腺病毒載體操作手冊R

1、腺病毒載體操作手冊 一、實驗流程 制備腺病毒穿梭質粒，分別高純度無內(nèi)毒素抽提腺病毒穿梭質粒和骨架質粒，共轉染293A細胞，轉染后6h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)十幾天，在中間四五天左右更換一次新鮮培養(yǎng)基，然后收集細胞和1ml培液置于15ml離心管后，液氮/37度凍融三次（凍-融要徹底），2000rpm離心5分鐘，取上清即為病毒液初代原液。連續(xù)三代反復擴增收集病毒后，行病毒的大量擴增，然后通過CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒。二、實驗材料（一）腺病毒載體、包裝細胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為兩質粒系統(tǒng)，組成為穿梭質粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,p

2、HBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP）和骨架質粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭質粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表達綠色熒光蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP和 pHBAd-U6-RFP能表達紅色熒光蛋白（RFP）。1、載體信息1) 腺病毒克隆載體圖譜如下： 各載體用途如下表：腺病毒載體名稱干擾pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP過表達pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP標記示蹤pHBAd-CMV-IRES-GFP, pHBAd-CMV-IRES-RFP,

3、 pHBAd-U6-GFP,pHBAd-U6-RFP2） 骨架質粒信息如下： 2、細胞株 293A，腺病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細胞,生長培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。3、菌株 大腸桿菌菌株DH5。用于擴增腺病毒載體和腺病毒骨架載體質粒。三、包裝細胞293A細胞的培養(yǎng)（一） 293A細胞的凍存 293A細胞來源于一個用作空斑測定的亞克隆，具有易使用和易轉染的特性。該細胞株對于高細胞密度很敏感，當細胞超過70%匯合時，一些細胞可能會丟失它們的表型。若細胞密度持續(xù)在70%以下，QBI-293A細胞則能連續(xù)培養(yǎng)34個月維持原有細胞特性。若以購買得到的29

4、3A作為第一代，則30代內(nèi)能得到最佳結果。隨著傳代的次數(shù)增加，293A細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類現(xiàn)象的出現(xiàn)，我們需要在開始就對細胞進行大量凍存，以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細胞對數(shù)生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。1、去掉上清液，加入PBS洗去殘留的培養(yǎng)基；2、加入0.25%的胰酶，消化12min后，鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。3、細胞計數(shù)，將細胞全部晃下，加入 3mL 37 預熱的 10 DMEM，用 10mL 移液管進行吹打，較大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，將所有細胞吸出，置于15mL 離心管中，取

5、50ul 混勻后的細胞于 1.5mL eppendorf 管中，加 入 450ul 10 DMEM，即為 10 倍稀釋，混勻，取 10ul 細胞于計數(shù)板 中計數(shù)。計數(shù)板上共 4 大格，每大格 16 小格。計數(shù)時，4 大格均計 數(shù)，總數(shù)除以 4（得每大格細胞數(shù)），再乘以 10（10 倍稀釋），即 為實際 n萬/mL 細胞濃度。4、細胞離心，1000rpm，5min。去掉上清。5、根據(jù)細胞計數(shù)結果加入細胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO）,重懸細胞，密度為3 x 106個/ml。6、分裝進細胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80超低溫冰箱。7、第二天將細胞放于液氮罐中長久保存，并

6、作記錄。保存過程中，要不時復蘇細胞檢測細胞存活率，觀察細胞狀態(tài)等。（二）293A細胞的傳代當細胞生長到匯合率達到80%90%時需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數(shù)量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。1、消化細胞，方法同細胞凍存。2、細胞離心結束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。3、根據(jù)具體情況，將細胞分到10cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿補足到10ml培養(yǎng)基。4、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放回37、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）293A細胞的復蘇當細胞傳代次數(shù)過多，細胞狀態(tài)變差時，或者細胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對最初凍存的細胞進行復蘇。1、設置溫度為3742的水浴。2、查看細胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍

