多肽合成技術(shù)資料講解

1、多肽合成技術(shù)精品資料多肽化學(xué)已經(jīng)走過了一百多年的光輝歷程，1902年，Emil Fischer首先開始關(guān)注 多肽合成，由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的知識(shí)太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢當(dāng)時(shí)合成采 用了苯甲酰，乙酰保護(hù)，脫去相當(dāng)困難，而且容易導(dǎo)致肽鏈斷裂。直到 1932 年，Max Bergmann等人開始使用甲氧染基（Z）來保護(hù)a-氨基，該保護(hù)基可以 在催化氫化或氫澳酸的條件下定量脫除，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。到 了 20世紀(jì)50年代，隨著越來越多的生物活性多肽的發(fā)現(xiàn)，大大推動(dòng)了有機(jī)化 學(xué)家們對(duì)多肽合成方法以及保護(hù)基的研究，因此這一階段的研究成果也非常豐 富，人們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素（ox

2、ytocin）,胰島素等，同 時(shí)在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績，這為后來的周相合成方法的出現(xiàn)也提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。也就是這個(gè)階段，F(xiàn)red Sange發(fā)明了氨基酸序列測(cè)定方法，并為此獲得了 1958年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。還是他后來發(fā) 明了 DNA序列檢測(cè)方法，并于1980年再次獲得了 Nobel化學(xué)獎(jiǎng)，成為到目前 為止唯一獲得兩次Nobel化學(xué)獎(jiǎng)的科學(xué)家。1963年，Merrfield提出了固相多肽 合成方法（SPPS）,這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出來， 就由于其合成方便，迅速，現(xiàn)在已經(jīng)成為多肽合成的首選方法，隨后的發(fā)展也 證明了該方法不僅僅是一種合成方

3、法，而且也帶來了有機(jī)合成上的一次革命， 并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科，固相有機(jī)合成（SPOS）。當(dāng)然，Merrifield也因此 榮獲了 1984年的Nobel化學(xué)獎(jiǎng)。也正是Merrifield ,他經(jīng)過了反復(fù)的篩選，最 終屏棄了甲氧城基（Z）在固相上的使用，首先將叔丁氧染基（BOC）用于保 護(hù)e氨基并在固相多肽合成上使用，其可以在酸性條件下定量的脫除，反應(yīng)也 非常迅速，在30min就可以反應(yīng)完全。由于叔丁氧族基（BOC）方法中，氨基 酸側(cè)鏈的保護(hù)基團(tuán)大多基于甲基（Bzl）,因此也稱為BOC-Bzl策略。同時(shí)， Merrifield在20世紀(jì)60年代末發(fā)明了第一臺(tái)全自動(dòng)多肽合成儀，并首次合成生 物蛋

4、白酶，核糖核酸酶（124個(gè)氨基酸）。隨后的多肽化學(xué)研究主要集中在固 相合成樹脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護(hù)基的研究。1972, Lou Carpino首先將9-方甲氧染基（FMOC）用于保護(hù)華氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，到了 20世紀(jì)80年代取代了叔丁氧染基（BOC）,成為了周相多肽合成中的首選合 成方法。該方法中氨基酸的側(cè)鏈大多基于叔丁基（But）,因此，也稱為FMOC-But策略。同時(shí)，在多肽合成樹脂，縮合試劑以及氨基酸保護(hù)，包括合 成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。進(jìn)入21世紀(jì)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究深入，對(duì)

5、于多肽化學(xué)的要求不僅僅是合成 方法，而更多的集中在多肽標(biāo)記與修飾方法，以及蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽的 合成以及長肽或蛋白合成。?多肽化學(xué)合成的基本介紹多肽化學(xué)合成方法，包括液相和固相兩種方法。液相合成方法現(xiàn)在主要采用 BOC和Z兩種保護(hù)方法，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成，如阿斯巴甜，力肽，催產(chǎn) 素等，其相對(duì)與固相合成，具有保護(hù)基選擇多，成本低廉，合成規(guī)模容易放大 的許多優(yōu)點(diǎn)。與周相合成比較，液相合成主要缺點(diǎn)是，合成范圍小，一般都集 中在10個(gè)氨基酸以內(nèi)的多肽合成，還有合成中需要對(duì)中間體進(jìn)行提純，時(shí)間 長，工作量大。固相合成方法現(xiàn)在主要采用 FMOC和BOC兩種方法，它具有 合成方便，迅速，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)

