細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶介導(dǎo)的脂蛋白（a）促血管平滑肌細(xì)胞遷移作用

1、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶介導(dǎo)的脂蛋白（a）促血管平滑肌細(xì)胞遷移作用                        【摘要】 目的： 研究細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)在脂蛋白(a)Lp(a)誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)遷移及細(xì)胞骨架構(gòu)建中的作用。方法： 用不同濃度的ERK激酶抑制劑

2、PD98059抑制人VSMC內(nèi)ERK的活化，再用Lp(a)誘導(dǎo)處理后的細(xì)胞，Western blot檢測P-ERK的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架構(gòu)建變化，遷移試驗(yàn)觀察VSMC遷移數(shù)量的變化。結(jié)果： Western blot檢測顯示PD98059的終濃度在10 mol/L時(shí)，P-ERK表達(dá)無明顯變化（P>0.05），從2040 mol/L，隨其終濃度的逐漸升高，P-ERK的表達(dá)逐漸降低（P<0.01），達(dá)到40 mol/L后，其抑制作用達(dá)到高峰。PD98059預(yù)處理人VSMC，Lp(a)誘導(dǎo)20 min后，細(xì)胞內(nèi)未見明顯的張力纖維、粘著斑及絲狀偽足。對(duì)照組VSMC遷移細(xì)胞數(shù)為(

3、78.87±7.43)個(gè)，PD98059處理組為(49.20±6.47)個(gè)， PD98059處理組較正常對(duì)照組明顯減少（P<0.01）。結(jié)論： Lp(a)誘導(dǎo)的VSMC細(xì)胞骨架構(gòu)建及細(xì)胞遷移依賴于ERK的活化。 【關(guān)鍵詞】 脂蛋白(A)； 平滑肌細(xì)胞； 血管； 蛋白激酶類； 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 Abstract Objective: To study the effect of extracellular regulated protein kinases (ERK) in cytoskeleton reorganization and migration of hu

4、man vascular smooth muscle cells (VSMCs) stimulated by lipoprotein a Lp(a). Methods: The VSMCs treated with different concentrations of ERK kinase inhibitor PD98059 were, then, stimulated by Lp(a) for 20 minutes. The expression of protein ERK (P-ERK ) in VSMCs was detected with Western blotting. The

5、 cytoskeletons of these VSMCs were observed with confocal laser scanning microscope, and the number of cells migrated was determined with migration assays. Results: No change of P-ERK expression was detected in VSMCs when treated by PD98059 with the final concentration of 10 mol/L（P>0.05）. Within

6、 the range of final PD98059 concentrations of 20 mol/L to 40 mol/L, the P-ERK expression in treated VSMCc decreased along with the increasing of the PD98059 concentrations（P<0.01）, and the inhibitory peak was at 40 mol/L of PD98059 group. No filopodia, stress fibers or focal adhesions was found i

7、n DD98059 treated VSMCs.The average number of migrating cells in VSMCs of PD98059 treated groups (49.20±6.47) was smaller than that of control group (78.87±7.43) significantly（P<0.01）. Conclusion: Lp(a) stimulated cytoskeleton reorganization and cell migration in VSMCs is dependent on t

8、he activation of ERK. Key words lipoprotein(a)； smooth muscle cells; blood vessels; protein kinases; extracellular regulated protein kinases 目前已知血漿脂蛋白(a)Lp(a)濃度的升高是各種動(dòng)脈硬化性疾病的危險(xiǎn)因素，Lp(a)不僅與其發(fā)病有關(guān)，還與其嚴(yán)重程度、術(shù)后血管再狹窄及閉塞有很大的相關(guān)性。Lp(a)的血漿濃度對(duì)生活方式改變和藥物的調(diào)控不敏感，故目前對(duì)Lp(a)致病機(jī)制的研究已成為研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Lp(a)可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的遷移，

9、但其具體機(jī)制仍不明確。用ERK激酶抑制劑PD98059抑制人VSMC內(nèi)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)活化，探討ERK在Lp(a)促VSMC遷移中的作用。 1 材料與方法 1.1 材料 Lp(a)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Phalloidin，鼠抗人平滑肌-肌動(dòng)蛋白（-actin）單克隆抗體，DAPI購自美國Sigma公司；免疫組織化學(xué)染色（SABC）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Costar TranswellTM培養(yǎng)板購自美國Corning公司；兔抗人ERK抗體、兔抗人P-ERK抗體購自美國Cell Signali

