人心肌肌鈣蛋白I的原核表達(dá)及其兔抗體的制備

1、 論著 文章編號(hào) :1007-8738(2005 04-0463-04人心肌肌鈣蛋白 I 的原核表達(dá)及其兔抗體的制備徐 霞 1, 楊 能 1, 涂洪斌 2(廣州醫(yī)學(xué)院 :1檢驗(yàn)系 ; 2實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心 , 廣東 廣州 510182收稿日期 :2004-07-02; 修回日期 :2004-11-01基金項(xiàng)目 :廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目 (No . A2000265 作者簡(jiǎn)介 :徐 霞 (1962- , 女 , 江蘇連云港人 , 副教授 , 碩士生導(dǎo)師 .Tel:(020 81340270; E mail:xuxia503yahoo. com. cnProkaryoti c expre

2、ssi on of human cTn I and prepara ti on of rabb it an ti 2hcTn I an ti bodyXU X ia 1, YAN G N eng 1, TU Hong 2bin21Depart m ent of Medical Laborat ory Sciences,2Ex peri m ental MedicalResearch Center, Guangzhou Medical College, Guangzhou 510182, ChinaAbstract A IM :To co n s truc t the p r o ka ryo

3、ti c exp re s 2s i o n ve c t o r p ET 221a (+ 2hcTn I a nd p rep a re the rabb it a n ti 2hcTn I a n ti bo dy u si ng hcTn I e xp re s sed i n E. co li a s i m m uno 2gen. M ETHOD S:The fu ll 2l e ng th ge ne e nco d i ng hum a n ca r 2d i a c tr opo n i n I (hcTn I w a s syn the s i zed chem i ca

4、ll y a nd i n 2se rted i n t o exp re s si o n p l a sm i d p ET 221a (+ t o co n struc t re 2com b i nan t p l a sm i d p ET 221a (+ 2hcTn I . The recom b i nan t p l a sm i d w a s tran sfo r m e d i n t o E. co li BL21(D E3 p l ysS w h i ch the n e xp re sse d hcTn I unde r I PTG i nduc ti o n. T

5、he i m 2m uno l o g i ca l a c ti vity o f the exp re s se d hcTn Iw a s a na l yzed by W e s te rn b l o t . A ra bb it w a s i m m un i ze d w ith p u ri fi ed hcTn I t o p rep a re a n ti 2hcTn I an ti bo dy a nd the Ab s p r op e rti e s w e re i de n ti fi ed. RESU L TS:Hum an cTn I gene w a s

6、syn the s i zed a nd co nfir m ed by DNA seque nc i ng.Po s iti ve recom b i nan tc l o ne s w e re i den ti fi e d by re s tri c ti o n e nzy m e d i ge sti o n a na l y 2s is a nd DNA seque nc i ng. Afte r i nduc ti o n w ith I PTG, hcTn I w ith M r be i ng 24000w a s e xp re sse d i n E. co li BL

7、21(D E3 p l ysS , a nd the e xp re sse d hcTn I a cco un ted f o r 28%o f t o ta l bac te ri a l p r o te i n. W e s te rn b l o t ana l ys is show e d tha t the hcTn I p r o te i n co u l d be reco gn i ze d by an a n ti 2hcTn I anti body . Rabbit po l ycl o na l anti body w ith a good speci fi cit

8、y wa s obta i ned . The tite r of the po l ycl o na l anti body w a s 3×10-4. CO NCL U 2S I O N:The re com b i na n t e xp re s s i o n p l a sm i d o f hcTn I w a s co n struc te d succe s sfu ll y a nd exp re s se d i n E. co li . The p re 2p a re d rabb it an ti 2hcTn I an ti bo dy ha d a h

9、i gh tite r and sp e c i 2fi c ity .Keywords cTn I ; p r o ka ryo ti c exp re ssi o n; an ti bo dy; rabbit摘 要 目的 :構(gòu)建人心肌肌鈣蛋白 I (hcTn I 基因的原核表達(dá)質(zhì)粒 , 在 大 腸 桿 菌 中 表 達(dá) 后 , 并 制 備 兔 抗 hcTn I 抗 體 。 方法 :以化學(xué)方法合成 hcTn I 基因并插入融合表達(dá)載體 pET 221a (+ 的多克隆位點(diǎn) , 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET 221a (+ 2hcTn I 。 以重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3 p lysS,