6、化，而且可以比較容易的合成到30個(gè)氨基酸左右多肽。1.1.氨基酸保護(hù)基20種常見氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸( Ala, Gly, Val, Leu, Ile,),芳香族氨基酸(Phe, Tyr, Trp, His),酰胺或竣基側(cè)鏈氨基酸 (Asp, Glu, Asn, Gln),堿性側(cè)鏈氨基酸(Lys, Arg),含硫氨基酸 (Cys, Met),含醇氨基酸(Ser, Thr),亞氨型基酸(Pro)。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵。因?yàn)槌Ｒ姷?0中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù)，一般要求，這些保護(hù)基 在合成過程中穩(wěn)定，無副反應(yīng)，

7、合成結(jié)束后可以完全定量的脫除。合成中需要 進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys, Asp, Glu, His, Lys, Asn, Gln, Arg , Ser, Thr, Trp, Tyr。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基，竣基，琉基，氨基，酰胺基，胴 基，呷咪，咪唾等。其中Trp也可以不保護(hù)，因?yàn)檫冗湫再|(zhì)比較穩(wěn)定。當(dāng)然在 特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護(hù)，象， Asn, Gln , Thr, Tyr。表1常見3種氨基脫除條件FMOCTFAHBr/TFAH2/Pd-CPiperidine/DMFBocyynnZnyynFmocnyny僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝5圖1常見3種氨基保護(hù)基結(jié)

8、構(gòu)氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)非常多，同一個(gè)側(cè)鏈有多種不同的保護(hù)基，可以在不同的 條件下選擇性的脫除，這點(diǎn)在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義。而且側(cè) 鏈保護(hù)基和選擇的合成方法有密切的關(guān)系，液相和固相不一樣，固相中 BOC和FMOC策略也不一樣，從某種意義上看，多肽化學(xué)就是氨基酸保護(hù)基的靈活運(yùn) 用與搭配。關(guān)于側(cè)鏈保護(hù)基的使用，請(qǐng)參考王德心的固相有機(jī)合成原理及應(yīng)用指南第四章，我們這里主要介紹 Cys, Lys, Asp的幾種保護(hù)基及其脫 除方法。Cys最常見的保護(hù)基有三種，Trt, Acm, Mob,這三個(gè)保護(hù)基可以完 成多對(duì)二硫鍵多肽的合成。Lys最常見的保護(hù)基有：Boc, Fmoc, Trt, Dde

9、, Allyl ,這對(duì)于周相合成環(huán)肽提供了很多正交的保護(hù)策略。Asp最常見的保護(hù)基有：Otbu, OBzl, OMe, OAll , OFm,同樣也提供了多種正交的保護(hù)策略。表2琉基常見保護(hù)基結(jié)構(gòu)脫除條件簡稱TrtAcmMobTFA HCl/HOAc I2/MeOHMeOH, Hg2+HF, TFMSA Hg2+表3氨基常見保護(hù)基-moc脫除條件TFA HOAc HCOOHHCl/HOAc TFA/DCMDdePip/DMF, NaOH/MeOHH2NNH2/DMFPd (Ph3P)4,嗎琳/THF表3竣基常見保護(hù)基精品資料簡稱，構(gòu).脫除條件Otbu3千TFA HOAc HCOOHOBzlA。

10、一器H2/Pd, HF, TFMSAOMe50 -CHNaOH/MeOHOAllIPd (Ph3P)4,嗎咻/THFOFm1名Pip/DMF, DBU/DMF1.2.多肽縮合試劑目前多肽合成中，主要采用竣基活化方法來完成接肽反應(yīng)，最早使用的是將氨 基酸活化為酰氯，疊氮，對(duì)稱酸酊以及混合酸酊的方法，但是由于這些條件 下，存在氨基酸消旋，以及反應(yīng)試劑危險(xiǎn)以及制備比較復(fù)雜，逐漸被后來的縮 合試劑取代，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，金翁鹽 型（Uronium）。121 .碳二亞胺型主要包括：DCC, DIC, EDC.HCl等。采用DCC進(jìn)行反應(yīng)，由于反應(yīng)中生成的 DCU,在DM

11、F中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中， 但是由于其價(jià)格便宜，在液相合成中，可以通過過濾除去，應(yīng)用仍然相當(dāng)廣泛。EDC.HCl因?yàn)槠渌芙庑缘奶攸c(diǎn)，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而 且也相當(dāng)成功。但是該類型的縮合試劑的一個(gè)最大的缺點(diǎn)，就是如果單獨(dú)使 用，會(huì)有比較多的副反應(yīng)，但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt, HOAt等試劑，可以將其副反應(yīng)控制在很低的范圍。其反應(yīng)機(jī)理如下：- 4鹵IH O-Acylisoureaor in 匚dsa of OAt:N-Acyiu晌uMesirdd 筌汨白 product not acti帕 tor couplingflcliv? o&#

