RP_HPLC法測定人血清中華法林濃度的方法學(xué)研究

1、安徽醫(yī)藥 A nhui M e d ical and Pharmace u tical Journal 2007D ec ; 11(12 ! 1065!藥學(xué)研究RP HPLC 法測定人血清中華法林濃度的方法學(xué)研究陳 紜, 黃曉暉, 唐海沁, 楊維維, 朱燕舞, 金 涌, 李 俊1122111(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 安徽合肥 230032; 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 安徽合肥 230022摘要:目的 建立一種簡易的方法測定成人血清中華法林的含量, 便于臨床藥物濃度監(jiān)測。方法 采用H ype rs ilOD S C 18色譜柱(150mm 4. 6mm , 5 m , 流動相為

2、(0. 01m o l ! L -1 磷酸二氫鉀溶液 甲醇 磷酸(38620. 009, 流速為1. 0m l ! m in -1, 檢測波長為205n m 。結(jié)果華法林保留時間為8. 7m i n , 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0. 06254. 0m g ! L -1, r =0. 9993, 華法林的高、中、低日間、日內(nèi)變異系數(shù)均在10%以下, 回收率>90%。結(jié)論含量檢測及應(yīng)用于臨床治療藥物監(jiān)測。關(guān)鍵詞:華法林; 反相高效液相色譜法; 血清濃度該法簡便、快速重現(xiàn)性好, 靈敏度高, 可用于人血清中華法林藥物Deter m inati on of warfari n i n hu man

3、blood seru m by RP HPLCC H E N Yun , HUANG X iao hu, i TANG H ai qin , YANG W ei w e, i Z HU Yan w u , JIN Yong , LI Jun(Co llege of Phar m ac y, A nhuiM edical Universit y, H efei 230032Abstrac t :A i m T o establis h an m ethod for de ter m i nati on o fw arfa ri n i n hu m an #s blood se ru m. M

4、ethods RP H PLC m ethod w as used , w it h C 18co l u m n at the standa rd of 150mm 4. 6mm, 0. 01m o l ! L -1KH 2PO 4m ethanol H 3PO 4so l ution (38620. 009 as m ob ile phase . T he fl ow rate was 1. 0m l ! m i n -1. UV detecti on w as de ter m i ned at 205n m. R esu lts The reserve ti m e o fW arfa

5、 ri n i n hu m an b l ood se ru m was 8. 7m i n . T he linear ity rang e o f standard curv e was bet ween 0. 0625and 4. 0mg ! L -1. The av erage recovery w as 90%.R SD o f three consi stencies i nc l ud i ng the high , m i ddle and lo w var i ed i n less t han 10%.Conc l u sion T he m ethod i s si m

6、 p le , fast and ac curate fo r t he analysis o fw arfar i n i n hu m an b l ood serum . K ey word s :w arfar i n; RP H PLC ; se ru m concentrati on 華法林是臨床使用最廣泛的雙香豆素類抗凝藥, 可用于房顫等疾病的預(yù)防和治療, 心臟瓣膜置換的病人更需終身服用華法林。我國房顫患者愈千萬, 約70%左右的患者需服用華法林治療。華法林的主要并發(fā)癥是嚴(yán)重出血, 全球每年有生命危險的出血率約為百分之二1。華法林的藥理作用復(fù)雜, 年齡、體重、種族、并發(fā)癥、飲食、

7、合并用藥等諸多因素影響其藥效, 其治療窗很窄, 且每日有效劑量個體差異很大(160m g ! d -1 , 故臨床很難為具體病人確定有效的初始及維持劑量, 病人需經(jīng)常進(jìn)行國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(I NR 監(jiān)測。對華法林進(jìn)行臨床藥物治療血藥濃度監(jiān)測非常有助于個體化治療, 但目前國內(nèi)目前尚缺乏測定華法林血藥濃度的簡單易行方法, 給臨床合理用藥造成一定困難。因此, 本文對針對國外相關(guān)文獻(xiàn)報道的方法加以改進(jìn)2, 3, 采用高效液相色譜法建立簡單有效的華法林血藥濃度檢測方法, 非常有助于該藥的臨床藥物治療監(jiān)測及個體化用藥4, 5。1 材料與儀器1. 1 藥品與試劑 華法林標(biāo)準(zhǔn)品由溫州市華基化工有限公司提供, 甲

8、醇為H PLC 專用色譜醇, 磷酸二氫鉀和磷酸為分析純試劑, 水為去離子重蒸餾水(用前過濾, 標(biāo)準(zhǔn)空白人血清由中國藥品檢定所提供。1. 2儀器 美國W aters 高效液相色譜儀(包括W aters 600型HPLC 泵, W aters 2996PA D 型紫外檢測儀, W a ters 600柱溫基金項(xiàng)目:安徽省自學(xué)科學(xué)基金項(xiàng)目(編號:070413117;安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號:2006k j 307b 通訊作者:黃曉暉(1973-, 男, 博士, 副教授, 碩士生導(dǎo)師, E m ai:lm athdrug si n a . com控箱等; Empo w er P ro 色譜數(shù)

9、據(jù)工作站; 1000、200、20 l 微量注射器; 50 l 進(jìn)樣器; 旋渦混合器; 離心沉淀器。1. 3色譜分析條件 色譜柱為hype rs il ODS C 18色譜柱(大連依利特公司150mm 4. 6mm, 5 m ; 流動相為0. 01mo l ! L -1磷酸二氫鉀溶液 甲醇 磷酸(38620. 009; 流速為1. 0-1m l ! m in ; 檢測波長為205n m; 柱溫為30。1. 4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取華法林標(biāo)準(zhǔn)品5. 0m g , 用-1甲醇配制含華法林100mg ! L 的對照品貯備液; 取適量貯備液, 用甲醇精密稀釋成10mg ! L -1的華法林標(biāo)準(zhǔn)品液