10、 篩選陽(yáng)性重組子 , 經(jīng) I PTG 誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá) , 表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué) 活性用 W estern bl ot 進(jìn)行鑒定 。以表達(dá)的 hcTn I 蛋白免疫家 兔 , 制備抗 hcTn I 的抗體并進(jìn)行純化及特性鑒定 。 結(jié)果 :成功 地合成 hcTn I 基因 , 測(cè)序證實(shí)序列正確后亞克隆于表達(dá)載體pET 221a (+ 中 , 經(jīng) PCR 篩選和酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆 , 序列分析表明其中的插入序列與 cTn I 基因完全一致 。 在大腸桿 菌中表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量 (M r 為 24000的目的蛋白 , 約占菌 體總蛋白的 28%, W estern bl ot 分析顯示 , 表達(dá)的

11、hcTn I 蛋白 具有良好的免疫反應(yīng)性 。 以純化的 hcTn I 免疫家兔后 , 能有效地刺激特異性抗體的產(chǎn)生 , 抗血清的效價(jià)為 3×10-4, 且具有良好的特異性 。 結(jié)論 :成功地構(gòu)建 hcTn I 基因的原核表達(dá) 載體 pET 221a (+ 2hcTn I, 并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá) 。 制 備出兔抗 hcTn I 的抗體 , 且效價(jià)及特異性均較良好 , 為進(jìn)一步 建立酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè) hcTn I 奠定了基礎(chǔ) 。關(guān)鍵詞 肌鈣蛋白 I ; 原核表達(dá) ; 抗體 ; 兔 中圖分類(lèi)號(hào) Q51 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 人心肌肌鈣蛋白 I (hcTn I 僅存在于心肌中 , 由 于在

12、心肌損傷時(shí)出現(xiàn)早 、 持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn) , 已成為 目前國(guó)內(nèi)外診斷急性心肌梗死 、 不穩(wěn)定型心絞痛及 心臟介入治療后心肌缺血的標(biāo)志物 。近年有關(guān)該蛋 白的性質(zhì)及檢測(cè)方法的研究已得到越來(lái)越多的關(guān) 注1-3。 本研究中我們采用化學(xué)合成的 hcTn I 基因 ,構(gòu)建了其原核表達(dá)載體 , 并在 E . coli 中實(shí)現(xiàn)高表達(dá) 。 以表達(dá)的 hcTn I 蛋白免疫兔制備出高效價(jià) 、 高特異性 的抗 cTn I 抗體 , 為進(jìn)一步建立酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè) hcTn I 奠定了基礎(chǔ) 。1 材料和方法1. 1 材料 p MD182T 、 pET 221a (+ 質(zhì)粒 、 E . coliDH5及 BL21(DE

13、3 p lysS, 由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué) 研究中心保存 。 T4DNA 連接酶 、 Taq DNA 聚合酶 、 pfu DNA 多聚酶及 Eco R I 、 Sal I, 均購(gòu)自 NE B 公司 。質(zhì)粒 DNA 純化試劑盒及凝膠抽提試劑盒購(gòu)自 Takara364公司 。 I PTG 購(gòu) 自 美 國(guó) Calbi oche m 公 司 ?？?hcTn I mAb 購(gòu)自澳洲 Che m icon 公司 。 福氏完全佐劑和不完 全佐劑 、二 氨 基 聯(lián) 苯 胺 (DAB 購(gòu) 自 Sig ma 公 司 。 HRP 2羊 抗鼠 I gG 及 HRP 2羊 抗兔 I gG 購(gòu)自北京中山公 司 。 酶標(biāo) 反

