外側(cè)加上低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker,排凈氣泡后用0.5%瓊脂糖封閉。先設(shè)置恒功率2.5 W/塊膠電泳30 min,后改為恒功率15 W/塊膠電泳,直至溴酚藍(lán)到達(dá)距膠底邊約1 cm處停止電泳。將經(jīng)過第二向垂直板SDS-PAGE電泳的12.5%丙烯酰胺膠從制膠板中分離出來,用雙蒸水洗3次、5 min/次；再加入考染液(250 mL/塊膠),水平搖床上染色過夜。2.5 凝膠圖像分析

14、 凝膠通過Imagescanner掃描儀及LabScan掃描軟件進(jìn)行掃描,獲取圖像；利用PDQuest 7.0分析軟件對圖像進(jìn)行強(qiáng)度校正、點(diǎn)檢測、背景消減、匹配等分析。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 12.0軟件和Excel上進(jìn)行。2.6 質(zhì)譜樣本準(zhǔn)備,質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫查詢 隨機(jī)選取表達(dá)有顯著差別的10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),參照文獻(xiàn)5方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的原位酶解,將制備好的點(diǎn)樣板置于Applied Biosystems Voyager System 4307 MALDI-TOF-MS儀上進(jìn)行分析,采用反射模式,正離子譜測定,離子源加速電壓為20 000 V,反射電壓比為1.12,N2激光波長337 nm,脈沖

15、寬度為3 ns,離子延遲提取100 ns,真空度4×10-7Torr,質(zhì)譜信號單次掃描累加50次,質(zhì)譜使用胰蛋白酶自動降解峰作為內(nèi)部校正,獲得了肽質(zhì)量指紋圖。通過因特網(wǎng)在ExPASY的PeptIdent軟件中進(jìn)行搜尋,尋找與參數(shù)相匹配的蛋白質(zhì)。2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示,采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)處理。3 結(jié)果3.1 甲亢肝陽上亢證模型的復(fù)制結(jié)果 造模成功后,模型組毛色逐漸失去光澤,眼結(jié)膜均有不同程度的充血變紅,易激惹；而正常組大鼠毛色光澤,雙眼靈活有神,眼結(jié)膜未見明顯充血變紅；模型組大鼠的飲水量及肛溫明顯高于正常組,2組有顯著性差異,如

16、表1、2所示。2組大鼠于處死時(shí)分別心臟取血3 mL,用放免法測T3、T4。結(jié)果見表1表3。表1 2組大鼠造模前后飲水量比較(略)注：與本組造模前比較,*P<0.01；與正常組比較,P<0.05,P<0.01(下同)。表2 2組大鼠造模前后肛溫比較(略)表3 2組大鼠T3、T4值比較(略)3.2 雙向凝膠電泳結(jié)果 在相同條件下,將2組大鼠的下丘腦分別進(jìn)行了3次2D電泳,如圖1、圖2所示。兩者總蛋白的分布模式非常相似,蛋白質(zhì)點(diǎn)主要分布在pI38和Mr14.475 kD范圍,經(jīng)PDQest 7.0分析軟件分析,在相同條件下識別的蛋白質(zhì)點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為正常組(76

17、4±30)個(gè)、模型組(755±28)個(gè)。圖像分析時(shí)將正常組下丘腦的凝膠選為參考膠,利用軟件進(jìn)行匹配,并結(jié)合肉眼觀察,與模型組相比較。通過比較分析,模型組中蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)有18個(gè),下調(diào)的點(diǎn)有24個(gè)。3.3 質(zhì)譜結(jié)果 在有顯著差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)中選取10個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫查詢,搜尋到7個(gè)有意義的蛋白質(zhì)。 4 討論 目前,臨床上各醫(yī)家對甲亢的辨證分型各不相同,但大多數(shù)認(rèn)為肝陽上亢證為甲亢常見證型。目前,已有多項(xiàng)研究表明：肝陽上亢證與外周交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)功能活動增強(qiáng)、血漿腎上腺素和去甲腎上腺素含量增高有關(guān)6-7,且去甲腎上腺素有顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞的生長作用8。由

18、于甲狀腺功能主要受下丘腦、垂體的調(diào)節(jié),因此,本實(shí)驗(yàn)采用病證結(jié)合的方式復(fù)制動物模型,采用雙向凝膠電泳分離甲亢肝陽上亢證與正常大鼠下丘腦的總蛋白質(zhì),了解它們的表達(dá)情況。經(jīng)過嚴(yán)格的同一條件下的2D電泳、圖像處理、軟件分析、背景消減、條紋祛除、斑點(diǎn)檢測、斑點(diǎn)匹配等,模型組與正常組比較,模型組中蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)的點(diǎn)有18個(gè),下調(diào)的點(diǎn)有24個(gè),然后通過質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比較,進(jìn)一步鑒定其中的部分蛋白質(zhì)。本研究結(jié)果顯示,模型組較正常組上調(diào)的有NSFL1輔助因子；下調(diào)的有硫氧還蛋白(Trx)、泛素羧基末端水解酶同工酶L1(UCH-L1)、血小板活化因子乙?；饷窱B-r亞單位、谷氨酸脫氫酶前體、二氫嘧啶