12、171;lAr圖2 DIC活化反應(yīng)機(jī)理122 .金翁鹽型金翁鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高，速度快，現(xiàn)在使用非常廣泛，主要包括：HBTU, TBTU , HATU , PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機(jī)堿，如， 二異丙基乙胺（DIEA） , N-甲基嗎咻（NMM ），該試劑加入后，才能活化氨 基酸。其反應(yīng)機(jī)理如下：圖3 TBTU活化反應(yīng)機(jī)理13多肽合成方法比較僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除謝謝7精品資料1.3.1. 液相多肽合成（solution phase synthesis液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用，在合成短肽和多肽片段上具有合成規(guī)模 大，合成成本低的顯著優(yōu)點(diǎn)，而且由于是在均相

13、中進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇的反應(yīng) 條件更加豐富，象一些催化氨化，堿性水解等條件，都可以使用，這在固相 中，使用卻由于反應(yīng)效率低，以及副反應(yīng)等原因，無法應(yīng)用。液相多肽合成中 主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略。00加c=o I1 NaOH/MeOH2 HCIjUOAc圖4液相合成Glu-Trp1.3.2. 周相多肽合成Glu-Trp圖5 FMOC固相合成Glu-Trp周相多肽合成現(xiàn)在使用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種。BOC萬法合成過程中，需要反復(fù)使用TFA脫BOC,而且在最后從樹脂上切割下來需要使 用HF,由于HF必須使用專門的儀器進(jìn)行操作，而且切割過程中容易產(chǎn)生副反 應(yīng)，因此現(xiàn)在使用受到實(shí)驗(yàn)條

14、件限制，使用也逐漸減少。FMOC方法反應(yīng)條件溫和，在一般的實(shí)驗(yàn)條件下就可以進(jìn)行合成，因此，也得到了非常廣泛的應(yīng) 用。1.321. 周相合成中常用樹脂-二乙烯苯材料，大小在 75-150pm,交聯(lián)1%,因?yàn)檫@種交聯(lián)度下，樹脂在 DMF,周相合成中樹脂，一般都是聚苯乙烯 度在1-2%之間，現(xiàn)在使用的大多是DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個(gè)空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，反應(yīng)物分子可以在 樹脂內(nèi)部自由移動(dòng)。樹脂中最關(guān)鍵的部分是連接手臂，它一端連接在樹脂上， 一端作為反應(yīng)位點(diǎn)。目前廣泛使用的樹脂有：PAM, MBHA, Wang, 2-Cl-Trt, Rink-Amide-MBHA 等。其中PAM, MBHA是用

15、在BOC策略中，因?yàn)槠?對(duì)酸非常穩(wěn)定，需要在HF, TFMSA等強(qiáng)酸條件下才能夠切割下來。WfingPAM二 C LT rtRitik-Amidi圖6周相合成常用樹脂1.322. 西三酮檢測(cè)周相多肽合成中，主要是通過檢測(cè)樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測(cè)方法 稱為Kaiser方法，其檢測(cè)結(jié)果，如果有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色，或紅褐色(pro, ser, His)。Kaiser試劑包括：A, 6%西三酮的乙醇溶液僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝11精品資料B, 80%苯酚的乙醇溶液C, 2% 0.001M KCN的叱噬溶液配制中的叱噬需要經(jīng)過西三酮處理后，重蒸后再使用。檢測(cè)過程，取少

16、量樹脂，加入A, B, C各2-3滴，100c下加熱1-2min,如果溶液有蘭色，或樹脂 出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。還有其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，澳芬蘭法等。圖7西三酮檢測(cè)原理1.323. 周相合成切割方法 周相合成完成之后，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來，然后 經(jīng)過冰乙醴沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過 HPLC分離純化，冷凍干燥得到最后產(chǎn) 品。由于選擇的樹脂不同，氨基酸序列不同，在切割時(shí)候，選擇的切割方法也 不完全相同，一般都是選擇酸性條件下切割的條件，對(duì)于 PAM, MBHA樹 脂，一月采用HF切割，切割過程中需要添加對(duì)甲苯酚，對(duì)

