分子生物學(xué)實驗課考試資料整理

1、 分子考試資料整理1. 質(zhì)粒DNA的構(gòu)型與電泳速率的關(guān)系？答：DNA分子的遷移速率取決于由DNA分子的大小與構(gòu)型而形成的分子篩效應(yīng)。在相同的構(gòu)型下，DNA分子遷移速率與其相對分子量成反比。相同分子量但不同構(gòu)型的DNA分子遷移速率不同。當(dāng)瓊脂糖凝膠的濃度較低時，電泳速率為：超螺旋DNA>線性DNA開環(huán)DNA。2. 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理以及三種溶液的作用？基本原理 質(zhì)粒的分離是利用質(zhì)粒DNA與染色體DNA在變性與復(fù)性中的差異來達到的目的。 當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，由于染色體DNA與質(zhì)粒DNA拓樸構(gòu)型不同,染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，而共價閉環(huán)質(zhì)粒

2、DNA的氫鍵雖被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入中和液后, 溶液pH調(diào)恢復(fù)至中性，在高鹽濃度的情況下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等形成沉淀；不同的是，質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，保持可溶狀態(tài)而留在上清中。這樣，通過離心可沉淀大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)。除去沉淀后上清中的質(zhì)粒可用酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。三種溶液的作用（ 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS (新鮮的)；溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2

3、 M 醋酸。）溶液I: Tris-Cl:適當(dāng)pH值,葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解,懸 浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部, EDTA:抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑)溶液II：NaOH：是最佳的溶解細(xì)胞的試劑。 這一步要記住兩點：第一，不能用舊的NaOH；第二，時間不能過長， 必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂。SDS: 是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-R-蛋白質(zhì)

4、的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 溶液III：醋酸鉀: K+離子會與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去；高濃度的鹽，使得沉淀更完全（在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或KAC，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀）。2 M的醋酸:中和NaOH，創(chuàng)造質(zhì)粒復(fù)性的環(huán)境。3. 感受態(tài)細(xì)胞制備過程應(yīng)注意的問題；細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度 最好從-70甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。 細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期

5、的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600（0.4-0.5）控制。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同；受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度 一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%；對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低；重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10-100倍。整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行 ，所用器皿及試劑都要滅菌。用純的試劑，注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染 整

6、個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴 CaCl2處理后細(xì)胞很脆，動作要輕，慢?；衔锛盁o機離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；4. 挖膠過程應(yīng)注意什么？保證切下的條帶沒有外源DNA的污染。切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積。切膠時盡量在長波長下進行，減少紫外對DNA的損傷。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，可采用薄而寬的梳子來跑膠。5. 如何滅活RNase？A. RNase 滅活劑 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基

7、團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。B.RNase滅活劑C.玻璃器皿200高溫烘烤2小時D

8、.塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液處理。6. 提取RNA和DNA時所用的飽和酚有什么不同？水飽和酚又叫水平衡酚。水飽和酚的PH小于7，一般是PH為5.0左右，通常與異硫氫酸胍一起使用，用于細(xì)胞RNA的提取，在酸性環(huán)境中，DNA在酚相，RNA在水相。兩者就分開了。Tris飽和酚一般PH大于7.8，用于DNA的提取。其中，酚是強的蛋白變性劑，可以使細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)變性析出。 由于PH值大于7，在堿性環(huán)境中DNA處于水相，RNA處于有機相。從而分離上清，即可得到DNA。7. 如何減少蛋白誘導(dǎo)過程中包涵體的產(chǎn)生？降低誘導(dǎo)溫度，一般15-25降低誘導(dǎo)劑ITPG濃度使用中等強度或弱的啟動子進行融

