基因工程知識點總結(jié)歸納更新版

1、基因工程緒論1、克隆(clone) ：作名詞：含有目的基因的重組DNA 分子或含有重組分子的無性繁殖。作動詞：基因的分離和重組的過程。2、 基因工程(gene engineerin)g：體外將目的基因插入病毒、質(zhì)粒、或其他載體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之摻入到原先沒有這些基因的宿主細(xì)胞內(nèi)，且能穩(wěn)定的遺傳。供體、受體和載體是基因工程的三大要素。3、基因工程誕生的基礎(chǔ)三大理論基礎(chǔ)：40 年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA； 50 年代弄清楚DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機理；60 年代確定遺傳信息的遺傳方式。以密碼方式每三個核苷酸組成一個密碼子代表一個氨基酸。三大技術(shù)基礎(chǔ)：限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

2、；DNA 連接酶的發(fā)現(xiàn)；載體的發(fā)現(xiàn)3、 基因工程的技術(shù)路線：切： DNA 片段的獲得；接：DNA 片段與載體的連接；轉(zhuǎn)：外源DNA 片段進(jìn)出受體細(xì)胞；選：選擇基因；表達(dá)：目的基因的表達(dá)；基因工程的工具酶1、限制性內(nèi)切酶(restriction enzymes) ：主要是從原核生物中分離純化出來的，是一類能識別雙鏈DNA 分子中某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA 雙鏈的核酸內(nèi)切酶。2、限制酶的命名：屬名(斜體)+種名+株系+序數(shù)3、 II型限制性內(nèi)切酶識別特定序列并在特定位點切割4、同裂酶：來源不同，其識別位點與切割位點均相同的限制酶。5、 同尾酶 ：來源不同，識別的靶序列不同，但產(chǎn)生相同的黏

3、性末端的酶形成的新位點不能被原來的酶識別。6、限制性內(nèi)切酶的活性：在適當(dāng)反應(yīng)條件下，1小時內(nèi)完全酶解1ug特定的DNA底物，所需要的限制性內(nèi)切酶的量為1個酶活力單位。7、星號活性：改變反應(yīng)條件，導(dǎo)致限制酶的專一性和酶活力的改變。8、 DNA連接酶的特點：具有雙鏈特異性，不能連接兩條單鏈DNA分子或閉合單鏈 DNA， 連接反應(yīng)是吸能反應(yīng)，最適反應(yīng)溫度是4至 15度，最常用的是T4連接酶。9、 S1核酸酶：特異性降解單鏈DNA或 RNA。10、 RNAH降解與 DNA雜交的 RNA，用于cDNA文庫建立時除去RNA以進(jìn)行第二鏈的合成。11、 DNA 聚合酶：(1)、 DNA聚合酶I： 53外切酶活

4、性、35外切酶活性，53聚合酶活性， 用途 ：除去3端突起。補齊5端突起。合成cDNA第二鏈。切口移位探針的制備。(2)、 Klenow大片段：沒有53外切酶活性，而保留了53DNA聚合酶活性和35外切酶活性。用途 : 用同位素標(biāo)記具5端突起的DNA片段末端。補平 5粘性末端。DNA序列測定。合成cDNA第二鏈。(3)、 Taq酶：75度為最適反應(yīng)溫度，95度仍具有穩(wěn)定性，不具有外切酶活性，主要用于PCR。12、 主要修飾酶：(1) 堿性磷酸酶：除去核酸分子3和5端的磷酸基團。(2)T4 多聚核苷酸磷酸激酶：催化ATP中的 位的磷酸基轉(zhuǎn)移5-OH上(3) 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：在3端高效添加脫

5、氧核苷酸。分子克隆載體1、分子克隆載體：是一類可供外源DNA片段插入并攜帶重組分子進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴增或表達(dá)的DNA分子。2、分子克隆載體的功能：( 1)為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力( 2)為外源基因提供在受體細(xì)胞中復(fù)制或整合的能力( 3)為外源基因提供在受體細(xì)胞中擴增和表達(dá)的能力3、載體的分類 ：(1) 按用途分：克隆載體、表達(dá)載體、整合載體(2) 按來源分：原核生物載體：質(zhì)粒載體、 噬菌體載體、M13噬菌體載體、cosmid載體、phagemid載體；真核病毒載體4、 載體的特點：( 1)至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一個生物體中自主復(fù)制（ 2）至少有一個克隆位點，可供外源DNA

