微生物學大實驗實驗報告

1、微生物學大實驗實驗題目：土壤微生物的分離純化與鑒定一 實驗目的：1.鞏固本學期所學的所有微生物實驗操作技能。2.再次強調無菌操作概念。3.初步學習微生物鑒定純化的方法和思路。4.學會應用相關手冊對微生物進行分類。二 實驗原理：1. 培養(yǎng)基的制備、消毒與滅菌：培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養(yǎng)基質，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產物。在自然界中，微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基中，一般應含有水分、碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因素等。不同微生物對 pH 要求不一樣，霉菌和酵母的培養(yǎng)基的 pH

2、 一般是偏酸性的，而細菌和放線菌的培養(yǎng)基的 pH 一般為中性或微堿性的 ( 嗜堿細菌和嗜酸細菌例外 ) 。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據不同微生物的要求將培養(yǎng)基的 pH 調到合適的范圍。此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如果來不及滅菌，應暫存冰箱內，以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。2. 微生物的分離與純化：自然界中各種微生物混雜生活在一起，要研究某種微生物的特性，首先須使該微生物處于純培養(yǎng)狀態(tài)。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。土壤是微生物生活的大本營，所含微生物

3、無論是數量還是種類都是及其豐富的。因此，土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，人們可以從中分離到很多有價值的菌株。本實驗將采用平板劃線分離法。3. 平板分離技術與活菌計數： 值得指出的是從微生物群體中經分離、生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征等綜合考慮。有些微生物的純培養(yǎng)要經過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。 平板分離法主要有：（1）平板劃線分離法，（2）稀釋涂布平板法。后者除能有效分離純化微生物外，還可

4、用于測定樣品中活菌數量。 平板菌落計數法是將待測菌液經適當稀釋，涂布在平板上；經過培養(yǎng)后在平板上形成肉眼可見的菌落。統(tǒng)計菌落數，根據稀釋倍數和取樣量計算出樣品中細胞密度。由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，平板上形成的每個菌落不一定是單個細胞生長繁殖而成，有的可能來自2個或多個細胞。因此，平板菌落計數的結果往往比樣品中實際細胞數低，這就是現在使用菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）取代以前用絕對菌落數來表示樣品活菌含量的原因。4. 分離菌株的鑒定：微生物的分類鑒定是微生物的重要內容，一般從菌落特征、細菌特點及生理生化、分子生物學等方面進行鑒定。各種細菌在代謝類型上

5、表現了很大的差異。不同的細菌分解大分子碳水化合物、蛋白質和脂肪的能力不同，所能發(fā)酵的類型和最終產物也不一樣。不同細菌對營養(yǎng)的要求不同也說明了它們有不同的合成能力。所有這些都反映了它們是有不同的酶系統(tǒng)。細菌的這種生化反應的多樣性在自然界產生了兩種結果：第一、使自然界所有的有機分子都有可能得到分解；第二、使不同細菌之間有了互相作用和互相依賴的基礎。另一方面，微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一，細菌的生化反應的多樣性也被人們作為細菌的鑒定和分類方法來利用，可以鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。5. 生理生化反應：微生物對大分子物質如淀粉、蛋白質和脂肪等不能直接利用，必須依靠產生的

6、胞外酶將大分子物質分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大分子物質為較小化合物，使其能被運輸至細胞內。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白質為氨基酸等，這些過程均可通過觀察細菌菌落周圍的物質變化來證實。糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應，在腸道細菌的鑒定上尤為重要，絕大多數細菌都能利用糖類作為碳源，但是它們在分解糖類物質的能力上有很大的差異，有些細菌能分解某種糖產生有機酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、甲烷、二氧化碳等），有些細菌只產酸不產氣。IMViC是吲哚（indol）、甲基紅（methyl red tes

