細(xì)胞因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎淋巴細(xì)胞B7表達(dá)的影響

1、細(xì)胞因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎淋巴細(xì)胞B7表達(dá)的影響 作者：陶唯宜肖波彭永楊歡李靜謝光潔 【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞因子 【摘要】 目的 探討B(tài)7在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎（EAM）發(fā)病中的作用及干擾素（IFN-）、腫瘤壞死因子（TNF-）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、IL-12對(duì)其的影響。方法用兔肌肉勻漿免疫小鼠建立EAM模型，觀察動(dòng)物發(fā)病情況及肌肉病理改變。取小鼠外周血和脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并用細(xì)胞因子處理，分別應(yīng)用流式細(xì)胞計(jì)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)外周血和脾淋巴細(xì)胞B7-1，B7-2蛋白和mRNA的表達(dá)及細(xì)胞因子對(duì)其影響。結(jié)果 EAM小鼠外周血和脾淋巴細(xì)胞上B7-1、B7-2蛋白的表達(dá)

2、明顯增強(qiáng)，B7-1、B7-2mRNA的表達(dá)與蛋白表達(dá)的增加相平行。IFN-、TNF-、IL-12使上述表達(dá)明顯增強(qiáng)，IL-10則抑制其表達(dá)。結(jié)論 B7表達(dá)與EAM的發(fā)病密切相關(guān)，細(xì)胞因子IFN-、TNF-、IL-10、IL-12可能通過(guò)調(diào)節(jié)EAM小鼠淋巴細(xì)胞B7表達(dá)而影響EAM的轉(zhuǎn)歸。 關(guān)鍵詞 細(xì)胞因子 B7分子 EAM RT-PCR 流式細(xì)胞計(jì)【Abstract】 Objective To study the effects of IFN-，TNF-，IL-10and IL-12on the B7mRNA and protein expression of lymphocyte in exp

3、erimental autoimmune myositis（EAM）.Methods FACS and RT-PCR techniques were used to assay the expression of B7in EAM lymphocytes and effects of cytokines.Results IFN-，TNF-andIL-12increased the expression of B7，but IL-10inhibited all the expressions.Conclusion IFN-，TNF-，IL-10and IL-12effected the B7ex

4、pression in EAM lymphocytes.Key words cytokine B7 EAM RT-PCR flow cytometry 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎（EAM）是一種人工誘導(dǎo)類(lèi)似人類(lèi)多發(fā)性肌炎（PM）的動(dòng)物模型，其病理改變與PM基本一致，即肌纖維的壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。已有的研究表明PM發(fā)病與T細(xì)胞的異?；罨嘘P(guān) 1，2 。T細(xì)胞的活化需要第一信號(hào)和第二信號(hào)參與，第二信號(hào)又稱(chēng)協(xié)同刺激信號(hào)，主要由T細(xì)胞上表達(dá)的CD28/CTLA-4與抗原遞呈細(xì)胞（APC）表面的配體B7相互作用所提供 3 。本實(shí)驗(yàn)著重觀察B7在EAM中的表達(dá)以及IL-10、IL-12、IFN-、TNF-對(duì)其影

5、響，試從T細(xì)胞活化的角度探討PM的發(fā)病機(jī)制。1 材料與方法1.1 材料 PE標(biāo)記的抗B7-1、B7-2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Pharmingen公司，IL-10、IL-12、rIFN-、rTNF-、RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，B7-1、B7-2、-actin引物由中科院上海細(xì)胞生物研究所合成，弗氏完全佐劑（CFA）及其它免疫試劑購(gòu)自北京邦定生物公司。 1.2 方法1.2.1 動(dòng)物模型和分組 健康雄性昆明小鼠40只（68周，2530g）由湖南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為肌炎組10只（EAM），對(duì)照組10只（0.9%NS）。取兔肌肉 基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)

6、目（編號(hào):39870909）勻漿0.1ml加等量CFA混勻制成0.2ml抗原乳劑注入EAM組小鼠頸部肌肉和皮下組織，1周后重復(fù)誘導(dǎo)1次;對(duì)照組用生理鹽水取代兔肌肉勻漿加等量CFA混勻注射。發(fā)病動(dòng)物癥狀體征分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)文獻(xiàn) 4 。兩組動(dòng)物分別于免疫后22天或?yàn)l死前，用3%異戊巴比妥鈉0.2ml注入小鼠腹腔，麻醉后用無(wú)菌注射器于心臟采血，肝素抗凝，同時(shí)取脾臟備檢。另取大腿肌肉置于10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片做HE染色，行光鏡檢查。1.2.2 外周血和脾淋巴細(xì)胞B7-1、B7-2蛋白表達(dá) 外周血淋巴細(xì)胞分離方法見(jiàn)文獻(xiàn) 5。脾臟經(jīng)200目鋼網(wǎng)過(guò)篩，用Ficoll液分離淋巴細(xì)胞，Hanks液洗2次，

7、重懸于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中備用。淋巴細(xì)胞分為細(xì)胞因子處理組和未處理組，分別置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37、5%CO 2 中孵育72h。內(nèi)加5g/ml ConA誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中含45%DMEM、10%FCS、10mM HEPES、50g/ml青霉素/鏈霉素;處理組在上述培養(yǎng)基分別加入100U/ml rIFN-、250U/ml rTNF-、10g/ml IL-10、20g/ml IL-12刺激，在培養(yǎng)后24、48、72h取細(xì)胞因子處理組和未處理組淋巴細(xì)胞1×10 7 個(gè)，分別加B7-1和B7-2單抗1g，置4孵育30min，4000rpm×5min，取沉淀加PBS洗

8、2次，4000rpm×5min，沉淀加0.5ml PBS及20l戊二醛固定液，流式細(xì)胞計(jì)檢測(cè)淋巴細(xì)胞上B7-1和B7-2蛋白的表達(dá)。1.2.3 外周血和脾淋巴細(xì)胞B7-1、B7-2mRNA表達(dá)水平1.2.3.1 cDNA合成和PCR擴(kuò)增 取細(xì)胞因子處理組和未處理組培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞1×10 7 個(gè)，采用異硫氰酸胍法提取RNA。取樣品RNA0.2g，加Oligo（dT）引物1l（100ng/l），5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4l，955min，冷卻后加入Rnasin20U、2.5mM dNTP4l、AMV轉(zhuǎn)錄酶5U，總反應(yīng)體積20l，42反應(yīng)60min，然后943min滅活A(yù)MV酶

9、，置-20冰箱保存。取cDNA反應(yīng)液10l，置0.5ml Eppendorf管中，分別加入2.5mM dNTP4l，Taq酶1U，10×PCR緩沖液5l，-actin上、 下游引物各1l（10pmol/l），B7-1或B7-2上下游引物各2l（10pmol/l），引物序列見(jiàn)表1，加去離子雙蒸水至終體積50l，再用50l石蠟油覆蓋，95變性5min，反應(yīng)條件為95變性1min，55退火1min，72延伸1min，循環(huán)30次后72延伸5min。表1 B7-1、B7-2、-actin引物序列1.2.3.2 PCR產(chǎn)物的分析 20l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在含有0.5g/l溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳，時(shí)間1h，電壓5V/cm。電泳