17、琉基苯酚，苯甲醴 等試劑。而對(duì)于 Wang, Rink-Amide, Trt樹脂，一般采用TFA切割，切割過程 中加入，乙二硫醇，苯甲硫醴，水，三異丙基硅烷，苯酚等。這些添加試劑主 要作為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子， 減少這些碳正離子對(duì)部分氨基酸側(cè)鏈的進(jìn)攻導(dǎo)致的副反應(yīng)，比較容易產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有：Trp, Tyr0切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配 比：HF/p-cresol/p-thiocresol (90/5/5) , TFA/TIS/EDT/H2O (94/1/2.5/2.5),反 應(yīng)一般是在室溫條件下2h-4h01.3.3. 多肽合

18、成中主要問題1.3.3.1. 消旋及其反應(yīng)機(jī)理多肽合成過程中，部分氨基酸在活化的過程中會(huì)導(dǎo)致不同程度的消旋，特別容 易消旋的氨基酸有：Cys, His, Phe,當(dāng)然這些消旋化還和溶劑，溫度以及合成 中的有機(jī)堿等因素有關(guān)。對(duì)于這些氨基酸，可以通過采用高效縮合試劑，減少 反應(yīng)時(shí)間，可以減少消旋的比例，一般條件選擇適當(dāng)，消旋化都可以控制在5%以內(nèi)。消旋反應(yīng)機(jī)理如下：圖8消旋反應(yīng)機(jī)理1.3.3.2. 二酮哌嗪(DKP)反應(yīng)DKP副反應(yīng)出現(xiàn)在FMOC-Wang樹脂合成過程中，主要出現(xiàn)在第一個(gè)氨基酸為 Pro的時(shí)候，當(dāng)?shù)诙€(gè)氨基酸脫FMOC的時(shí)候，e氨基被游離出來之后，立即 對(duì)Wang樹脂的葦酯鍵進(jìn)行分

19、子內(nèi)胺解，生成六元環(huán)二酮哌嗪衍生物，同時(shí)從 Wang樹脂上釋放出來，導(dǎo)致反應(yīng)終止。該反應(yīng)非常迅速，文獻(xiàn)報(bào)道采用 50%Pip/DMF,脫1min, 4min的條件，但是我們實(shí)驗(yàn)證明在多數(shù)情況下，即使 是1min左右反應(yīng)就超過了 20%。因此一般在末端第一個(gè)氨基酸為 Pro的時(shí)候， 建議采用2-Cl-Trt樹脂合成，由于該樹脂巨大的空間阻力，可以完全消除該副 反應(yīng)。這個(gè)副反應(yīng)在BOC策略合成過程中，卻可以完全避免，因?yàn)?BOC在使 用TFA脫除后，使氨基以TFA鹽的形式存在，從而失去了親核性，不能進(jìn)攻 葦酯鍵。圖9 DKP反應(yīng)機(jī)理1.3.33困難序列多肽合成周相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或

20、合成效率很低的問題，這里面的主 要原因是由于多肽序列引起的，因?yàn)橛行┒嚯男蛄性跇渲闲纬?amp;折疊，改變了樹脂的溶脹性能，還有可能將反應(yīng)的活性位點(diǎn)埋藏在樹脂里面，這樣使得反 應(yīng)很難進(jìn)行，目前報(bào)道使用的主要方法有：?使用混合溶劑，DMSO/DMF , 6N月瓜呢/DMF溶液?提高反應(yīng)溫度，或采用微波方法?使用高離液鹽，LiCl , NaClO4等。?使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂，同時(shí)減少樹脂擔(dān)載量(0.05- 0.2mmol/g)1.4, 合成多肽分析鑒定方法多肽的分析鑒定方法有多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定，多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)包括：質(zhì) 譜分析，氨基酸組成分析，氨基酸序列分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括：圓二

21、色譜(CD) , NMR, X-衍射等方法。1.4.1. 純度分析多肽的純度分析，一般都采用 HPLC進(jìn)行分析，選擇RP-C18,粒徑5小，孔徑 300A, 4.6 X50mm,流動(dòng)相：A, 0.1% TFA/H2O; B, 0.1% TFA/ACN ,洗脫梯 度，5%B-65%B,時(shí)間30min。也有些多肽，特別是短肽，由于親水性強(qiáng)，在 C18上保留很弱，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個(gè)改變分析梯度， 可以將起始梯度改為2%,等度或小梯度洗脫；另外一個(gè)方法是在流動(dòng)相中加入 強(qiáng)離子對(duì)試劑，如七氟丁酸，十八烷基磺酸鈉等。1.42. 一級(jí)結(jié)構(gòu)分析1.421. 質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析的目的主要是確證