9、合表達增加蛋白質(zhì)折疊的添加劑與伴侶分子和折疊酶共表達選擇突變的菌株優(yōu)化培養(yǎng)基條件7. 單酶切時，為提高連接效率應(yīng)采取什么措施？為什么？通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其末端的磷酸基，防止環(huán)化， 通過連接反應(yīng)后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細(xì)胞后得以修復(fù)。8. 連接反應(yīng)中，插入片段與載體的合適比例是多少？ 載體與目的基因摩爾數(shù)之比為1：3-5 如果插入片段較小，而載體較大，和載體的摩爾比例3-6:1連接效果好，如果載體和插入片段大小相近，摩爾比1：1較好；如果插入片段和載體的摩爾比例過大，會導(dǎo)致多克隆的插入；如果插入片段和載體的摩爾比例過小，會導(dǎo)致假陽性增多。 9. 篩選陽性克隆的方法？ 菌落PCR

10、、酶切鑒定、Cracking gel、菌落原位雜交、測序10. 藍白斑篩選的原理是什么？如何出現(xiàn)大量藍斑，可能是什么原因？藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法：許多載體（PUC序列）都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS）。受體菌含編碼-半乳糖苷酶C端aa序列。當(dāng)無外源基因插入時，載體表達的N端-半乳糖苷酶多肽與受體菌表達的C端-半乳糖苷酶多肽功能互補，具有-半乳糖苷酶活性?？梢詫⑸孜颴-gal分解成藍色物質(zhì)，從而在培養(yǎng)基中形成藍色菌落。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點后，

11、造成插入失活，而使表達的產(chǎn)物不具有-半乳糖苷酶活性，不能分解底物X-gal，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。原因：1）載體與目的基因連接做的不好，重組質(zhì)粒太少，大量的自連載體進入感受態(tài)細(xì)胞。2）酶切不完全，未被酶切的空載體進入感受態(tài)細(xì)胞。11. 已知一個基因的核酸序列，如何進行蛋白表達？步驟？目的基因的獲取：提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)核酸序列設(shè)計引物，PCR擴增目的基因克隆載體的選擇與構(gòu)建：提取質(zhì)粒DNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建，即外源基因與表達載體的連接：雙酶切，電泳檢測，切膠回收目的片段，連接，獲得重組質(zhì)粒。重組DNA導(dǎo)入受體菌：轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌 重組體的篩選

12、：用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并將陽性菌落保存留種?？寺』虻谋磉_：先將菌種復(fù)蘇、擴繁；用IPTG分別誘導(dǎo)陽性克隆菌和空載體菌；取適量蛋白樣，處理好后，上樣、跑膠，染色、脫色、拍照。觀察重組蛋白的表達情況。a. 對于陽性克隆菌，向5ml菌液中加入IPTG至終濃度0.6mM（30ul 0.1M IPTG），繼續(xù)震蕩培養(yǎng)；b. 對于空載體菌，向5ml菌液中加入30ul 0.1M IPTG （終濃度0.6mM IPTG）；12.質(zhì)粒的特點是什么？結(jié)構(gòu)：大多為共價、閉合環(huán)狀、超螺旋（circular covalently closed DNA,cccDNA)功能：正常生長非必須的，但賦予細(xì)菌某些性狀

13、特征（具有遺傳標(biāo)記）復(fù)制和遺傳：細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子，其復(fù)制獨立于細(xì)菌染色體,但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。可以轉(zhuǎn)移。13. PCR的原理是什么？PCR程序通常有哪幾個步驟？聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction，PCR）是模擬體內(nèi)DNA的復(fù)制過程，在體外特異性擴增DNA片段的方法，從而獲得大量的同一序列DNA。 每經(jīng)過一輪擴增，模板分子數(shù)增加一倍，經(jīng)過n次循環(huán)后，模板分子數(shù)變?yōu)樵瓉淼?n倍。步驟：PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之

14、成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。14. 當(dāng)兩種限制酶反應(yīng)條件不同時，若要用雙酶切，應(yīng)采取什么措施？ 答：要避免星活性及部

15、分酶切。（1）先用低鹽緩沖液中活性最高的酶切，再補鹽和第二種酶；（2）用一種酶消化后，以酚：氯仿：異戊醇抽提，再經(jīng)乙醇沉淀，將DNA重新溶解與適合第二種酶的緩沖液，加第二種酶消化；（3）先低溫酶，后高溫酶；（4）使用通用緩沖液。15. 大腸桿菌轉(zhuǎn)化（CaCl2法）的原理？ 0下，細(xì)菌處于CaCl2的低滲溶液中，菌體細(xì)胞膨脹成球形，DNA與CaCl2形成羥基-鈣磷酸復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時間熱擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增值，被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子基因得以表達，在抗生素選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。16. 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)