7、t）、伏-普（Voges-Prokauer test）和檸檬酸鹽（citrate test）四個實驗的縮寫，主要用于快速鑒別大腸桿菌和產氣腸桿菌，多用于水細菌學檢查。吲哚試驗是用于檢測吲哚的產生，某些細菌可產生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產生吲哚和丙酮酸。對二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（紅色）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個生物化學檢測的指標。色氨酸水解反應：吲哚與對二甲基氨基苯甲醛反應：6. 實驗整體思路： 在確定取樣環(huán)境之后，對微生物原樣進行梯度稀釋，產生合適的濃度進行涂板用于微生物的計數。 染色并鏡檢，利用形態(tài)學方法對微生物做一粗略的定

8、位。 根據鏡檢設計相關生理生化試驗作進一步定位。 根據以上獲得的信息確定微生物類群并加以定位。三 實驗器材：1. 實驗菌種：大腸桿菌 金黃色葡萄球菌2. 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，馬鈴薯培養(yǎng)基，固體油脂培養(yǎng)基，固體淀粉培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，乳糖培養(yǎng)基試管（內裝有倒置的德漢氏小管），蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。3. 溶液和試劑：50%乙醇，20%的甘油，硝酸銀染色液、香柏油、二甲苯、0.01美蘭水溶液，盧戈氏碘液，甲基紅指示劑，5%孔雀綠水溶液、0.5%番紅水溶液，革蘭氏染液，草酸銨結晶紫染液，盧戈式（Lugol）碘液，95%乙醇，番紅復染液，香柏油，二甲醇等。4. 土樣：山

9、東大學中心校區(qū)圖書館前光草坪內地表10cm土樣。5. 儀器和其他用品：普通光學顯微鏡，擦鏡紙，酒精燈，載玻片，雙層瓶，接種環(huán)，試管架，鑷子，滴管，二甲苯，香柏油，蒸餾水，蓋玻片，吸水紙，無菌平板，無菌試管，U型玻棒，解剖刀，無菌吸管等。四 操作步驟： 1.培養(yǎng)基的制備與分裝。（1）稱量：按培養(yǎng)基配方依次準確地稱取藥品。（2）熔化：在沸水浴鍋中或電爐上加熱熔化。（3）調pH ：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調pH至培養(yǎng)基所需pH。（4）分裝：將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上，裝試管時，注意管口不要沾上培養(yǎng)基。液體分裝裝量不超過試管的1/4，固體分裝裝量不超過試管的1/5，分裝三角

10、瓶的量不超過三角瓶容積的一半，半固體分裝裝量為試管的1/3，滅菌后垂直待凝。（5）加棉塞：培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能，然后包扎一層牛皮紙。試管先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。2無菌水的制備。（1）用量筒量取90ml水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。（2）用10ml吸管取9ml水于10支試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。3器皿的準備。（1）培養(yǎng)皿的包裝：每10套一包，用牛皮紙包扎。（2）吸管的包裝：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用長紙條包扎、打結。（3）玻璃涂布棒的包

11、裝：方法同吸管的包裝。（4）槍尖的包裝：放入槍尖盒，牛皮紙包裝。4高壓滅菌。（1）將所要滅菌物品放入高壓蒸汽滅菌鍋內，根據需要設定滅菌溫度和時間（一般121，20min滅菌，若培養(yǎng)基中含有葡萄糖等成分時，113 ，30min滅菌）。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存。（2）滅菌完畢，將試管培養(yǎng)基擱成斜面，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。培養(yǎng)基冷至50左右，倒平板。5微生物的分離與純化。（1）土壤稀釋液的制備：稱取10g土壤，放入滅好菌的無菌水中用玻璃珠打碎土壤，靜置30min。取10mL土壤原液于1號試管中，從中取1mL浸液于裝有9mL無菌水的試管中，充分震蕩后依次操作，

12、將7支試管按稀釋倍數分別記作0，-1，-2，-3，-4，-5，-6號試管。10-30.1ml0.1ml10-010-110-2（2）涂布平板：分別取0度，-2度和-5度的試管中的土壤浸出液0.2ml于細菌培養(yǎng)基平板上，用刮刀涂布均勻。再分別取0度和-3度稀釋液0.2mL于準備好的霉菌培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。相同稀釋度的浸液涂布3個平板。（3）培養(yǎng)：將細菌培養(yǎng)基平板置于37恒溫箱培養(yǎng)24h，將霉菌培養(yǎng)基平板置于27恒溫箱培養(yǎng)3d。（4）平板計數及菌落描述：將培養(yǎng)好的細菌進行平板計數（理想為每平板上不多于30個菌），從而計算出1g土壤中細菌數；并觀察其菌落形態(tài)特征，記錄結果。（5）平板劃線分離：分

