高一生物基因工程的基本操作程序人教實(shí)驗(yàn)版

1、【本講教育信息】一. 教學(xué)內(nèi)容：基因工程的基本操作程序二. 學(xué)習(xí)內(nèi)容本節(jié)是基因工程專題的核心，上承DNA重組技術(shù)的基本工具一節(jié)，下接基因工程的應(yīng)用。通過(guò)教材上的圖示，理解掌握基因工程的相關(guān)概念和操作程序，理解基因工程操作的意義。三. 教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn)1. 教學(xué)重點(diǎn)提取目的基因的方法目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的途徑?；蚬こ袒静僮鞒绦虻乃膫€(gè)步驟。2. 教學(xué)難點(diǎn)從基因文庫(kù)中獲取目的基因。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。四. 教學(xué)過(guò)程基因文庫(kù)：用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總 DNA 或染色體DNA的所有片斷隨機(jī)地連接到基因載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無(wú)性繁殖系（克隆），

2、在制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫(kù)。基因組文庫(kù)：用限制性內(nèi)切酶切割細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA，可以得到大量的基因組DNA片段，然后將這些DNA片段與載體連接，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中去，讓宿主菌長(zhǎng)成克隆。這樣，一個(gè)克隆內(nèi)的每個(gè)細(xì)胞的載體上都包含有特定的基因組DNA片段，整個(gè)克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和稱為基因組文庫(kù)。cDNA基因文庫(kù)：cDNA是由細(xì)胞內(nèi)的mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄的方式獲得的，其包含的一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)信息。多細(xì)胞生物的不同細(xì)胞的表達(dá)信息往往是不同的。若將某一個(gè)細(xì)胞全部的mRNA（又稱為這個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組）都逆轉(zhuǎn)錄成cDN

3、A，再將這些cDNA連接到載體上（基本上不打斷）并轉(zhuǎn)入微生物，那么這些微生物就組成了cDNA文庫(kù)。cDNA組成特點(diǎn)是其中不含有內(nèi)含子和其他調(diào)控序列。同一定義也適用于某種生物的線粒體DNA或葉綠體DNA的基因文庫(kù)。由于制備DNA片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的 DNA片段既可能是一個(gè)或幾個(gè)基因，也可能是一個(gè)基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近DNA順序。基因文庫(kù)與基因庫(kù)的概念不同。基因庫(kù)是指某一生物群體中的全部基因?；蛭膸?kù)與基因克隆的概念也有區(qū)別，基因克隆是只包含某些特定基因或 DNA片段的克隆。基因文庫(kù)中包含著為數(shù)眾多的克隆，建成后可供隨時(shí)選取其中任何一個(gè)基因克隆之用。PCR

4、技術(shù)：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。PCR反應(yīng)的基本成分包括：模板DNA（待擴(kuò)增DNA）、引物、4種脫氧核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模

5、板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，在溫度降至55左右時(shí)，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； 引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。目的基因：把需要研究的基因稱為目的基因。（一般把需要分析的基因稱靶基因，在基因克隆過(guò)程中有時(shí)兩者均稱為插入基因，有時(shí)三者含義相近。）目的基因的制備：1. 從細(xì)胞核中直接分離簡(jiǎn)單的原核生物目的基因可從細(xì)胞核中直接分離得到，但人類的基因分布在2

6、3對(duì)染色體上，較難從直接法中得到。2. 染色體DNA的限制性內(nèi)切酶酶解II型限制性內(nèi)切酶可專一性地識(shí)別并切割特定的DNA順序，產(chǎn)生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插入的DNA片段用同一種內(nèi)切酶消化，或靶DNA與載體DNA末端具有互補(bǔ)的粘性末端，可以直接進(jìn)行連接。3. 人工體外合成 簡(jiǎn)短的目的基因可在了解DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)或多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的核苷酸序列的基礎(chǔ)上人工合成。4. 用逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA 大多數(shù)的目的基因是由mRNA合成cDNA（反轉(zhuǎn)錄DNA）得到。從RNA入手，先從細(xì)胞提取總RNA，然后根據(jù)大多數(shù)真核mRNA含有多聚腺嘌呤（polyadenylic acid ,polyA）尾