16、化中的影響因素？細(xì)胞的生長狀態(tài)和密度 最好從-70甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。 細(xì)胞生長密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5×107個左右為佳。即應(yīng)用對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細(xì)菌，可通過測定培養(yǎng)液的OD600（0.4-0.5）控制。（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同；受體細(xì)胞一般應(yīng)是限制-修飾系統(tǒng)缺陷的突變株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細(xì)胞還應(yīng)與所轉(zhuǎn)化的載體性質(zhì)相匹配。質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度 一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%；對于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低；重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效

17、率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10-100倍。整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行 ，所用器皿及試劑都要滅菌。用純的試劑，注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染 整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴 CaCl2處理后細(xì)胞很脆，動作要輕，慢?；衔锛盁o機離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；17. CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA時，低溫的主要目的是什么？熱休克溫度和目的是什么？低溫目的：（1）抑制細(xì)胞的旺盛生理代謝；（2）有助于DNACa2+吸

18、附于細(xì)胞表面（3）防止DNAase降解DNA 。 熱休克溫度是42；目的是使細(xì)胞攝入吸附于其表面的DNA。18. 影響PCR擴增的因素有那些？ 引物的質(zhì)量與特異性；PCR循環(huán)條件（退火溫度）；Mg2+濃度；模板DNA的質(zhì)量；酶的質(zhì)量。 19. 引物設(shè)計的基本原則？引物長度一般在1825堿基之間。避免引物內(nèi)和引物之間的二級結(jié)構(gòu)兩個引物的Tm值要接近。 G+C含量在40%60%之間，避開局部富含GC或AT，3端避開AT rich結(jié)構(gòu) 堿基要隨機分布。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補，特別是3末端的3個堿基。引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。引物5端可以修飾，引物3端不可修飾。20. SD

19、S-PAGE的原理？SDS是一種陰離子表面活性劑，它能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵， 使蛋白質(zhì)變性而改變原有的構(gòu)象。蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合。PAGE聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(簡稱Bi )在加速劑N N N N-四甲基乙二胺(簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨 (簡稱AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。21. SDS-PAGE電泳的速率為什么只與蛋白的分子量有關(guān)，而與所帶電荷多少無關(guān)？蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，所帶的SDS的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)本身的電荷量，因而就掩蔽或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子間的電荷差異

20、對電泳遷移率的影響。電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量。22.提取RNA過程中，怎樣才能有效地降低材料本身給RNA提取帶來的降解？ 新鮮細(xì)胞：如果試劑沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞，一定要使裂解液能覆蓋住細(xì)胞。 新鮮組織：某些富含內(nèi)源核酸酶的樣品(如肝臟，胸腺等)，即使使用電動勻漿器勻漿也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時使用更多裂解液。 冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后移至-70冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70冰箱中。冷凍樣品，即使是冷凍細(xì)胞，如果

21、不在液氮條件下研磨碎，而直接加入裂解液中勻漿，RNA也比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以研磨用具必須預(yù)冷，在碾磨過程中要及時補充液氮。樣品研碎后，在液氮剛剛揮發(fā)完時，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。 外源RNA酶的污染：試劑，器械及實驗環(huán)境中的RNA酶進入實驗系統(tǒng)。內(nèi)源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實驗樣品過多；勻漿時溫度過高 23.異硫氰酸胍法提取RNA的原理？ 異硫氰酸胍可以裂解細(xì)胞釋放出核酸，并同時使蛋白質(zhì)變性，抑制內(nèi)源的RNase活性。在酸性條件下（NaAc pH4.0），RNA溶于水相，而DNA溶于有機相。這樣，在加入苯酚/氯