6、插入（ 3）至少有一個標(biāo)記基因，以知識載體或重組DNA分子是否進(jìn)入受體細(xì)胞（ 4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)5、標(biāo)記基因的作用：外源基因是否插入載體分子形成重組子；外源載體是否進(jìn)入宿主細(xì)胞6、 標(biāo)記基因的種類：抗性標(biāo)記基因；營養(yǎng)標(biāo)記基因；生化標(biāo)記基因；噬菌斑7、常用的遺傳標(biāo)記基因：四環(huán)素抗性基因（Tc） ；氨芐青霉素抗性基因（Ap） ；氯霉素抗性基因（ Cm） ； 卡那霉素 （ Kan） ； 新霉素（ Neo） ； 半乳糖甘酶基因（ LacZ）；葡萄糖苷酸酶基因（Gus） ；熒光素酶基因；發(fā)光蛋白質(zhì)基因。8、按復(fù)制起點劃分克隆載體：1）質(zhì)粒復(fù)制型復(fù)制起點來自質(zhì)?；蚓€粒體和葉綠體（有低拷貝和

7、高拷貝）2） ARS復(fù)制型染色體復(fù)制型（一般拷貝數(shù)比較高）3）病毒復(fù)制型復(fù)制起點來自病毒，若為RNA必須反轉(zhuǎn)錄為cDNA（高拷貝）4）混合復(fù)制型：不同種生物復(fù)制起點混合（穿梭載體）9、根據(jù)載體的分子生物學(xué)特性劃分：質(zhì)粒載體、病毒型載體、混合型載體10、根據(jù)載體功能分類 ：1）普通型載體：至少有一個以上的克隆位點和兩個標(biāo)記基因。如PBR322和 pUC載體2）表達(dá)型載體：3類：型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+終止子；型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子；型 : 轉(zhuǎn)錄起始區(qū)+ 翻譯起始區(qū)+ 信號肽鏈編碼區(qū)+ 終止子 （常稱之為表達(dá)分泌型載體）3） 失控型質(zhì)粒載體（R

8、un-away plasmid vector）：是一些低拷貝質(zhì)粒，其復(fù)制控制是溫度敏感型或藥物敏感型，在不同溫度或不同藥物濃度下，質(zhì)?？截悢?shù)會顯著變化。4）探針型載體：該類載體主要特點是含有一些特殊的DNA序列，用于特定的研究目的，如分離基因啟動子、終止子、DNA復(fù)制起點等。5）定序型載體：主要用于核苷酸的序列測定6）整合型載體：主要用于基因治療，穩(wěn)定表達(dá)外源基因。9、標(biāo)記基因與拷貝的關(guān)系：若標(biāo)記基因的表達(dá)效率較高，宿主細(xì)胞可能不大量表達(dá)標(biāo)記基因以滿足選擇壓力的要求，因而載體的拷貝數(shù)會降低，可采取相應(yīng)方法提高拷貝數(shù)。如：對于藥物抗性標(biāo)記基因，可提高藥物的濃度。對于營養(yǎng)標(biāo)記基因，可降低該基因的表

9、達(dá)效率。大腸桿菌分子克隆載體1、 E.coli克隆載體的種類1 ）質(zhì)粒載體 復(fù)制起點來自一些天然質(zhì)粒。2 ）噬菌體載體 ， P1和 M13、 fd載體，復(fù)制起點來自噬菌體。3 ） COS質(zhì)粒載體 質(zhì)粒載體中插入 cos片段，以利于體外包裝4 ）噬粒載體（phagemid） 有質(zhì)粒和 M13、 fd 的復(fù)制起點，以質(zhì)?；蚴删w方式復(fù)制。2、質(zhì)粒的特點：1）質(zhì)粒DNA的復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)2）質(zhì)粒DNA以超螺旋形式存在3）質(zhì)粒DNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)移4）質(zhì)粒的不相容性和不相容群5）質(zhì)粒DNA的消除6）質(zhì)粒的整合3、大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制：以RNA為引物合成，RNA與 RNA結(jié)合可減少質(zhì)粒的拷貝數(shù)，使 RNA