7、的特點(diǎn)，用寡聚dT纖維素柱將mRNA分離出，以mRNA為模板，在多聚A尾上結(jié)合1218個(gè)dT的寡聚dT片段，作為合適的起始引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第一條目的基因。啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng)子就像“開(kāi)關(guān)”，決定基因的活動(dòng)。既然基因是成序列的核苷酸，那么啟動(dòng)子也應(yīng)由DNA組成。啟動(dòng)子本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過(guò)與稱為轉(zhuǎn)錄因子的這種蛋白質(zhì)結(jié)合而控制基因活動(dòng)的。終止子：DNA分子中終止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。而終止密碼子是作為翻譯終止的信號(hào)，在圖中，DNA分子下面一條被從左到右轉(zhuǎn)錄，從畫線DNA轉(zhuǎn)錄來(lái)的RNA片段形成發(fā)夾環(huán)，因?yàn)閮煽蛑泻塑账岷谢?/p>

8、補(bǔ)堿基順序，這就迫使DNA/RNA雜交區(qū)域裂開(kāi)，因?yàn)殡S后包括氫鏈結(jié)合較弱的多聚腺苷酸和尿嘧啶mRNA分子就從這個(gè)位置脫離下來(lái)。1. 外顯子與內(nèi)含子一般來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)基因都是由外顯子和內(nèi)含子組成，但是，外顯子和內(nèi)含子的關(guān)系不是完全固定不變的。有時(shí)同一條DNA鏈上的某一段DNA序列，當(dāng)它作為編碼某多肽鏈的基因時(shí)是外顯子，而作為編碼另一多肽鏈的基因時(shí)，則是內(nèi)含子，結(jié)果是同一基因可以同時(shí)轉(zhuǎn)錄為兩種或兩種以上的mRNA。2. 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)的異同點(diǎn) 原核細(xì)胞的基因真核細(xì)胞的基因不同點(diǎn)編碼區(qū)連續(xù)；結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單編碼區(qū)有間隔，不連續(xù)；結(jié)構(gòu)復(fù)雜相同點(diǎn)都有編碼區(qū)和非編碼區(qū)；編碼區(qū)都有調(diào)控

9、遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列；編碼區(qū)上游都有與RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)3. 獲取目的基因的方法3. 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合（以質(zhì)粒為運(yùn)載體）4. 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞：細(xì)菌 氯化鈣細(xì)胞壁的通透性增大重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞目的基因隨受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制 【模擬試題】（答題時(shí)間：60分鐘）一. 選擇題1. 構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)時(shí)，首先雷分離細(xì)胞的（ ）A. 染色體DNA   B. 線粒體DNA   C. 總mRNA   D. tRNA  2. 在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌

10、嶺脫氧核苷酸是460個(gè)）放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是（ ）A. 540個(gè) B. 8100個(gè) C. 17280個(gè)D. 7560個(gè)2. 在基因工程中，科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是（ ） A. 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便 B. 遺傳物質(zhì)含量少 C. 繁殖速度快 D. 性狀穩(wěn)定，變異少3. 因工程的操作步驟： 使目的基因與運(yùn)載體相結(jié)合， 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞， 檢測(cè)目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀要求， 提取目的基因，正確的操作順序是（ ）A. B. C. D. 4. 工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基

11、互補(bǔ)配對(duì)的步驟是（ ）A. 人工合成基因 B. 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C. 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D. 目的基因的檢測(cè)和表達(dá)5. 就分于結(jié)構(gòu)而論，質(zhì)粒是（ ）A. 環(huán)狀雙鏈DNA分子   B. 環(huán)狀單鏈DNA分于C. 環(huán)狀單鏈RNA分子   D. 線狀雙鏈DNA分子6. 聚合酶鏈反應(yīng)可表示為（ ）A. PEC   B. PER   C. PDR   D. PCR7. 在已知序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是（ ）A. 化學(xué)合成法    B. 基因組文庫(kù)法C. cDN