22、仿后，RNA就溶于上層水相中，而DNA溶于下層苯酚/氯仿中，蛋白處于中間層。含有RNA的水相被轉(zhuǎn)移出來以后，在異丙醇的作用下沉淀，從而被分離出來。24. 理想狀態(tài)下DNA、RNA OD260/280分別為多少？在什么范圍比較合適？偏大或偏小分別說明什么？基因組DNA 1.7<OD260/OD280<1.9，質(zhì)粒DNA OD260/280: 1.8-2.0；DNA: 1.8 (RNA: 2.0)，比值<1.8：蛋白質(zhì)污染；比值>2.0: RNA污染理想的RNA2.0, OD260/280在1.9-2.1之間。比值如果過低，可能有蛋白質(zhì)污染，過高RNA可能已發(fā)生降解。 如果

23、OD260/OD280過低（<1.7），通?？梢酝ㄟ^減少組織和細(xì)胞的用量來實現(xiàn)。OD260/OD280比值偏低？ 蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類材料中提取RNA時，需要注意多糖、多酚

24、雜質(zhì)的去除。設(shè)備限制：測定OD260及OD280數(shù)值時，要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD值時，對照及樣品稀釋液請使用10mM Tris，pH7.5或TE 。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。25. 基因組DNA提取的一般原理？如何判斷基因組DNA的濃度和質(zhì)量？將分散好的真核生物組織細(xì)胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚：異戊醇抽提的方法去除蛋白質(zhì)，得到的DNA經(jīng)乙醇沉淀或透析等方法進一步純化。 紫外分光光度法 OD280；瓊脂糖凝膠電泳基因組DNA的質(zhì)量檢驗：紫外分光光度法 OD260/280; OD260/230；酶切法（Hind II

25、I ）、完整性檢測：基因組DNA電泳，在電場中泳動慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象。26. 提取基因組DNA的用途有哪些？構(gòu)建基因組文庫、Southern 雜交、RFLP、基因克隆（PCR）、制作基因芯片27.提取基因組DNA所用試劑：組織消化液(100ml)： 5ml 1M Tris-HCl、4ml 0.5M EDTA、 2ml 10% SDS、 150ul 60mg/ml Protease K； Tris飽和酚； 酚/氯仿（1:1）； 氯仿； 無水乙醇； 70%乙醇；5M NaCl； TE28.RNase的來源？ 樣品、試劑、多次使用的器皿、手、說話產(chǎn)生的唾沫、空氣29.RNase

26、酶注意事項玻璃器皿處理：量筒、試劑瓶等玻璃器皿須200烘烤2小時以上。塑料器皿處理：0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。試劑處理：實驗用的所用試劑也可用DEPC處理，加入DEPC至終濃度0.1%，然后劇烈震蕩混勻10分鐘，然后高壓滅菌以消除殘余的DEPC。專用的RNA操作室、專用器械。操作時戴口罩、帽子、手套 一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，基本達到要求。注意：DEPC與氨水混合后會產(chǎn)生致癌物，須小心在通風(fēng)柜中使用。30. 組織和細(xì)胞樣品收集，保存？組織樣品收集后，需要立即保存在液氮中(1min)，或在樣品中加入一定量的保護劑，有一些商業(yè)

27、化的產(chǎn)品可以選用（RNA later， RNA store）。一般實驗收集50-100mg組織就足夠了。31.RNA保存(-80)：DEPC-H2O 、0.1 mM EDTA、TE (10mM Tris, 1mM EDTA)32.如何估計RNA的產(chǎn)量？RNA的含量與組織和細(xì)胞的類型有比較大的關(guān)系, 同時與抽提的方式有關(guān)mRNA的含量一般占總RNA含量的2-5%樣品如果低于20mg或10000個細(xì)胞，在抽提時需要考慮加入合適的RNA沉淀載體。電泳，加RNA marker來定量紫外分光光度計（OD260），通常0.5-1.5ug/ul比較合適33. 常用的RNA提取方法？異硫氰酸胍法、鹽酸胍法、R