10、復(fù)制起點上游一個核苷酸處G突變?yōu)門， 使得拷貝數(shù)增多。4、質(zhì)粒的不親和性：在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。主要是由于他們在復(fù)制功能之間的相互干擾造成。5、 噬菌體的結(jié)構(gòu)特點：線性雙鏈DNA病毒，具有末端互補的12個核苷酸，感染細(xì)菌后粘端互補成雙鏈環(huán)狀。全長48.5kb。6、熱誘導(dǎo)表達(dá)： cl ts857 ，可作為組件插入質(zhì)粒DNA 內(nèi)。目的基因插在 clts857 下游，重組體的目的基因在42 表達(dá)，30 不表達(dá)。7、 噬菌體載體的缺點：基因組太大；酶切點太多；野生型只能接納一定長度的 DNA。8、 噬菌體載體的改造：切去非必須片段，加

11、載目的基因去掉太多的酶切位點增加標(biāo)記基因9、 COS質(zhì)粒載體的特點：在普通質(zhì)粒載體中插入一個或兩個來自 的 cos位點片段，雙 cos載體比單cos載體易于重組。10、 COS質(zhì)粒載體的優(yōu)點：容量大，用于基因簇的克??；形成的重組DNA分子可進(jìn)行體外包裝，并能感染大腸桿菌細(xì)胞；操作簡單，易于轉(zhuǎn)化細(xì)胞；對重組DNA分子長度具有選擇性包裝。11、噬粒載體( phagemid) ： 在質(zhì)粒載體中插入一段M13或 fd的復(fù)制起點，其插入方向決定在噬菌體顆粒中形成正鏈還是負(fù)鏈?；虿僮鞯闹饕夹g(shù)原理1、核酸分離提取的原則：保證核算的一級結(jié)構(gòu)的完整性；排除其他分子的污染2、質(zhì)粒載體分離的關(guān)鍵：如何使質(zhì)粒與D

12、NA與宿主染色體DNA分開依據(jù)： 質(zhì)粒DNA比染色體DNA小得多，在 DNA提取過程中，染色體斷裂成片段，而質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型3、變性法提取質(zhì)粒DNA的原理：在變性條件(堿性或高溫)下，線狀染色體DNA變性成為單鏈而完全分開，而cccDNA雖然互補鏈之間的氫鍵斷裂，但雙螺旋主鏈骨架仍彼此纏繞在一起。當(dāng)變性條件恢復(fù)時，質(zhì)粒DNA迅速復(fù)性恢復(fù)天然構(gòu)型，染色體DNA難以復(fù)性，交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)和RNA纏繞在一起，通過離心沉淀下來，而質(zhì)粒DNA存在于上清液中。4、 RNA分離純化的關(guān)鍵：防止內(nèi)外源RNase的作用5、 RNase的特點：抗酸抗堿；抗高溫嚴(yán)寒；抗變性劑，酶活性

13、不需要輔助因子，存在范圍廣。因此操作時要進(jìn)行高溫滅菌或用焦碳酸二乙酯處理或強蛋白質(zhì)變性劑等。6、核酸的濃縮：沉淀法：可以除去溶液中某些可溶的鹽離子和雜質(zhì)。7、核酸凝膠電泳的基本原理：核酸分子中的磷酸基團帶負(fù)電荷，在電場中將向正極移動，通過凝膠的分子篩作用可以將不同大小和構(gòu)型的核酸分子分離，分子量小的 DNA，具有較緊密的構(gòu)型，在凝膠中移動快；反之，分子量大的DNA移動慢。8、核酸凝膠電泳常使用溴酚藍(lán)作為指示劑、溴化乙錠作為染色劑9、脈沖場凝膠電泳原理：加在凝膠上至少有兩個電場方向，使得DNA分子要不斷地調(diào)整泳動方向，不同分子量大小的DNA分子用于改變泳動方向的時間不同，則可以得到分離10、 雙