14、應(yīng) 板 購(gòu) 自 Corning 公 司 。乳 酸 脫 氫 酶 (LDH 、 肌酸激酶 (CK 、 肌酸激酶同工酶 (CK 2MB 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)控血清購(gòu)自 Beckman 公司 。硝酸纖維素膜 購(gòu)自 B I O 2RAD 公司 。 成年雄性家兔 (體質(zhì)量 2. 0kg 由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 。1. 2 方法1. 2. 1 hcTn I 全長(zhǎng)基因的合成及鑒定 根據(jù)基因文 庫(kù)登錄 4的 cTn I 基因的編碼序列 , 并充分考慮到大 腸桿菌基因密碼子的偏愛(ài)性 , 合成 12條核苷酸片段 和 9條連接片段 , 對(duì)于其中的某些密碼子給予改變 以保證其氨基酸序列的不變 。為方便克隆 , 在 5 端 及

15、 3 端 分別設(shè)計(jì)了 Eco R I 和 Sa l I 酶切位點(diǎn) 。 12條 寡核苷酸序列 (P1P12 由 642個(gè)堿基組成 , 兩兩部 分重疊 , 構(gòu)成完整的 hcTn I 基因 。 將上述寡核苷酸片 段首先按文獻(xiàn) 5所述 , 對(duì) P1、 P2、 P3、 P4末端進(jìn)行 加磷反應(yīng) , 然后加入連接子 、 、 。以 P1(5 2 TCGCTGCTGCCATCCGCCATG AATT C 23 和連接子 為上 、 下游引物 , 經(jīng) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生 255bp 的片段 I ; 以同樣方式 , 以 P4、 P5、 P6、 P7和連接片段 、 、 擴(kuò)增出 252bp 的片段 II ; 以 P7、 P

16、8、 P9、 P10和連 接片段 、 、 擴(kuò)增出 261bp 的片段 III, 如此經(jīng) 過(guò)連接 、 退火 、 分段進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增合成 hcTn I 基因 。 PCR 擴(kuò)增的條件為 :94 變性 5m in, 55 退火 30s, 72 延伸 45s, 重復(fù) 30個(gè)循環(huán) , 最后再于 72 延伸 10m in 。 將擴(kuò)增的 hcTn I 全長(zhǎng)基因連接至克隆載體 p MD182T 中 , 構(gòu)建重組質(zhì)粒 p MD182T/hcTn I, 并以其 轉(zhuǎn)化 E . coli DH5。 挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子 , 由上海申友生 物技術(shù)有限公司測(cè)定基因的序列 。1. 2. 2重 組 表 達(dá) 載 體 的 構(gòu) 建 將

17、 測(cè) 序 正 確 的 p MD182T/hcTnI 重組質(zhì)粒經(jīng) Eco R I 和 Sal I 雙酶切 后 , 回收目的片段并與表達(dá)載體 pET 221a (+ 相連接 構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒 pET 221a (+ 2hcTn I 。 以重組表 達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3 p lysS, 培養(yǎng)后挑取 菌落 , 用質(zhì)?；厥赵噭┖刑崛≠|(zhì)粒 , 以 Eco R I 和 S al I 進(jìn)行雙酶切 、 PCR 鑒定 (所用上游引物為 :5 2 TCGCTGCTGCCATCCGCCATG AATT C 23 , 下 游 引 物 為 :5 2TT ATCAGCTTT CAAAT 23 。核酸序列的測(cè)

18、定 由上海申友生物技術(shù)有限公司完成 。 1. 2. 3 重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將轉(zhuǎn)化的 大腸桿菌 BL21(DE3 p lysS 培養(yǎng)后 , 挑取單個(gè)菌落 , 接種到 5mL 含氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)基中 , 觀察不 同溫度 (25 、 30 及 37 培養(yǎng)條件下 A600值的不 同 、 不同濃度 (0. 01、 0. 051. 0mmol/L 的 I PTG, 以及不同的誘導(dǎo)時(shí)間 (14h 對(duì) hcTn I 表達(dá)的影響 。 誘導(dǎo)表達(dá)后 , 離心收集細(xì)菌 , 經(jīng)超聲粉碎后取細(xì)菌裂 解產(chǎn)物 , 進(jìn)行 S DS 2P AGE 分析 。1. 2. 4 表達(dá)產(chǎn)物的純化 E . coli BL