12、A文庫(kù)法   D. 聚合酶鏈反應(yīng)8. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是（ ）A. 限制性內(nèi)切酶只在獲得目的基因時(shí)才用B. 重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C. 質(zhì)粒都可作運(yùn)載體D. 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料9. 不屬于目的基因與運(yùn)載體結(jié)合過(guò)程的是（ ）A. 用一定的限制酶切割質(zhì)粒露出黏性末端B. 用同種限制酶切割目的基因露出黏性末端C. 將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增D. 將切下的目的基因插入到質(zhì)粒切口處10. 科學(xué)家通過(guò)基因工程的方法，能使馬鈴薯塊莖含有人奶蛋白。以下有關(guān)該基因工程的敘述錯(cuò)誤的是（ ）A. 采用反轉(zhuǎn)錄的方法得到的目的基因B. 基因非編碼區(qū)對(duì)于目的基因在

13、塊莖中的表達(dá)是不可缺少的C. 馬鈴薯的葉肉細(xì)胞可作為受體細(xì)胞D. 用不同種限制酶處理質(zhì)粒和含有目的基因的DNA，可產(chǎn)生黏性末端而形成重組DNA分子11. 基因工程常用的受體細(xì)胞有（ ） 大腸桿菌 枯草桿菌 支原體 動(dòng)植物細(xì)胞A. B. C. D. 12. 用DNA探針檢測(cè)飲用水中病毒的具體方法是（ ）A. 與被檢測(cè)病毒的DNA堿基序列進(jìn)行比較B. 與被檢測(cè)病毒的DNA堿基序列進(jìn)行組合C. 與被檢測(cè)病毒的DNA堿基序列進(jìn)行雜交D. A、B、C三種方法均可13. 1976年，美國(guó)的H.Boyer教授首次將人的生長(zhǎng)抑制素釋放因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌，并獲得表達(dá)，此文中的“表達(dá)”是指該基因在大腸桿菌（

14、 ） A. 能進(jìn)行DNA復(fù)制 B. 能傳遞給細(xì)菌后代C. 能合成生長(zhǎng)抑制素釋放因子 D. 能合成人的生長(zhǎng)素14. 在遺傳工程技術(shù)中，限制性內(nèi)切酶主要用于（ ）A. 目的基因的提取和導(dǎo)入B. 目的基因的導(dǎo)入和檢測(cè)C. 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合和導(dǎo)入D. 目的基因的提取和與運(yùn)載體結(jié)合15. （05廣東）以下有關(guān)基因工程的敘述，正確的是（ ）A. 基因工程是細(xì)胞水平上的生物工程 B. 基因工程的產(chǎn)物對(duì)人類全部是有益的C. 基因工程產(chǎn)生的變異屬于人工誘變 D. 基因工程育種的優(yōu)點(diǎn)之一是目的性強(qiáng)16.（多選）一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括（ ）A. 目的基因 B. 啟動(dòng)子 C. 終止子 D. 標(biāo)記基因二. 非

15、選擇題：1 在藥品生產(chǎn)中，有些藥品如干擾素，白細(xì)胞介素，凝血因子等，以前主要是從生物體的組織、細(xì)胞或血液中提取的，由于受原料來(lái)源限制，價(jià)價(jià)十分昂貴，而且產(chǎn)量低，臨床供應(yīng)明顯不足。自70年代遺傳工程發(fā)展起來(lái)以后，人們逐步地在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了相應(yīng)的目的基因，使之與質(zhì)粒形成重組DNA，并以重組DNA引入大腸桿菌，最后利用這些工程菌，可以高效率地生產(chǎn)出上述各種高質(zhì)量低成本的藥品，請(qǐng)分析回答：（1）在基因工程中，質(zhì)粒是一種最常用的 ，它廣泛地存在于細(xì)菌細(xì)胞中，是一種很小的環(huán)狀 分子。（2）在用目的基因與質(zhì)粒形成重組DNA過(guò)程中，一般要用到的工具酶是 和 。（3）將含有“某激素基因”的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞后，能在