14、脫氧核苷酸終止法的原理 ： 雙脫氧（ 2' ， 3' ） -核苷酸可以象2'- 脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因 3端不具 OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列11、 雙脫氧核苷酸終止法的過程： 制備單鏈DNA， 與引物退火，分為4個反應(yīng)體系，每個體系中加入dNTP和一種雙脫氧核苷酸，DNA聚合酶定序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物變性后電泳，凝膠干燥，放射自顯影，根據(jù)條帶讀出堿基序列，再根據(jù)堿基互補配對原則寫出DNA鏈的序列。（注意： 要自己寫一個序列，然后寫上每個體系中出現(xiàn)片段的序列

15、，然后根據(jù)序列畫出電泳圖，考試考的可能性大，書上有步驟）12、 Maxam-Gilbert化學(xué)法 原理 ： DNA鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應(yīng)， 在堿性環(huán)境下硫酸二甲酯能使堿基G發(fā)生甲基化，在酸性環(huán)境下哌啶甲酸使A和 G脫嘌呤，堿性環(huán)境下肼使C和 T發(fā)生開環(huán)，在高鹽濃度下肼只使C開環(huán)。然后發(fā)生 12 個堿基的脫落或取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的DNA分子經(jīng)凝膠電泳就可確定其核苷酸序列13、 化學(xué)法測序的優(yōu)點、不需要模板、引物和DNA聚合酶。14、 Southern 雜交（ Southern blot ） ： 用一種或多種限制性內(nèi)切酶對基因組DNA加以切割，通過瓊脂糖凝膠電泳分離

16、酶切片段，隨后，使DNA在原位變性，并從凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜，用已知核苷酸片段加以標(biāo)記作為探針，通過分子雜交來檢測待測樣品中是否存在互補的核酸序列。Southern 雜交的一般步驟：DNA的制備DNA酶切電泳（瓊脂糖凝膠電泳） DNA原位轉(zhuǎn)膜探針雜交放射自顯影結(jié)果分析15、 Northern 雜交檢測的是RNA。步驟與southern 類似，不需要酶切。16、 Western雜交：雜交的對象是蛋白質(zhì) ， 先將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE中轉(zhuǎn)移到一固相支持物上，通過與附著于固相支持物上的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原抗體特異反應(yīng)進(jìn)行檢測。主要用于基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的檢測。Western 雜交的一般步驟：蛋白質(zhì)制備S

17、DS-PAG電轉(zhuǎn)移至膜上一抗的制 E備一抗與膜結(jié)合（ 1h）洗膜（30min）二抗與膜的結(jié)合洗膜顯色反應(yīng)結(jié)果分析17、 PCR反應(yīng)體系：模板、引物、dNTP、 buffer 、 taq酶、超純水。18、引物設(shè)計的一般原則：引物的長度常為17至 30個堿基；GC含量為40%至 60%；Tm值高于55；兩條引物之間配對堿基數(shù)小于5；引物自身配對的堿基數(shù)小于3?；蛭膸斓慕?、基因組文庫：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。2、建立基因組文庫的一般程序:1）載體DNA片段的制備：DNA分離，限制酶切割，脫磷酸化反應(yīng)2） 供體DNA片段的制備：總 DNA純化，再進(jìn)行機械或酶切割成特定

18、大小的DNA片段。3） 供體和載體DNA的連接: 要注意混合的比率和濃度4） 重組DNA分子的轉(zhuǎn)移和基因組文庫的擴增5） 基因組文庫質(zhì)量的評價：文庫規(guī)模、重組頻率3、利用 載體構(gòu)建基因組文庫:1）載體DNA片段的制備的方法：左右臂DNA片段的獲得2） 供體DNA片段的制備：限制酶部分酶切，機械剪切法3） 重組DNA分子的形成：控制混合的比率4） 重組DNA分子的包裝：制備包裝物，然后進(jìn)行包裝5） 基因組文庫的擴增4、為提高文庫的質(zhì)量，采取以下措施:1）雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避免其自身形成串狀體2）供體DNA脫磷酸化以避免供體DNA間的連接導(dǎo)致重排3）載體和供體DNA末端修飾以避免上述兩種情形