10、ng Technology公司；PD98059購自Calbiochem公司。                              1.2 方法 1.2.1 人臍動(dòng)脈VSMC的原代培養(yǎng)、純化、傳代及鑒定 取剖宮產(chǎn)胎兒的新鮮臍帶，分離出臍動(dòng)脈，剝除臍動(dòng)脈外膜，刮去內(nèi)膜，將動(dòng)脈中膜剪成約1 mm×1 mm&#

11、215;1 mm的組織塊進(jìn)行培養(yǎng)。傳代過程中采用差速貼壁法進(jìn)一步純化細(xì)胞，第510代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)1。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。SABC法檢測VSMC胞漿內(nèi)的-actin。 1.2.2 抑制劑阻斷Lp(a)誘導(dǎo)的ERK活化 1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取第510代細(xì)胞，用不含或含Lp(a)即為1、2組，Lp(a)終濃度為320 mg/L培養(yǎng)液誘導(dǎo)6 h；用含PD98059（終濃度分別為10、20、30、40及50 mol/L，依次為37組）的培養(yǎng)液預(yù)處理1 h后，再用含Lp(a)(終濃度為320 mg/L)培養(yǎng)液誘導(dǎo)6 h。 1.2.2.2 Westernblot印記檢測ERK

12、及P-ERK蛋白表達(dá) 0.25 %胰酶消化收集上述處理好的細(xì)胞后提取總蛋白并用BCA檢測法進(jìn)行蛋白濃度的測定。將蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜，用5脫脂奶粉TBST液浸泡過夜，以封閉PVDF膜。按說明書與一抗及二抗結(jié)合后行ECL發(fā)光檢測，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，用Totallab軟件分析。 1.2.3 抑制劑阻斷ERK的活化后Lp(a)誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架的標(biāo)記及觀察 實(shí)驗(yàn)分2組，分別為對(duì)照組及PD98059處理組，向馴化至同一代謝水平的VSMC加入不含或含PD98059（終濃度為40 mol/L）培養(yǎng)液孵育1 h后，予Lp(a)誘導(dǎo)20 min，免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞骨架，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架構(gòu)建。 1.2.4 抑制劑

13、阻斷ERK的活化后Lp(a)誘導(dǎo)的VSMC遷移試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分2組，分別為對(duì)照組及PD98059處理組，ERK抑制劑預(yù)處理人血管平滑肌細(xì)胞后予Lp(a)誘導(dǎo)，Transwell小室檢測VSMC遷移。細(xì)胞以DAPI染色30 min，每組隨機(jī)取5個(gè)視野，200倍視野免疫熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，取平均值。上述遷移實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS10.0軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來顯示，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較用t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 平滑肌細(xì)胞的鑒定 倒置相差顯微鏡觀察可見平滑肌細(xì)胞呈長梭形，呈現(xiàn)典型的“波峰”

14、與“浪谷”狀。免疫組織化學(xué)進(jìn)行平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志物-actin染色，可見細(xì)胞胞漿呈棕黃色, 胞核呈淡藍(lán)色，證明培養(yǎng)的細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞。 2.2 抑制劑對(duì)Lp(a)誘導(dǎo)的P-ERK蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測顯示各組VSMC內(nèi)的ERK蛋白表達(dá)量之間無明顯差異（P>0.05），故以ERK的蛋白表達(dá)量作為內(nèi)參照。第2組較第1組P-ERK/ERK比值明顯升高（P<0.01）；除第2組與第3組之間和第6組與第7組之間的P-ERK/ERK比值無明顯差異（P>0.05）外，其余36組P-ERK/ERK比值兩兩之間均有顯著性差異（P<0.01）。見圖1。 2.3 抑制劑