16、細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)直接合成“某激素”，則該激素在細(xì)菌體內(nèi)的合成包括 和 兩個(gè)階段。（4）在將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌時(shí)，一般要用 處理細(xì)菌，以增大 。2. 下圖是將人類的生長(zhǎng)激素基因?qū)爰?xì)菌B細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”的示意圖，所用的載體為質(zhì)粒A。已知細(xì)菌B細(xì)胞內(nèi)不含質(zhì)粒A，也不含質(zhì)粒A上的基因，質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌B后，其上的基因能得到表達(dá)。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（注：質(zhì)粒中的a點(diǎn)即是四環(huán)素抗性基因的存在位置，又是與目的基因的結(jié)合點(diǎn)；斜線部分為抗氨芐青霉素基因）（1）人工合成目的基因的途徑一般有哪兩條？（2）如何將目的基因和質(zhì)粒結(jié)合成重組質(zhì)粒？（3）目前把重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，效率還不高，導(dǎo)入完成后得到的細(xì)菌，實(shí)際上有的根本沒(méi)有

17、導(dǎo)入質(zhì)粒，有的導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒A，只有極少數(shù)導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒?？赏ㄟ^(guò)以下步驟鑒別得到的細(xì)菌是否導(dǎo)入了質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒；將得到的細(xì)菌涂布在一個(gè)含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長(zhǎng)的就是導(dǎo)入了質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒的細(xì)菌，反之則沒(méi)導(dǎo)入。使用這種方法鑒別的原因是什么？（4）若把通過(guò)鑒定證明導(dǎo)入了普通質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒的細(xì)菌放在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)生的現(xiàn)象是什么？（5）導(dǎo)入細(xì)菌B細(xì)胞的目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是什么？3. 科學(xué)家通過(guò)基因工程培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，需要從蘇云金芽孢桿菌中提取出抗蟲(chóng)基因，“放入”棉花的細(xì)胞中與棉花的DNA結(jié)合起來(lái)并發(fā)揮作用，請(qǐng)回答下列有關(guān)問(wèn)題：（1）從蘇云金芽孢桿菌中切割抗蟲(chóng)基因所用的

18、工具是，此工具主要存在于中，其特點(diǎn)是。（2）蘇云金芽孢稈菌一個(gè)DNA分子上有許多基因，獲得抗蟲(chóng)基因常采用的方法是“鳥(niǎo)槍法”。具體做法是：用酶將蘇云金芽孢桿菌的切成許多片段，然后將這些片段，再通過(guò)  轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓它們?cè)诟鱾€(gè)受體細(xì)胞中大量，從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再用一定的方法把分離出來(lái)。（3）進(jìn)行基因操作一般要經(jīng)過(guò)的四個(gè)步驟是 、 、 、 ?！驹囶}答案】一. 選擇題：1. A 2. C 3. C 4. C 5. A 6. D 7. D 8. D 9. C 10. D11. D 12. C 13. C 14. D 15. D16. ABCD二. 非選擇題：1. （1）基因的

19、運(yùn)載體 DNA （2）限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶 （3） 轉(zhuǎn)錄 翻譯（4） 氯化鈣 細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性 2. 解析：此題是對(duì)基因操作“四步曲”比較全面的考查，而且注意聯(lián)系實(shí)際。（1）據(jù)課本內(nèi)容知人工合成基因的兩條途徑是： 將從細(xì)胞中提取分離出的目的基因作為模板，轉(zhuǎn)錄成mRNA單鏈DNA雙鏈DNA； 據(jù)蛋白質(zhì)中氨基酸序列mRNA中堿基序列DNA堿基序列目的基因。（2）將目的基因和質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒的過(guò)程是： 用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)有粘性末端的切口； 用同種限制酶切割目的基因，產(chǎn)生相同的粘性末端； 將切下的目的基因片段插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，使質(zhì)粒與目的基因結(jié)合成重組質(zhì)粒。（3）檢測(cè)質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，均需利用質(zhì)粒上某些標(biāo)記基因的特性。即對(duì)已經(jīng)做了導(dǎo)入處理的、本身無(wú)相應(yīng)特性的受體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)受體細(xì)胞是否具有相應(yīng)的特性來(lái)確定?？拱逼S青霉素基因在質(zhì)粒A和重組質(zhì)粒上，且它與目的基因是否插入無(wú)關(guān)，所以，用含氨芐青霉素這種選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)導(dǎo)入質(zhì)粒處理的受體細(xì)胞，凡能生長(zhǎng)的