19、發(fā)生: 載體補CT，供體補GA4）采用文庫快速構(gòu)建法以避免擴增文庫時DNA丟失5、 基因組文庫的載體可載入DNA大小：1）質(zhì)粒最大15kb 適合構(gòu)建 cDNA文庫；亞克隆2）噬菌體最大25kb cDNA 文庫3） COS質(zhì)粒30-45kb 基因組文庫4）噬粒最大 12kb cDNA 文庫5） P170-90kb基因組文庫6） BAC 100-500kb基因組文庫7） YAC 250-1000kb 基因組文庫6、鳥槍法克隆目的基因：隨機克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離。7、

20、鳥槍法克隆基因的步驟：染色體DNA的切斷；與載體連接；轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞；篩選含有目的基因的目的重組子。8、鳥槍法的改進(jìn): 目的基因的酶切圖譜已知；在連接前將DNA片段進(jìn)行分級分離9、鳥槍法克隆基因的局限性：工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)果10、 cDNA文庫：從一定生長階段或條件的某種細(xì)胞分離到的全部mRN經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成 AcDNA后再重組和增值所產(chǎn)生的無性繁殖系的總和。11、 cDNA文庫的特點：基因特異性；器官特異性；代謝或發(fā)育特異性；不均勻性；cDNA均可獲得表達(dá)12、建立cDNA文庫的一般程序1）載體DNA片段的制備2）多聚（

21、A） RNA的分離制備3）雙鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法合成單鏈cDNA，堿解或酶解除去RNA合成第二鏈4） ds-cDNA與載體DNA相連：人工接頭、同聚物加尾、cDNA的定向插入5）重組cDNA分子的轉(zhuǎn)移和文庫的建立: 質(zhì)粒載體則轉(zhuǎn)化大腸桿菌、噬粒則包裝感染13、第二鏈合成的方法：自身引導(dǎo)法、置換合成法、引導(dǎo)合成法。前兩者5端會有幾個堿基缺失。目的基因的分離和鑒定1、獲得基因的一般方法：1）化學(xué)合成法: 主要用于較小基因的合成或需要改變堿基2） 半化學(xué)合成法：mRNA cDNA 加人工接頭或合成一段DNA 與載體相連、3） 篩選法：用各種方法從基因文庫或cDNA文庫中選擇目的基因2、基因篩選

22、的方法:1）遺傳互補法原理：當(dāng)一外源DNA片段引入一受體細(xì)胞后，如果受體細(xì)胞獲得某種新的性狀，那么此片段上攜帶著決定新性狀的遺傳基因。營養(yǎng)缺陷型受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入外源DNA片段之后，涂布在合成培養(yǎng)基上可以生長；無某種表型的細(xì)胞會有新性狀；某些產(chǎn)酶細(xì)胞則可能過量產(chǎn)酶。釀酒酵母MF基因的篩選：基因組文庫DNA 轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞在缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)能生長的重組子即含合成亮氨酸的基因2） 核酸雜交法原理：利用核酸探針與待分離DNA的同源序列可進(jìn)行雜交的特點分離目的基因。分離步驟：基因（基因組或cDNA）文庫制備DNA樣品膜與標(biāo)記探針雜交雜交斑點 （陽性克?。?分離重組 DNA分子作斑點雜交陽性克隆So

23、uthern雜交以確認(rèn)雜交結(jié)果DNA進(jìn)一步證實和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)比較；分離插入片段進(jìn)行基因表達(dá)，用免疫方法或其他方法檢測表達(dá)產(chǎn)物。3） 免疫法 原理 : 外源DNA引入宿主細(xì)胞后表達(dá)出蛋白質(zhì)，以此蛋白質(zhì)為抗原與相應(yīng)抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，然后利用二抗與一抗反應(yīng)，用二抗偶聯(lián)的酶反應(yīng)篩選目的基因。分離步驟: 基因文庫 蛋白質(zhì)樣品膜制備免疫法篩選有色斑點 （陽性克?。?進(jìn)一步證實：分離陽性克隆無細(xì)胞抽提物，作斑點印跡，western印跡免疫分析；分離重組DNA，檢測插入片段大小，測序等。4）染色體巡查法5）蛋白質(zhì)-DNA雜交法6）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合法，即酵母雙雜交法原理： 利用釀酒酵母