15、阻斷ERK的活化后Lp(a)誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架構(gòu)建狀況 PD98059處理組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)未見明顯的張力纖維、絲狀偽足（圖2及圖3）以及粘著斑形成（圖4及圖5）。注：(1)：與前1組相比，P<0.01；(2)：與前1組相比，P>0.05 2.4 抑制劑阻斷ERK的活化后Lp(a)誘導(dǎo)的VSMC遷移 VSMC遷移試驗(yàn)顯示，正常對(duì)照組VSMC遷移細(xì)胞數(shù)為（78.87±7.43）個(gè)，PD98059處理組為（49.20±6.47）個(gè)， PD98059處理組較正常對(duì)照組明顯減少（P<0.01）。 3 討論 Lp(a)是1963年由挪威遺傳學(xué)家Berg2首先從血漿中

16、分離出來并命名的。此后經(jīng)一系列研究證明人Lp(a)與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的各類疾病有密切關(guān)系，是動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈再狹窄、卒中、冠心病及心肌梗死發(fā)生的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素，并與其它血脂水平無相關(guān)性，是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素3。血液中Lp(a)的濃度是一個(gè)穩(wěn)定的遺傳標(biāo)志，不受性別、年齡、飲食、理化因素及多種降脂藥物影響。Lp(a)的致動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制有以下幾個(gè)方面：Lp(a)能破壞受體介導(dǎo)的血管內(nèi)皮舒張功能，導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)；Lp(a)可能通過清道夫受體途徑、LDL受體途徑及非受體途徑等穿過血管內(nèi)皮，參與泡沫細(xì)胞形成；Lp(a)和純化的Apo(a)可促進(jìn)VSMC遷移和增值；Lp(a)有促血栓形成作用。一

17、系列研究證實(shí)了VSMC從中層向內(nèi)膜的遷移是動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄共同的病理基礎(chǔ)4。但Lp(a)促VSMC遷移的機(jī)制目前仍不明確。                              細(xì)胞骨架是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)由蛋白質(zhì)組成的三維網(wǎng)架狀結(jié)構(gòu), 分為微管、微絲、中等纖維和微梁網(wǎng)格等，是參與介導(dǎo)細(xì)胞變形、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞遷移等重

18、要活動(dòng)的蛋白質(zhì)體系5。該體系由肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白組成。其中肌動(dòng)蛋白是最豐富的蛋白，是構(gòu)成微絲的基本成分，故微絲又稱為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架系統(tǒng)，其基本結(jié)構(gòu)單位是纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)。張力纖維及絲狀偽足即是顯微鏡下的F-actin呈現(xiàn)出的形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中采用免疫熒光標(biāo)記F-actin來觀察這些結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。 ERK包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2，主要被各種生長因子、離子射線、過氧化氫、血清及佛波酯等外界刺激而激活。ERK1/2是由Boulton等6，7于上世紀(jì)90年代初期分離鑒定的，相對(duì)分子量分別為44 kD和42 kD，它們有90的同源性。ERK1/2的活化是將

19、信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至核的關(guān)鍵，ERK1/2信號(hào)通路(RasRafMEK1/2ERK1/2)是經(jīng)典的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是由1個(gè)小GTP蛋白連接活化的受體酪氨酸激酶和胞漿蛋白組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。平時(shí)ERK1/2位于胞漿內(nèi)，一旦被激活，ERK1/2迅速穿過核膜，活化的ERK1/2可磷酸化多種核轉(zhuǎn)錄因子如Elk-1、Ets-1、c-Myc、Sapla、Tal、STAT、Fos 、ATF2、Max、c-jun及ATF2等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能，影響細(xì)胞產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)8。有研究表明，氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)誘導(dǎo)

20、的VSMC增殖作用可能與調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體，啟動(dòng)RasRaf MEK1/2ERK1/2通路有關(guān)。Yang等9，10等研究發(fā)現(xiàn)，Ox-LDL在導(dǎo)致培養(yǎng)VSMC增殖的同時(shí)，伴隨MAPK的活化，并可誘導(dǎo)ERK1/2的活化，同時(shí)ERK1/2的特異阻斷劑U0126可完全抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC的增殖。Ox-LDL對(duì)ERK1/2活性的影響，提示Ox-LDL誘導(dǎo)VSMC的增殖極有可能是通過活化ERK1/2這一信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。Hu等11研究發(fā)現(xiàn)，球囊損傷后早期血管組織ERK1/2活性升高，同時(shí)伴有c-fos和c-jun的mRNA的升高；在損傷后714 d，內(nèi)膜的ERK1/2仍然升高，并且內(nèi)膜高于中膜，