13、別選出5種細菌、霉菌進行平板劃線分離。分別在37和28恒溫箱中培養(yǎng)。（6）菌種保藏（留作鑒定）：將分離得到的菌種劃斜面。每株菌保存3支斜面。6.分離菌株的鑒定。（1）記錄菌種的培養(yǎng)特征。（2）細菌的革蘭氏染色，記錄菌體特征與染色特性。A制片：涂片，干燥，固定。B初染：滴加草酸銨結晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色1.5min后傾去染液，水洗至流出水無色。C媒染：先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min，傾去碘液，水洗至流出水無色。D脫色：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脫色2030s，當流出液無色時立即用水洗去乙醇。E復染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復染液染

14、色2min，水洗，吸去殘水晾干。F鏡檢：干燥后，油鏡鏡檢觀察。（3）細菌的芽孢染色。A制片：按常規(guī)方法涂片、干燥及固定。B加熱染色：向載玻片滴加數滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，用夾子夾住載玻片在微火上加熱染液冒蒸氣計時并維持5min，加熱時注意補充染液，切勿讓涂片干涸。C脫色：待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。D復染：用0.5%番紅水溶液復染2min。E水洗：用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。F鏡檢：將載玻片晾干后油鏡鏡檢。（4）細菌的鞭毛染色（硝酸銀染色法）。A載玻片制備：將載玻片用洗滌劑清洗干凈，置于95%乙醇中浸泡5min，使用時用鑷子取出在火焰上燒去乙醇及可能殘留的油跡

15、。B制片：在載玻片一端滴一滴清水，用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)物種蘸一兩下，再在清水中蘸一兩下，然后傾斜玻片，使液體緩慢流向載玻片另一端，用吸水紙洗去多余液體，自然干燥。C染色：滴加硝酸銀染液A液覆蓋菌面35min后用蒸餾水充分洗去A液。用硝酸銀染液B液洗去殘留水分后，再滴加B液覆蓋菌面4050秒，其間可用微火加熱，當菌面出現明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗，自然干燥。D鏡檢：用油鏡鏡檢觀察。（5）細菌的半固體穿刺試驗。A培養(yǎng)基試管的制備：將半固體培養(yǎng)基倒入試管中滅菌后，垂直放置待凝。B接種：將各菌種用接種針分別穿刺接種于半固體培養(yǎng)基中，37恒溫箱中培養(yǎng)24h。C觀察：觀察細菌生長范圍并記錄，判斷細菌是否有

16、運動性。（6）查伯杰氏手冊，初步對細菌菌種進行鑒定。（7）進行以下細菌的生理生化試驗：A淀粉水解試驗： 將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50左右，無菌操作制成平板。 用記號筆在平板底部劃成4個部分。 將選取的各菌分別在不同的部分點一下，在平板的反面分別在4個部分標明所接種細菌。 將平板倒置在37溫箱中培養(yǎng)24h。 觀察各種細菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現無色透明圈，說明淀粉已被水解，為陽性。根據透明圈的大小可初步判斷該菌水解淀粉能力的強弱，即產生胞外淀粉酶活力的高低。B油脂水解實驗 將熔化的固體油脂培養(yǎng)基冷卻至50左右時

17、，充分搖蕩，使油脂均勻分布，無菌操作倒入平板，待凝。 用記號筆在平板底部劃成4部分，分別在4部分標明所接種細菌。 用無菌操作將選取的各菌分別劃十字線接種于平板的相對應部分的中心。 將平板倒置，37溫箱中培養(yǎng)24h。 取出平板，觀察菌苔顏色。如出現紅色斑點，說明脂肪水解，為陽性反應。C糖發(fā)酵試驗 用記號筆在各試管外壁上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種細菌。 取數支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，分別接入所選菌種，另取一支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管不接種，作為對照。取數支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管，同樣分別接入所選菌種，另取一支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管不接種，作為對照。在接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。