19、21(DE3 p lysS 表達(dá)的 hcTn I 主要以包涵體的形式存在 。取優(yōu)化表 達(dá)條件下誘導(dǎo)表達(dá)的菌液 1L, 在冰浴中用超聲粉碎 菌體 , 于 4 、 以 12000r/min 離心 10m in 。收集沉 淀 , 即得精制的包涵體 。 將包涵體用含 2mol/L尿素 和 50g/LTrit on X 2100的洗液反復(fù)洗滌后 , 溶于含 DTT 的變性液中使蛋白變性 , 然后再對(duì) 1mmol/L P BS (pH 7. 4 透析復(fù)性 , 收集蛋白保存于 -20 備用。 1. 2. 5 純化的 hcTn I 的 W estern bl ot 分析 將純化 的 hcTn I 經(jīng) S DS

20、 2P AGE 后 , 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 , 用 50g/L的脫脂奶粉封閉后 , 依次滴加 1 2000的 抗 hcTn ImAb (一抗 及 1 1000的 HRP 2羊 抗鼠 I gG (二抗 , 以 DAB 染色后觀察結(jié)果 。1. 2. 6 兔 hcTn I 抗體的制備及純化 取上述純化的 hcTn I 免疫 1只雄性 成年 大白兔 。初 次 免 疫 時(shí) 用 100g/0. 5mL 與等體積的完全福氏佐劑混合乳化 后 , 于背部皮下多點(diǎn)注射 。以后每隔 1wk 加強(qiáng)免疫 1次 , 劑量同前 , 改用不完全佐劑 , 共免疫 5次 。于 每次加強(qiáng)免疫后 7d, 均取血用免疫雙擴(kuò)法測(cè)定抗體

21、 的效價(jià) 。 當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到 1 16時(shí) , 心臟抽血分離血 清 。 抗血清的純化采用常規(guī)的硫酸銨鹽析法 。1. 2. 7 抗體特性的鑒定 效價(jià)測(cè)定 :采用間接 EL I S A 法 。 以 hcTn I 包被 , 依次加入不同稀釋度的抗 血清 、 不相關(guān)的兔 I gG 及 HRP 2羊 抗兔 I gG, 最后以 T MB 顯色后 , 用酶免疫分析儀于波長(zhǎng) 450n m 測(cè)定 A 值 。 特異性鑒定 :采用間接 EL I S A 法 。分別 以 LDH 、 CK 、 CK 2MB 、 hcTn I 及 RP M I 1640完全培養(yǎng)液 包被 , 依次加入 1 100的兔抗 hcTn I 血清及

22、 HRP 2羊抗兔 I gG, 最后以 T MB 顯色后測(cè)定 A450, A 450值大于 陰性對(duì)照的 2. 1倍為陽(yáng)性 。2 結(jié)果2. 1 hcTn I 全基因的合成 序列測(cè)定證實(shí) , 人工合 成的 hcTn I 基因序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致 。4642. 2 表達(dá)載體 pET 221a(+ 2hcTn I 的鑒定 PCR 鑒定 :以 pMD182T 2hcTn I 和 pET 221a (+ 2hcTn I 為模 板 , 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約 640bp; 空載體 pMD182T 與 pET 221a (+ 均未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶 (圖 1 。 表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定 :從含氨芐青霉素的瓊脂平板上挑

23、 取氨芐抗性菌落 , 擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒 DNA, 用Eco R I 和 Sal I 雙酶切后 , 切下的目的基因片段的長(zhǎng)度約為 640bp (圖 2 ; 而空載體 pET 221a (+ 的大小 為約 5440bp, 證明重組表達(dá)載體構(gòu)建是成功的 。 序列分析 :將陽(yáng)性重組子用載體通用引物進(jìn)行測(cè)序 分析 , 也證實(shí)插入片段的全長(zhǎng)為 642bp 編碼 210個(gè) 氨基酸。 圖 1 hcTn I 基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig 1 I dentificati on of PCR p r oduct of hcTn I gene by agar osegelelectr ophor