24、的GAL4蛋白質(zhì) N端和C端分別融合的兩種蛋白質(zhì)相互作用可激活具有UAS（上游激活序列）報告基因表達(dá)篩選目的基因的方法。GAL4蛋白質(zhì)基因是一個調(diào)控基因，控制半乳糖利用酶類基因的表達(dá)，其5端存在 UASGAL4存在兩個結(jié)構(gòu)域：N端具有 UAS-DNA結(jié)合域（BD） ， C端具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（ AD） ，這兩個結(jié)構(gòu)域可以單獨起作用。如果 AD和 BD分別與兩個基因編碼序列融合，且兩種蛋白質(zhì)能相互作用，就可導(dǎo)致 GAL-LacZ 基因的表達(dá)。與BD融合的基因稱為釣餌基因，與AD融合的基因稱為目的基因。3、用于基因分離和鑒定的輔助方法：抑制消減雜交法；差別雜交法；阻斷翻譯法；釋放翻譯雜交法植物基因

25、工程1、植物組織培養(yǎng)技術(shù)：愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體、植株再生2、植物基因轉(zhuǎn)移方法：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、原生質(zhì)體法、電擊法、顯微注射法3、植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因：選擇標(biāo)記基因（ kan、 Hyg、 Bar） 、 報告基因 （ Bt、 Gus、GFP） 、啟動子（CaMVA）4、 Ti質(zhì)粒有 六個功能區(qū)：1）致瘤區(qū)：合成植物生長素和細(xì)胞分裂素2）冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭堿合成3）冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解4） Ti 質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)（tra） ：參與在不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移5）毒性區(qū)（Vir） ：直接參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體6） DNA復(fù)制區(qū)（Rep） ：參與 Ti 質(zhì)粒DNA復(fù)

26、制5、將致瘤區(qū)替換成目的基因即可取出冠癭6、根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一般步驟：葉盤法：從植物葉片上用打孔器取若干葉片制備含有目的基因的 Ti 質(zhì)粒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌置于含農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基24小時將葉片轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生根移栽7、轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中的應(yīng)用：抗蟲、抗病毒、抗真菌、抗除草劑、抗逆、改良作物品種8、轉(zhuǎn)基因植物的問題：轉(zhuǎn)基因沉默：位置效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默、轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。選擇基因安全性問題；對生態(tài)環(huán)境的影響動物基因工程1、從遺傳學(xué)角度劃分：遺傳性動物基因工程、非遺傳性動物基因工程2、動物基因工程載體具備的功能：1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力2）為外源基因提供在受

27、體細(xì)胞中復(fù)制或整合的能力3）為外源基因提供在受體細(xì)胞中擴增和表達(dá)的能力3、動物基因工程載體：質(zhì)粒型載體、病毒型載體、定向打靶載體（基因敲入基因敲除、基因下調(diào)）4、 哺乳動物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記：遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機理APH-氨基糖苷磷酸 轉(zhuǎn)移酶G418APH滅活 G418DHFR二氫葉酸還原 酶氨甲喋呤DHFR突變體抗 氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶潮霉素BHPH 滅 活 潮 霉 素BTK-胸腺嘧啶核苷 激酶氨基喋呤TK合成 TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤 磷酸核糖轉(zhuǎn)移 酶霉酚酸XGPRT 合 成GMPADA-腺嘌呤核苷脫 氨酶腺嘌呤木酮 糖苷ADA滅活 Xyl-A5、基因

28、轉(zhuǎn)移技術(shù)：1）物理轉(zhuǎn)染法：電擊法、顯微注射法、基因槍法、超聲波法2）化學(xué)轉(zhuǎn)染法：磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、原生質(zhì)體法3）生物法：病毒感染法6、轉(zhuǎn)基因動物制備程序：1） DNA顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠：基因制備促排卵結(jié)扎、假孕鼠取受精卵顯微注射DNA胚胎移植基因分型分析2）胚胎干細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動物過程：轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞的獲得胚囊注射嵌合體的檢測和育種3）轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物7、轉(zhuǎn)基因的鑒定：1）標(biāo)記選擇法：正負(fù)選擇標(biāo)記篩選法、無啟動子篩選法2）分子鑒定法：PCR擴增、斑點雜交、Southern 雜交、熒光原位雜交8、表達(dá)水平的檢測：報告基因、Northern 雜交、反轉(zhuǎn)錄PCR、聚丙烯酰胺凝膠電泳、 Western 雜交、目的蛋白