7、存的細胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，盡量在12 min內(nèi)使細胞溶液完全溶解。3、將細胞溶液轉移到15ml離心管中，并在其中加上1ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心，1000rpm，5min。4、去掉上清，加入5ml新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉入6cm培養(yǎng)皿。5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37、5%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6、第二天觀察細胞存活率。給細胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細胞生長情況。四、腺病毒包裝、擴增和純化（一）腺病毒包裝 事先準備好用于包裝病毒的293A細胞和病毒質粒，轉染每個直徑為6cm的培養(yǎng)皿complex成分如下：穿梭質粒2gp-BHG(d

8、elta)E1,3 cre4gOpti MEM需在37度水浴中預熱，LipofiterTM轉染試劑需恢復至室溫方可使用，使用前需搖勻。轉染后6h換新鮮培液。注：LipofiterTM轉染試劑為漢恒生物產(chǎn)品，使用說明參考LipofiterTM說明書。 轉染前細胞必須處于良好的生長狀態(tài)。 病毒實驗帶有一定的危險性，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套，在生物安全柜里進行實驗操作。 （二）病毒收集病毒收集前要觀察病毒空斑是否形成，為限制病毒的擴散及空斑更好的形成，通常在培養(yǎng)液中加入瓊脂糖，感染后7天左右可以在顯微鏡下看到小的空斑，一般在10至21天內(nèi)形成，空斑形成后連著瓊脂糖一起將空斑挑起，

9、放入新鮮培養(yǎng)基中過夜。（三） 病毒擴增第二天，將培養(yǎng)基中病毒加入新鮮293A細胞培養(yǎng)液中進行病毒少量擴增。至細胞再次出現(xiàn)空斑，收集細胞及上清，反復凍融三次收集病毒，以此病毒為P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A細胞，連續(xù)進行三代感染，至P4代進行腺病毒的大量擴增，待空斑形成后收集病毒并對病毒進行體外純化和濃縮。 （四）病毒純化病毒純化采用CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒，CsCl梯度的制備方法如下：加入2.0ml密度為1.40g/ml的CsCl溶液（溶劑同上），然后緩慢加入3.0ml密度為1.30g/ml的CsCl溶液，再加入5ml的病毒懸浮液。20000rpm，室溫離心2小時。收集

10、密度在1.30g/ml和1.40g/ml之間的病毒條帶至透析袋中（透析袋使用前用10mM的EDTANa2煮沸10min）。在透析緩沖液（50g蔗糖，10ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2ml 1M MgCl2定容至1L）中，4攪拌透析過夜，中間換一次透析液。收集病毒，測定病毒滴度。（五）病毒重懸和保存500ul PBS重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于4度冰箱保存，如需長時間存放需置于-80度甚至液氮保存。五、感染目的細胞因為不同細胞的MOI不同，所以在將病毒感染正式感染目的細胞前，需要做一個預實驗以確定目的細胞中加入的病毒數(shù)。（一）細胞準備將狀態(tài)良好的目的細胞接種到24孔板，使細胞濃度

11、為1×105/ml細胞，接種細胞數(shù)量因細胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進行病毒感染的時候細胞匯合率介于50%至70%直接。（2） 病毒感染1.polybrene的選擇：Polybrene:是帶正電的小分子，與細胞表面的陰離子結合，提高腺病毒對細胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率210倍。Polybrene有一定的細胞毒性，有的細胞對polybrene的毒理反應明顯，因此細胞感染時是否適合polybrene需要摸索；不同細胞對polybrene的敏感度不同，可以用110g/ml的范圍篩選合適的濃度，以24h內(nèi)細胞無明顯毒性反應為佳，可參考文獻并進行預實驗摸

12、索，polybrene最常用的工作濃度為58g/ml。注： 1）漢恒生物的自產(chǎn)的Polybrene 產(chǎn)品，用戶可用以進行輔助感染。提供的Polybrene母液保存在-20（可保存1年以上），避免反復凍融3次以上，否則活性受影響。4可保存2周。 2） Polybrene預實驗請先以對照病毒進行摸索，大部分腺病毒感染的細胞可不加Polybrene即獲得很高轉染效率。具體情況以預實驗結果為準！2. 感染細胞最佳MOI的測定MOI（Multiplicity of Infection，感染復數(shù)）是指每個細胞感染的病毒數(shù)。通常MOI越高，腺病毒感染后宿主細胞內(nèi)保留的腺病毒基因組數(shù)量以及目的蛋白的表達量越高