22、分子量，當(dāng)然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息，但是這個(gè)需要比較全的數(shù)據(jù)庫作為基礎(chǔ)，分析才能比較準(zhǔn)確。由于 多肽性質(zhì)不穩(wěn)定，需要采用軟電離技術(shù)，目前多肽分析主要使用了電噴霧(ESI-MS),基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI-MS )。其中ESI-MS通常會(huì)給出多 電荷峰，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基，胴基，咪唾基的數(shù)目有關(guān)，因此，經(jīng)常 給出了雙電荷，三電荷等離子峰。 MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常 情況下很少帶多電荷，因此數(shù)據(jù)直接對(duì)應(yīng)了分子離子峰，容易分析。止匕外，通 常在分析長肽或蛋白過程中，需要添加 NH4, Na, K等離子，提高靈敏度，所 以一般在 MS中出現(xiàn)一組峰，分別

23、對(duì)應(yīng)：(M+H) +, (M+NH4) +,(M+Na) +, (M+K) +。1.422. 氨基酸組成分析氨基酸組成分析一般需要產(chǎn)品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種類， 數(shù)目。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件 下，110C,用6M鹽酸水解16至72小時(shí)。酸水解雖然很有用，但酸水解條件 下不能獲得完整的氨基酸分析，因?yàn)榇蠖０泛凸劝滨０返膫?cè)鏈含有酰胺鍵， 用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以將大冬酰胺轉(zhuǎn)換為大冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為 谷氨酸。由于水解溫度比較高，色氨酸的呷珠環(huán)容易被空氣氧化，即使在密封 的管中，色氨酸的呷珠環(huán)也幾乎都被破壞了。因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是

24、 通過它的紫外吸收光譜估計(jì)的，也可以通過堿水解分析色氨酸的含量。半胱氨 酸在酸水解中也不能精確測(cè)定，要精確測(cè)量需要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或 竣甲基化，形成的衍生物在酸水解之后才能定量。1.423. 氨基酸序列分析氨基酸序列分析的基本原理是 Edman降解，主要涉及耦聯(lián)、水解、萃取和轉(zhuǎn)換 等4個(gè)過程。首先使用苯異硫氟酸酯(PITC)在pH9.0的堿性條件下對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng)，形成苯氨基硫甲酰 （PTC）衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用三氟乙酸處理，N-端氨基酸殘基 肽鍵被有選擇地切斷，釋放出該氨基酸殘基的曝晚咻酮苯胺衍生物。接下來將 該衍生物用

25、有機(jī)溶劑（例如氯丁烷）從反應(yīng)液中萃取出來，而去掉了一個(gè)N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中。萃取出來的嚷晚咻酮苯胺衍生物不穩(wěn)定，經(jīng)酸 作用，再進(jìn)一步環(huán)化，形成一個(gè)穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫腑（ PTH）衍生物，即PTH- 氨基酸。留在溶液中的減少了一個(gè)氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過程， 整個(gè)測(cè)序過程現(xiàn)在都是通過測(cè)序儀自動(dòng)進(jìn)行。1.4.3. 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析1.4.3.1. 圓二色譜（CD）圓二色譜是一種特殊的吸收譜，它通過測(cè)量蛋白質(zhì)等生物大分子的圓二色光 譜，從而得到生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，簡單、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊， 蛋白質(zhì)構(gòu)象研究，酶動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域。圓二色譜紫外區(qū)段（190-240nm）,主要 生色團(tuán)

26、是肽鏈，這一波長范圍的 CD譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。0- 螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm、208nm處呈負(fù)峰，在190nm附近有一正峰。&折 疊構(gòu)象的CD譜，在217-218nm處有一負(fù)峰，在195-198nm處有一強(qiáng)的正峰。 無規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜在198nm附近有一負(fù)峰，在220nm附近有一小而寬的 正峰。1.4.32 核磁共振（NMR）隨著二維、三維以及四維NMR的應(yīng)用，分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā) 展，使NMR逐漸成為大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、分布以及構(gòu)象。目前，NMR在分析分子中含少于30個(gè)氨基酸的 小肽時(shí)是非常有用的，分析結(jié)果快