10、, 低溫避光儲存。1. 5 樣品預(yù)處理 取血清0. 5m l 加入一定量樣品標(biāo)準(zhǔn)液(10mg ! L -1, 加甲醇0. 3m , l 加0. 1m o l ! L -1鹽酸5 l 漩渦混勻, 40C 離心(3000r ! m i n -1 10m i n 。取上清液-700C 凍存待測定。1. 6 H PLC 方法專屬性分別取樣品血清、空白血清、標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 l 進(jìn)樣, 華法林保留時間為8. 7m i n 左右, 無雜峰干擾測定。血清中華法林能得到較好的分離, 與華法林對照品基本一致, 故在此條件下所測的結(jié)果能代表原藥濃度(圖1 。2 結(jié)果2. 1線性關(guān)系與靈敏度取空白試管分別加入不同量的對

11、照品溶液, 再加入血清0. 5m , l 配成4. 0, 2. 0, 1. 0, 0. 5, 0. 25, 0. 125, 0. 0625m g ! L -17份標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液, 按上述%樣品預(yù)處理方法&進(jìn)行操作, 取30 l 進(jìn)樣, 以樣品濃度(X 與樣品峰面積(Y 作線性回歸, 線性范圍為0. 06254. 0m g ! L -1, 回歸方程為Y =0. 05X +0. 03-2. 73e(r =0. 9993, P <0. 05 (圖! 1066! 安徽醫(yī)藥 A nhui M e d ical and Pharmace u tical Journal 2007D ec ; 1

12、1(12表1理論值/m g ! L -10. 1250. 52血清中華法林回收率試驗(yàn)結(jié)果(n =5 測得值(s 0. 1310. 0070. 470. 021. 840. 03平均回收率/%104. 894. 092. 0RSD /%6. 33. 52. 62, 最低檢測濃度為0. 0625m g ! L -1, 取對照品溶液經(jīng)水稀釋后, 按信噪比大于5的要求, 結(jié)果本品最低檢測限為0.00313mg ! L -1。2. 2 回收率測定 取空白試管加入不同量的對照品溶液, 再加入血清0. 5m , l 使血清濃度分別為0. 125, 0. 5和2. 0m g ! L -1, 按%樣品預(yù)處理方法

13、&進(jìn)行操作后進(jìn)樣, 記錄樣品峰面積, 同時以相同濃度標(biāo)準(zhǔn)對照品直接進(jìn)樣的峰面積進(jìn)行回收率計算, 結(jié)果見表1。由表1可見, 低、中、高濃度華法林回收率均在90%以上, 提示該法的提取回收率符合生物樣品分析要求。空白血清標(biāo)準(zhǔn)品圖1 華法林HPLC 色譜圖血清+標(biāo)準(zhǔn)品2. 3 精密度試驗(yàn) 取空白試管分別加入不同量的對照品溶液, 加入0. 5m l 血清, 使血清藥物濃度分別為2. 0, 0. 5和0. 125mg ! L -1, 按%血清樣品提取與分離&操作, 計算日內(nèi)變異和5d 內(nèi)日間變異(表2 。由表2結(jié)果可見, 高、中、低三個濃度日內(nèi)及日間變異均<8%。其中, R SD

14、=(S / 100%, 為平均峰面積, S 為標(biāo)準(zhǔn)偏差。表2理論值/ m g ! L -10. 1250. 52華法林的精密度試驗(yàn)結(jié)果(n =5 日內(nèi)實(shí)測值(s 0. 1200. 0050. 490. 022. 0410. 07RSD /%4. 24. 13. 4日間實(shí)測值(s 0. 1200. 0080. 480. 032. 040. 12RSD /%6. 76. 35. 9具有同時監(jiān)測多波長的優(yōu)點(diǎn), 在本研究的條件下把波長定在205n m 時峰形最好, 雜質(zhì)干擾最少, 靈敏度最高。加樣回收率研究中, 甲醇提取效果明顯優(yōu)于國外文獻(xiàn)2,3報道的乙醚, 二氯甲烷, 二氯甲烷與環(huán)己烷, 而且大大縮

15、短了提取時間, 簡少了人力和延長了色譜柱的使用壽命, 另外提取過程中加入0. 1m o l ! L -1鹽酸對華法林的色譜行為影響很大, 加入適量的鹽酸可改善華法林色譜峰的拖尾現(xiàn)象、延長出峰時間, 使峰形對稱, 并且明顯提高了加樣回收率, 但是鹽酸量過大和過小都會影響到回收率。另外, 經(jīng)實(shí)驗(yàn), 對照品及樣品溶液采用棕色容量瓶低溫貯存, 測定結(jié)果比較穩(wěn)定。 在%1. 3色譜分析條件&中, 除上述H ypersil ODS C 18色譜柱(150mm 4. 6mm , 5 m 柱外, 還使用P eno m enex C 18色譜柱(150mm 4. 6mm , 5 m 柱、K rom as

16、il C 18色譜柱(150mm 4. 6mm , 5 m 柱在不同時間, 經(jīng)不同試驗(yàn)人員, 對本品進(jìn)行檢測, 發(fā)現(xiàn)使用H ypersil ODS C 18柱時, 柱峰峰形最為理想, 耐用性比較好, 符合測定的要求。參考文獻(xiàn):圖2 血清華法林標(biāo)準(zhǔn)曲線1 W eitz JI . Em erging anti coagulan t s for t h e treat m ent of venous t h ro mboe mbo li s m J.Th ro m bosis and H ae mostasis , 2006, 96(3:274-84.2 H enne KR , Gaedigk A

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