13、。腺病毒對于不同種類不同來源的細胞，其最適MOI各有差別，原則上最適MOI是感染效率較好的最低MOI。原則上每種細胞對應每種類型的病毒都應該進行最適MOI摸索實驗，設置MOI梯度摸索實驗，選擇適合的MOI進行實驗。MOI一般以1：3：5或者1:3:10進行梯度摸索，一般的細胞基礎腺病毒感染MOI可以10為開始，即10，30，50或者10，30，100。MOI對應病毒體積的換算轉染時細胞數(shù)（一般以傳代計數(shù)細胞數(shù)×2計算）×MOI=病毒個數(shù)；則加入的病毒體積數(shù)=病毒個數(shù)/病毒滴度。例子：轉染細胞數(shù)為105個，MOI為100，則需要病毒的個數(shù)為107個，病毒如果滴度為1010 P

14、FU/ml,則需要加入的病毒體積為107/（1010 PFU/ml）=10-3ml=1ul。同理，300，500相應為3ul，5ul。詳細的細胞數(shù)/MOI/病毒體積換算參見附1表格（3）I、貼壁細胞感染實驗分為兩組，分別添加相應腺體病毒載體和等滴度同體積的對照病毒載體，1/2體積培養(yǎng)液感染（詳見下表格）。加入的病毒量范圍推薦MOI為=10，30，100，300，500內(nèi)，每個MOI值加兩個孔。對于增殖能力較弱的細胞，比如特別是一些原代細胞如神經(jīng)元、心肌細胞，1/2體積感染2小時足夠，2小時后只換成新鮮培液。對于增殖能力較強的細胞，如BMSC（骨髓間充質干細胞），1/2體積感染2小時后，不換液，

15、而是追加1/2新鮮培液，繼續(xù)37度感染過夜，有利于提高感染效率。對于polybrene適用的細胞，1/2體積感染的培液中，polybrene濃度為固定值（58ug/ml）；如2小時后停止感染置換新鮮培液，則無需再加入polybrene（針對上述增殖能力弱的細胞）；如2小時1/2體積感染后繼續(xù)追加培液感染過夜，則補充的新鮮培液中要含有等終濃度的polybrene。病毒小培養(yǎng)體積感染表培養(yǎng)皿表面積對應細胞培養(yǎng)液體積病毒感染對應細胞培養(yǎng)液體積類型/cm296-well0.3cm2100ul50ul24-well2cm2500ul250ul12-well4cm21ml500ul6-well10cm22

16、ml1ml60mm 20cm24ml2ml100mm 60cm210ml5ml慢病毒感染4小時后補足至培養(yǎng)體積，感染24小時后換液，腺病毒感染2小時后直接換液II、懸浮細胞上面介紹的是針對貼壁細胞的感染方法，若是懸浮或半懸浮細胞，則需要通過平角離心轉染法，即將適量的病毒液加入細胞培養(yǎng)板后（感染體系同貼壁細胞中病毒小培養(yǎng)體積感染表），封好口，放入平角離心機后，低速（900g1500g）離心1h，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)感染1小時即可，這樣總共感染了2小時。若由于實驗條件有限，沒有平角離心機，可用離心管代替，將細胞吹打吸入離心管中，進行低速離心，去掉大部分上清，然后加入適量的病毒液，室溫放置10m