19、酶相關(guān)蛋白2和微管蛋白B-5。 Trx是一個(gè)廣泛分布的氧化還原蛋白,分子量約為12 kD,根據(jù)存在位置不同分為Trx1(細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核)和Trx2(線粒體)兩型。Trx通過二硫化物活性中心可逆地催化許多氧化還原反應(yīng),參與機(jī)體多種生物學(xué)活性,調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化還原、細(xì)胞凋亡與增殖,與人類某些疾病,如腫瘤、AIDS、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、感染性疾病、遺傳性疾病和動脈硬化等發(fā)生、發(fā)展有關(guān)9。Trx還能激活核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)及其相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路10。本研究發(fā)現(xiàn)模型組中Trx表達(dá)上調(diào),可能與甲亢高代謝而致組織氧化還原不平衡有關(guān)。 UCH-L1屬于泛素系統(tǒng),除泛素外還包括4種酶家族,它們是

20、泛素活化酶、泛素結(jié)合酶、泛素蛋白連接酶和去泛素酶,是體內(nèi)蛋白降解通路之一,同時(shí)也參與體內(nèi)細(xì)胞調(diào)控11。UCH-L1是去泛素酶中的一種硫基蛋白酶,識別和水解結(jié)合在泛素羧基末端甘氨酸殘基的短肽及聚泛素鏈,使泛素游離或成為可重復(fù)利用的泛素。有文獻(xiàn)報(bào)道,在腦干死亡的過程中UCH-L1可能起到了至關(guān)重要的作用12。UCH-L1的缺乏可能與某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)13。目前尚無UCH-L1與甲亢或肝陽上亢證相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn)UCH-L1在模型組中表達(dá)下調(diào),其機(jī)制是否與甲亢及肝陽上亢證的形成有關(guān)還有待進(jìn)一步深入研究。 微管是細(xì)胞骨架成分之一,在細(xì)胞分裂、運(yùn)動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起著重要作用。微管蛋白屬于微管

21、蛋白家族,與體內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞的增殖、運(yùn)動密切相關(guān)14。它能夠結(jié)合兩個(gè)GTP分子,一個(gè)結(jié)合在beta鏈的可替換位點(diǎn),另一個(gè)則結(jié)合在alpha鏈的不可替換位點(diǎn)。由微管蛋白聚集而成的微管是組成紡錘體的主要部分,抑制其聚集將導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂終止。本實(shí)驗(yàn)中模型組微管蛋白beta5表達(dá)下調(diào),可能影響到下丘腦組織細(xì)胞的分裂活動,進(jìn)而引起甲亢肝陽上亢證有關(guān)的神經(jīng)癥狀,還有待于進(jìn)一步證實(shí)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 魯昌源.現(xiàn)代內(nèi)科應(yīng)用手冊M.北京：中國醫(yī)藥科技出版社,1992.217.2 臧仁濤,辛 建,譚業(yè)雪.辨證治療甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥36例J.山東中醫(yī)雜志,1996,15(3)：107.3 鄢東紅,金益強(qiáng)

22、,肖 純,等.自發(fā)性高血壓大鼠肝陽上亢證模型的復(fù)制J.湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1999,19(4)：3538.4 于 方,章 奕,林漢華.不同甲狀腺功能狀態(tài)對大鼠血清瘦素水平的影響J.臨床醫(yī)學(xué),2002,22(8)：3436.5 李茂玉,肖志強(qiáng),李 萃,等.小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446蛋白質(zhì)表達(dá)譜的建立J.癌癥,2004,23(10)：11161121.6 尤勁松,胡隨瑜,夏大勝.肝陽上亢證輔助實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)的進(jìn)一步研究J.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,27(3)：239241.7 陳國林,胡隨瑜,陳澤奇,等.中醫(yī)肝臟辨證標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究肝陽上亢證辨證標(biāo)準(zhǔn)J.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2001,7(12)

23、：1316.8 劉翠萍,劉 超,覃又文,等.腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)對人甲狀腺細(xì)胞生長的影響J.江蘇醫(yī)藥雜志,2000,26(3)：172173.9 Hagg D, Englund MC, Jernas M, et al. Oxidized LDL induces a coordinated up-regulation of the glutathione and thioredoxin systems in human macrophagesJ.Atherosclerosis,2005,185(2)：282289.10 Kmuda C. Das. c-Jun NH2-terminal kinase-mediated redox- depe