18、 將接過種和作為對照的試管均置37中培養(yǎng)2448h。 觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡。D吲哚試驗 將所選菌種分別接入數支蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)48h。 向培養(yǎng)基內加入34滴乙醚，搖動數次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產生紅色環(huán)狀物為陽性反應。E甲基紅試驗 將所選菌種分別接入數支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)48h。 將1支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)物內加入甲基紅試劑2滴，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色者為陽性，變?yōu)辄S色者為陰性。（8）霉菌的形態(tài)觀察。A培養(yǎng)小室的滅菌：在平皿底部鋪一張略小于皿底的圓濾紙片，再放一U形玻棒，其上放一潔凈載玻片和兩塊

19、蓋玻片，蓋上皿蓋、包扎后于110滅菌2030min，烘干備用。B瓊脂塊制備：通過無菌操作，用解剖刀由馬鈴薯瓊脂薄層平板上切下1cm2左右的瓊脂塊，將其移至培養(yǎng)小室的載玻片上，每片兩塊。C接種：通過無菌操作，用接種針分別從各霉菌馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)物中挑取很少量孢子，接種于小室中瓊脂塊邊緣上，將蓋玻片覆蓋在瓊脂塊上。D培養(yǎng)：通過無菌操作，在培養(yǎng)小室中圓濾紙片上加35mL滅菌的20%甘油（用于保持濕度），蓋上皿蓋，于28培養(yǎng)3天。E鏡檢：取出載玻片用低倍鏡和高倍鏡鏡檢。（9）對照霉菌圖譜，對霉菌菌種進行鑒定。五 實驗報告：1 細菌的平板計數結果統(tǒng)計：菌液濃度原浸液×10-4平板123平均菌

20、落數13141313.31g土壤中細菌數約為：6.7×106個。2.細菌的形態(tài)特征觀察：細菌編號形狀大小干濕顏色邊緣表面1圓形中等干白色不整齊隆起2圓形中等濕淡黃整齊隆起3圓形小濕白色透明整齊隆起4不規(guī)則大濕乳白透明不整齊不隆起5不規(guī)則大濕白色不整齊不隆起3.細菌的革蘭氏染色及半固體穿刺實驗結果：（1） 細菌的革蘭氏染色及半固體穿刺實驗結果記錄：細菌編號形狀革蘭氏染色芽孢染色鞭毛染色半固體穿刺1長桿狀G+有芽孢有鞭毛運動2短桿狀G-無芽孢無鞭毛不運動3短桿狀G+有芽孢無鞭毛不運動4短桿狀G+有芽孢有鞭毛運動5短桿狀G+有芽孢有鞭毛運動（2）圖片：細菌的染色實驗結果：<1>

21、 革蘭氏染色 1號菌革蘭氏染色（10×100） 2號菌革蘭氏染色（10×100） 3號菌革蘭氏染色（10×100） 4號革蘭氏染色（10×100） 5號菌革蘭氏染色（10×100） 標準株 金黃色葡萄球菌革蘭氏染色（10×100）標準株 大腸桿菌革蘭氏染色（10×100）<2> 芽孢染色 1號菌芽孢染色（10×100） 2號菌芽孢染色（10×100） 3號菌芽孢染色（10×100） 4號菌芽孢染色（10×100）5號菌芽孢染色（10×100）<3> 鞭

22、毛染色 1號菌鞭毛染色（10×100） 2號菌鞭毛染色（10×100無鞭毛） 3號菌鞭毛染色（10×100無鞭毛） 4號菌鞭毛染色（10×100）5號菌鞭毛染色（10×100）4.查伯杰氏手冊得知，各菌所屬類群如下：菌種編號所屬類群（屬）該屬主要特征1芽孢桿菌屬菌體桿狀，直或接近直，0.3-2.2×1.2-7.0微米，多數運動，鞭毛典型側生。形成抗熱內生孢子，在一個孢子囊細胞中，孢子不多于1個。暴露與空氣中時，不妨礙孢子的形成。革蘭氏反應為：陽性、僅在生長早期為陽性、陰性。有機化能營養(yǎng)，利用多種底物進行嚴格呼吸代謝，嚴格發(fā)酵代謝或呼吸