17、in（不能超過半小時），然后將細胞和病毒液同時吸出轉入培養(yǎng)皿中繼續(xù)病毒感染至2小時后換液即可。注：懸浮細胞離心感染1小時+離心后37度小體積感染1小時，一般直置換新鮮培液。對于少數(shù)感染效果較差的懸浮細胞，追加1/2新鮮培液持續(xù)感染過夜也有助于提高感染效率，但要注意不能影響細胞狀態(tài)，具體步驟以實驗摸索結果為準。Polybrene的使用事項同樣適用于懸浮細胞。（三）觀察感染情況感染24小時后，可以開始觀察到GFP/RFP表達（只對于有GFP/RFP獨立表達框的腺病毒載體），過表達和干擾的感染時間以36-48小時實驗為最佳。 六、動物實驗例子：小鼠尾靜脈注射將純化過的腺病毒以每只小鼠 1-5

18、5;109毒量注射，比如純化腺病毒滴度為 1×1011PFU，則每只小鼠注射體積約為 10-50ul。具體的注射量需要實驗摸索，注意注射體積不要超過 200ul，最好控制在100ul以下，注射劑量過多，也會發(fā)生充血性心衰。其他病毒動物實驗可與我們的動物實驗工程師溝通細節(jié)尋求幫助。附1：漢恒生物腺病毒感染復數(shù)（MOI）與體積對應表規(guī)格大約數(shù)目MOI值加入病毒數(shù)量腺病毒MOI摸索時的體積梯度/ul96well2-5×10450-1001-5×1060.1-0.5ul0.1；0.3；148well1-2×10550-1000.5-2×1070.5-2

19、ul0.5；2；624well2-3×10550-1001-3×1071-3ul1；3；1012well5×10550-1002.5-5×1072.5-5ul2.5；7.5；256well1-2×10650-1000.5-2×1085-20ul5；15；5035mmdish1-2×10650-1000.5-2×1085-20ul5；15；5060mmdish2-4×10650-1001-4×10810-40ul10；30；100100mmdish6-10×10650-1003-10&#

20、215;10830-80ul30；100；300150mmdish1-2×10750-1000.5-2×10950-200ul60；180；600腺病毒滴度以1010/ml為準，其他滴度需相應換算；大約細胞數(shù)目是根據(jù)80%100%細胞密度估算而出，具體細胞數(shù)請種細胞時進行細胞計數(shù)。注： 1）24板長滿了細胞大約有3×105個細胞。 如果一天后要長到70（2.1×105）， 建議1.21.4×105個細胞。因為細胞剛放進去的前幾個小時需要粘在生長表面及適應新的生長條件，不會達到24小時翻一倍的速度。其他規(guī)格培養(yǎng)可參照此確定相應culture細胞量

21、。2）MOI值: MOI 是multiplicity of infection的縮寫，中文譯為感染復數(shù),實際的含義即為每個細胞被多少個有活力病毒所感染。各種細胞的最適MOI值有差別，請客戶正式實驗前先進行預實驗摸索最適MOI。 附2：漢恒生物各病毒載體感染目的細胞比較腺病毒慢病毒逆轉錄病毒感染方式直接加入直接加入直接加入換液時間感染后2h感染后24h感染后24h是否需要篩選不需要，腺病毒感染能力很強需要篩選獲得穩(wěn)定感染株，慢病毒的感染能力不強需要篩選獲得穩(wěn)定感染株，逆轉錄病毒的感染能力不強觀察時間如帶有GFP等熒光標簽，24h后可觀察到熒光，36h可達到表達高峰，若不帶有熒光標簽，則需要鑒定帶有GFP等熒光標簽，24h后可以觀察到表達，36h達到高峰，若不帶有熒光標簽，則不可直接觀察到，需要鑒定帶有GFP等熒光標簽，24h后可以觀察到表達，36h達到高峰，若不帶有熒光標簽，則不可直接觀察到，需要鑒定是否需要助轉劑不需要有時需要，但是根據(jù)具體情況操作，因為助轉劑，如polybrene，對細胞的傷害比較大，有的細胞可能承受不了有時需要，但是根據(jù)具體情況操作，因為助轉劑，如polybrene，對細胞的傷害比較大，有的細胞可能承受不了附3：各種病毒載體感染目的細胞操作區(qū)別腺病毒慢病毒逆轉錄病毒感染方式直接加入直接加入直接加入換液時間感染后2h感