21、提示ERK1/2活性和2種癌基因表達(dá)的增加可能參與了再狹窄過程。最近Fisher等12觀察到了ERK1/2反義寡核苷酸(ODNs)對(duì)VSMC增殖和(或)遷移的抑制作用，因而認(rèn)為在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)所誘導(dǎo)的VSMC遷移和增殖過程中，ERK1/2是發(fā)揮了重要作用的關(guān)鍵信號(hào)分子。PD98059是MEK的一種藥理學(xué)抑制劑，PD98059通過選擇性抑制MEK1/2的激酶活性，阻止Raf對(duì)ERK1/2的磷酸化和激活。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組的總ERK蛋白表達(dá)量之間無明顯差異（P>0.05），提示Lp(a)是通過ERK的磷酸化而不是使ERK的表達(dá)增加來發(fā)揮作用的。VSMC經(jīng)不同濃度的PD98059預(yù)處

22、理后，Western blot檢測顯示PD98059的終濃度在10 mol/L時(shí)對(duì)ERK激酶無明顯抑制作用，從20 mol/L開始，隨其終濃度的逐漸升高，其對(duì)ERK激酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)，但達(dá)到40 mol/L后，其抑制作用達(dá)到高峰，40 mol/L和50 mol/L對(duì)ERK激酶的抑制作用無明顯差異，這一結(jié)果與Dario等13的發(fā)現(xiàn)一致。PD98059的終濃度為40 mol/L時(shí)P-ERK的蛋白表達(dá)量減少了71.7%，顯示了PD98059對(duì)Lp(a)誘導(dǎo)的P-ERK蛋白的表達(dá)有顯著的抑制作用。 激光共聚焦顯微鏡觀察PD98059抑制ERK磷酸化后Lp(a)誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架構(gòu)建的變化，顯示Lp(a

23、)誘導(dǎo)VSMC 20 min后，細(xì)胞內(nèi)未見明顯的張力纖維、絲狀偽足以及粘著斑形成。說明P-ERK參與了Lp(a)所誘導(dǎo)的張力纖維、絲狀偽足以及粘著斑的形成，MAPK是Lp(a)誘導(dǎo)細(xì)胞骨架構(gòu)建的信號(hào)通路中的重要一環(huán)。VSMC遷移試驗(yàn)顯示抑制ERK的磷酸化可明顯抑制Lp(a)所誘導(dǎo)的VSMC遷移。但Lp(a)促VSMC遷移信號(hào)通路中的其它具體環(huán)節(jié)仍有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Shoji M, Sata M, Fukuda D, et al. Temporal and spatial characterization of cellular constituents during neoin

24、timal hyperplasia after vascular injury: Potential contribution of bone-marrow-derived progenitors to arterial remodelingJ. Cardiovasc Pathol, 2004(13):306-312.                        &

25、#160;    2 Berg k. A new serum type system in man: The Lp(a) lipoprotein systemJ. Acta pathol Microbiol Scand, 1963(59):369-382.3 Mary S, Ayrs S, Humphrie S, et al. Lipoprotein(a) as a predictor of myocardial infarction in middle-aged menJ.Am J Med,2001(1):22-27.4 Kaiura TL, Itoh

26、 H, Kubaska SM, et al. The effect of growth factors, cytokines, and extracellular matrix proteins on fibronectin production in human vascular smooth muscle cellsJ. J Vase Surg, 2000(31):577-584.5 Janmey PA. The cytoskeleton and cell signaling: component localization and me chanical couplingJ. Physio

27、l Rev, 1998(78):763-781.6 Boulton TG, Yancopeulos GD, Gregory JS, et a1. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle controlJ. Sciences, 1990(4964):64-67.7 Boulton TG, Nye SH, Robbins DJ, et a1. ERKs: a family of protein serine/ threo- nine kinases that are a

28、ctivated and tyrosine phosphorylated in response to insulin and NGFJ. Cell, 1991(4):663-675.8 Widmann C, Gibosn S, Jarpe MB, et a1. Mitogen-activated protein kinase: con- servation of a three-kinase module from yeast to humanJ. Physiol Rev, 1999(1):143-180.9 Yang CM, Chien CS, Hsial LD, et a1. Mitogenic effect of oxidized low density lipoprotein on vascular smooth muscle cells mediated by activatio