23、和發(fā)酵二者兼有的代謝。在呼吸代謝中，最終的電子受體是分子氧，在一些種種可疑用硝酸鹽代替氧，大多數種產接觸酶。嚴格好氧或兼性厭氧。2不動桿菌屬桿菌，通常非常短粗，對數期典型菌為1.0-1.5×1.5-2.5微米，靜止期近乎球狀，排列以成對和短鏈占優(yōu)勢，在所有的培養(yǎng)物中有少量的大而不規(guī)則的細菌和絲狀體，但也可占優(yōu)勢，不形成芽孢無鞭毛。有些菌株在固體的表面在特殊情況下顯示“抽搐”式的運動。莢膜和纖毛可能有或沒有。不產生聚-羥基丁酸鹽細胞內含物。革蘭氏染色陰性。具氧化代謝的化能異養(yǎng)菌。作為碳和能源而利用的有機物通常是多樣化的。無特殊的生長需要，從糖類可能或不能產酸。氧化酶陰性，接觸酶陽性。不

24、產生乙酰甲基甲醇、吲哚和H2S。專性好氧菌，最適溫度為30-32，最適pH約為7?？骨嗝顾亍?，4梭菌屬桿狀，一般以周生鞭毛運動，很少不運動。形成卵園到球形孢子，一般孢子使桿狀菌體膨大，通常為革蘭氏陽性，至少在生長的早期如此。有機化能營養(yǎng)。有些種是解糖的，有些是解朊的，有的兩者兼?zhèn)?，有的兩者皆否，發(fā)酵糖，多元醇、氨基酸、有機酸、嘌呤和其他有機化合物。有些種固定N，都不還原 硫酸鹽。雖然有些種可在大氣壓下，在存在空氣的情況下生長，但絕大多數菌株是嚴格厭氧的。一般不產生接觸酶，即使產生，數量也少。5芽孢乳桿菌屬細胞直桿狀，0.7-0.8×3-5微米，單個、成對、很少呈短鏈，僅為數不多的長

25、周生鞭毛運動。形成內生孢子。革蘭氏陽性。有機化能營養(yǎng)，發(fā)酵代謝己糖是通過僅僅產生乳酸的典型的同型發(fā)酵途徑。不含有血紅素化合物，如接觸酶或細胞色素。微好氧。5.細菌的生理生化試驗結果記錄：（注：“+”表示在淀粉水解試驗、油脂水解試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗中呈陽性以及在葡萄糖發(fā)酵試驗、乳糖發(fā)酵試驗中產酸或產氣；“-”表示在淀粉水解試驗、油脂水解試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗中呈陰性以及在葡萄糖發(fā)酵試驗、乳糖發(fā)酵試驗中不產酸不產氣）細菌編號淀粉水解試驗油脂水解試驗葡萄糖發(fā)酵試驗乳糖發(fā)酵試驗甲基紅試驗吲哚試驗1-+-+-2-3-+-+-4-5+-+-+-空白- 油脂水解試驗葡萄糖發(fā)酵試驗乳糖發(fā)酵試驗甲基紅試驗吲哚試驗6.霉菌的形態(tài)觀察：（1） 霉菌的形態(tài)特征：霉菌編號形態(tài)特征1，2菌絲有隔，分生孢子梗亦有隔，頂端不膨大，無頂囊，其分生孢子梗多次分枝，產生對稱或不對稱的小梗，小頂端有孢子，形如掃帚，稱為帚狀體。（2） 圖片： 1號霉菌（10×40） 2號霉菌（10×40） 1號霉菌孢子梗 2號霉菌孢子梗（3） 對照霉菌圖譜，得知：1號菌和2號菌均屬于青霉屬。六 實驗小結通過本次實驗，鞏固了本學期所學的所有微生物實驗操作技能，幫助熟練了無菌操作，并且初步學習微生物鑒定純化的方法和思路，以及學會應用相關手冊對微生物進行分類。