28、NAzol法；Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。34. Solution D的成分及其作用？4M 異硫氰酸胍 （裂解細(xì)胞，抑制RNase） 25mM 檸檬酸鈉， pH7.0 (緩沖液)0.5% 十二烷基肌酸鈉 （裂解細(xì)胞，抑制RNase） DEPC水配制35. Trizol法提取昆蟲中腸總RNA需要的試劑：氯仿：異戊醇（24:1）、異丙醇、75%乙醇（in DEPC-treated water ）、RNase free 水或0.5% 

29、SDS 溶液準(zhǔn)備不含 RNase的水，將其裝入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。靜置過夜，然后高壓滅菌。0.5% SDS溶液必須用DEPC預(yù)處理、高壓滅菌的水。36. 昆蟲中腸總RNA的提取組織勻漿、相分離、沉淀RNA、洗滌RNA、沉淀再溶解、RNA檢測37. RNA提取注意事項在提取液中加入巰基乙醇對降低酚類的干擾可能有所幫助 在沉淀核酸時可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤

30、其用異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。溶于TE的核酸儲藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解 。在抽提過程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù)。提取RNA請盡量在低溫下操作。 38. 如何提高RNA提取效率？充分勻漿，以分散細(xì)胞；選擇合適的提取方法；選擇新鮮的組織；選擇合適的樣品儲存條件；避免內(nèi)源和外源Rnase的污染；正確的沉淀方法：乙醇沉淀：0.1 倍體積的5 M NH4Ac + 2-2.5 倍體積的 無水乙醇， -20 >25 min ；異丙醇沉淀：0.6-1倍體積的異丙醇。39. mR

31、NA的分離純化：采用Oligo dT-纖維素，從總RNA中分離出mRNA。該法利用mRNA 3末端有Poly（A）的特點，在總RNA流經(jīng)寡聚（dT）-纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下， mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度洗脫時，mRNA被洗脫下來。一般而言，經(jīng)過二次Oligo dT柱后，可得到較高純度的mRNA。40. 核酸的貯存DNA保存：1）短期貯存： 4或-20存放于TE（Tris和EDTA）緩沖液中。TE緩沖液(PH為8)，可減少DNA脫氨反應(yīng)；EDTA可以抑制DNase的活性。2）長期貯存：TE緩沖液中-70保存數(shù)年；41.提取基因組DNA主要試劑的作用： EDTA： 二

32、價金屬螯合劑，抑制核酸酶；降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性SDS的作用：溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂；溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；對RNA、DNA酶有抑制作用；與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)；蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時仍保持較高活性，可同時使用。苯酚的特點：蛋白質(zhì)強變性劑、抑制DNA酶活性；苯酚溶于有機溶劑，微溶于水；提取DNA前苯酚用Tris-Hcl飽和，防止吸收過多DNA，降低DNA的損失率；氧化苯酚會破壞DNA。42. 為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNA的分離？ 苯酚在空

33、氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于DNA分離，會使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA降解。 氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。PH8.0的Tris溶液可以使的抽提出的DNA進入水相，減少在蛋白質(zhì)層滯留。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實驗中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。無水乙醇沉淀：沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出。43. 一個合格表達載體的組成要素：復(fù)制起始位點Ori 。即控制復(fù)制起始的位點。原核生物DNA分子中只

34、有一個復(fù)制起始點。而真核生物DNA分子有多個復(fù)制起始位點?？股乜剐曰颉？梢员阌诩右詸z測，如Amp+ ,Kan+多克隆位點MCS 克隆攜帶外源基因片段P/E 啟動子/增強子Terms 終止信號加poly（A）信號 可以起到穩(wěn)定mRNA作用44. 原核表達系統(tǒng)中的各因素：復(fù)制子 ：通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達量是非線性的正相關(guān) 篩選標(biāo)記和報告基因 ：氨芐青霉素 ，卡那霉素 啟動子 ：啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一 組成型表達 :組成型啟動子 誘導(dǎo)調(diào)控型表達 :IPTG融合表達 ：GST, His-tag分泌表達 :信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜 可溶性表達 :轉(zhuǎn)錄終止子 :控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達導(dǎo)致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降 核糖體結(jié)合位點 :多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列 表達菌株 :不同的表達載體對應(yīng)有不同的表達菌株 45. 對原核表達載體