24、esisM:DNA ladder; 1:PCR p r oduct of hcTn I gene. 圖 2 重組載體 pET 221a 2hcTn I 的酶切鑒定Fig 2 Restricti on enzy me digesti on analysis of recombinant vect orpET 221a (+ 2hcTn I1:DNA markers; 2:pET 221a (+ 2hcTn I/Eco R I +Sal I ; 3:Emp ty vec 2t or pET 221a (+ /Eco R I +Sal I ; 4:DNA markers .2. 3 hcTn I 在

25、 E. coli 中的表達(dá)與鑒定 在最適表達(dá)條件下 (菌體密度 A 600值為 0. 6時(shí) , 加入終濃度為 0. 5mmol/L的 I PTG 誘導(dǎo)培養(yǎng) 4h , 表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的 28%。將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 S DS 2P AGE 分析 顯示 , 在 M r 約為 24000處出現(xiàn) 1條新生的蛋白帶 (圖 3 , 同預(yù)期的 hcTn I 蛋白的 M r 相符合。圖 3 hcTn I 基因表達(dá)的 S DS 2P AGE 分析Fig 3 S DS 2P AGE analysis of hcTn I gene exp ressi onM:Pr otein marker; 1:Pellet fr

26、 om pET 221a (+ vect or; 226:Pellet fr om pET 221a (+ 2hcTnI induced with I PTG f or 1, 2, 3, 4, 5hours, res pectively .2. 4 hcTn I 蛋白的 W estern blot 分析 W estern bl ot的結(jié)果顯示 , 在 M r 為 24000處有 1條顯色帶 , 表明 表達(dá)的 hcTn I 具有良好的抗原結(jié)合活性 (圖 4。圖 4 hcTn I 蛋白的 W estern bl ot 分析Fig 4 W estern bl ot analysis of hcTn

27、I p r otein1:Pr otein marker; 2:hcTn I p r otein .2. 5 兔 hcTn I 抗體的鑒定 間接 E L I S A 測(cè)定表明 ,兔抗 hcTn I 抗血清的效價(jià)為 3×10-4, 其與 LDH 、CK 、 CK 2MB 均無(wú)交叉反應(yīng) , 說(shuō)明制備的兔抗 hcTn I抗體具有良好的特異性 。3 討論20世紀(jì) 90年代以來(lái) , cTn I 在心血管疾病診斷中的應(yīng)用日趨增多 , 但所用試劑均為進(jìn)口產(chǎn)品 , 價(jià)格昂 貴 , 國(guó)內(nèi)因缺乏相應(yīng)的商品化檢測(cè)試劑而使臨床應(yīng) 用受限 。 由于人體心肌標(biāo)本的來(lái)源困難 , 依靠傳統(tǒng) 的生化提取方法又較為繁瑣

28、 , 而且產(chǎn)率低 、 純度差 。 而利用基因工程的方法 , 則可制備高純度的 hcTn I 蛋 白 , 不僅可以解決免疫原的來(lái)源 , 而且有利于診斷方 法的標(biāo)準(zhǔn)化 。為此 , 我們根據(jù)基因文庫(kù)中登錄的人 cTn I 基因的編碼序列 , 合成了大腸桿菌密碼子偏愛(ài)的 12條核苷酸片段和 9條連接片段 , 并拼接成 hcTn I 基因 。 將其插入表達(dá)載體 pET 221a (+ 中 , 構(gòu)建了重(下轉(zhuǎn) 469頁(yè) (I RES , 可較大程度上影響核糖體起始翻譯的效 率 7, 8。 獲得完整的 5 2UT R, 從而為研究翻譯型調(diào) 控 、 從不同的角度去探討提高抗體的產(chǎn)量和發(fā)現(xiàn)不 同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)均

29、提供了便利 。在本實(shí)驗(yàn)中 , 釣 取到 H 鏈的 5 2UTR 只有 1個(gè) , L 鏈的 5 2UT R 有 3個(gè) (2A 、 2B 和 2C 。 2A 和 2B 是采用 RLM 2RACE 法 釣出的完整的 5 2UTR, 含有 5 端帽子 , 呈現(xiàn)出同 1個(gè)基因在不同起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象 ; 2C 是采用 T 25 RACE 法釣出的不完整的 5 2UTR, 沒(méi)有 5 端帽子 。 由于用 RLM 2RACE 法可釣取到抗 2CD20抗體 V 區(qū)基 因 、 信號(hào)肽基因及其 5 2UT R, 從而為后續(xù)對(duì)其進(jìn)行 人源化改造打下了基礎(chǔ) , 為研究翻譯型調(diào)控提供了 便利 。 同時(shí)也說(shuō)明 , RL M

30、 2RACE 法在抗體工程研究 中具有重要的的應(yīng)用價(jià)值 。參考文獻(xiàn) :1解志剛 , 郭 寧 , 馮健男 , 等 . RACE 策略克隆抗人 CD16單克隆 抗體輕鏈可變區(qū)基因 J .細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志 , 2003, 19 (1 :82-83. 2張學(xué)敏 , 王宜強(qiáng) . 靶向新基因的分子克隆策略 2理 論與方法 M.北京 :軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社 , 1999:113-116.3李關(guān)榮 , 魯 成 , 夏慶友 , 等 . c DNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù) (RACE 的優(yōu)化與改良 J .生命科學(xué)研究 , 2003, 7(3 :189-197. 4Maruya ma K, Sugano S . O l

31、igo 2capp ing:a si m p le method t o rep lace the structure of eukaryotic mRNA s with oligoribonucleotides J . Gene , 1994, 138:171-174.5Sa mbr ook J, Fritsch EF, Maniatis T . Molecular Cl oning . A laborat ory manual M.2nd ed, Cold S p ring Harbor Laborat ory Press, Cold Sp ring Harbor, NY, 1989:16

32、-67.6Gor ovskyMA, L iu X . Mapp ing the 5 and 3ends of tetrahy mena ther 2 mophila mRNA s using RNA ligase mediated a mp lificati on of c DNA ends (RLM 2RACE J .N ucleic Acids R es , 1993, 21:4954-4960. 7Stein I, Itin A, Einat P, et al . Translati on of vascular endothelial gr owth fact or mRNA by I

33、 nternal ribos ome entry:I m p licati ons for translati on under hypoxia J .M ol Cell B iol , 1998, 18:3112-3119.8Schm itz J, Pr üfer D, Rohde W , et al . Non 2canonical translati on mechanis m s in p lants:efficient in vitr o and in p lanta initiati on atAUU codons of the t obacco mosaic virus

34、 enhancer sequence J .N ucleic A cids Res , 1996, 24(2 :257-263.(上接 465頁(yè) 組原核表達(dá)載體 5-7。 pET 221a (+ 中含有 T7高效 啟動(dòng)子 , 轉(zhuǎn)錄速度快 , 可高效表達(dá)其下游的外源基 因 。 表達(dá) pET 221a (+ 的受體菌 E . coli BL21(DE3 p lysS 不具有 ompT 外膜蛋白酶和 Lon 蛋白酶 , 為低 蛋白酶活性菌株 , 可使表達(dá)的蛋白穩(wěn)定存在 。但發(fā) 現(xiàn)不同濃度的 I PTG 、 不同的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和時(shí)間對(duì)表達(dá) 效果均有明顯影響 。 I PTG 在終濃度為 0. 05mmol/L時(shí)即有誘導(dǎo)作用 , 于 0. 5mmol/L時(shí)表達(dá)量基本達(dá)峰 值 。 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)以工程菌的 A600值為 0. 6時(shí) , 誘導(dǎo)蛋白 的表達(dá)量最高 , 誘導(dǎo)時(shí)間以 4h 為最佳 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 , 我們成功地獲得 hcTn I 全基因 , 并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá) , 表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的 28%, 表達(dá)產(chǎn)物的 Mr為 24000, 且具有良好的 免疫活性 。以純化的 hcTn I 蛋白免疫兔制備的抗血 清 EL I S A 效價(jià)可達(dá) 3&#