27、速準(zhǔn)確。1.4.3.3. X-衍射X-衍射可獲得有關(guān)化合物品型的直接信息，而且可以判斷相對(duì)與絕對(duì)構(gòu)型。?多肽標(biāo)記及修飾目前多肽標(biāo)記及修飾的內(nèi)容非常多，廣泛應(yīng)用在多肽藥物，多肽生物學(xué)，多肽 抗體以及多肽試劑的研究中。目前應(yīng)用廣泛的有：非放射性核素標(biāo)記(C13,H2),熒光標(biāo)記(FAM , FITC),生物素標(biāo)記，磷酸化修飾等。2.1. 非放射性核素標(biāo)記目前在非放射性核素標(biāo)記中，使用廣泛的仍然是 C13, H2,因?yàn)槠涫褂冒踩?放射性小?，F(xiàn)在有比較完全的非放射性標(biāo)記的氨基酸，可以按照正常的多肽合 成方法將標(biāo)記好的氨基酸直接連接到多肽上。22熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記由于沒有放射性，實(shí)驗(yàn)操作簡單。因此，目前

28、在生物學(xué)研究中熒光標(biāo) 記應(yīng)用非常廣泛，熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系，對(duì)于有游離竣基的 采用的方法與接肽反應(yīng)相同，也采用 HBTU/HOBt/DIEA方法連接。但是對(duì)于 FITC標(biāo)記，需要在連接FITC前，增加一個(gè)氨基己酸，避免在切割的過程中被 TFA切割掉。2.3. 生物素標(biāo)記生物素-親合素系統(tǒng)(biotin-avidin system, BAS),是70年代后期應(yīng)用于免疫 學(xué)，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。由于它具有生物素與親合 素之間高度親和力及多級(jí)放大效應(yīng)，并與熒光素、酶、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù) 有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高。主要有用于 標(biāo)記多

29、肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對(duì)硝基酚酯 (pBNP),其中以BNHS最常用，當(dāng)然,也可以直接使用生物素也可以標(biāo)記，因 為其結(jié)構(gòu)上有個(gè)游離的竣基，采用 HBTU/HOBt/DIEA方法縮合，由于生物素的 溶解度低，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。2.4. 磷酸肽合成磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Ser, Thr, Tyr。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是單甲基磷酸化氨基 酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的連接一般采用 HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點(diǎn)，特別是在

30、合成多磷酸化多肽或長肽的時(shí)候，連接效率低，最后產(chǎn)品純度很低，對(duì)于這種 磷酸化多肽，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，對(duì)于Tyr, Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，而 Ser可以采用Fmoc-Ser （trt）,在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化，采用雙甲基亞磷酰胺，四氮晚 生成亞磷酰胺四晚活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷酰 基，完成反應(yīng)。?蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽多肽在與蛋白受體結(jié)合發(fā)揮功能的時(shí)候，總是先折疊出某些特殊的結(jié)構(gòu)，多肽 類似物合成主要是為了模擬這些結(jié)構(gòu)，保持或提高生物活性，同

31、時(shí)也為了改變 多肽的穩(wěn)定性，提高其抗酶解能力。3.1. o-螺旋多肽e螺旋是蛋白結(jié)構(gòu)中最為普通的一種，但是一般多肽在溶液中大多是無規(guī)卷曲 的，目前使用最多的方法是多肽保持 為螺旋結(jié)構(gòu)就是在多肽表面通過共價(jià)鍵將 處在e螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)氨基酸連接起來，選擇的位點(diǎn)（i, i+4或i, i+7）,選 擇的化學(xué)鍵包括：二硫鍵，硫醴鍵，酰胺鍵，烯姓鍵（ RCM）等方法。3.1.1. 二硫鍵二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中，對(duì)穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義，二硫鍵 一般是通過序列中的2個(gè)Cys的琉基，經(jīng)氧化形成。形成二硫鍵的方法很多： 空氣氧化法，DMSO氧化法，過氧化氫氧化法等。二硫鍵的合成過程，可以通 過日lm

32、an檢測(cè)以及HPLC檢測(cè)方法對(duì)其反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。1.1.1. 鍵硫醴鍵的形成可以通過序列中的 Lys,將澳乙酸連接到Lys的側(cè)鏈氨基上，利 用其和琉基的特異性反應(yīng)，反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行，迅速高效。3.1.3. 酰胺鍵 多肽的內(nèi)酰胺環(huán)肽的合成一般是利用 Lys, Asp (Glu)的選擇性保護(hù)，在固相 上直接環(huán)化。BOC策略中可以采用 BOC-Lys (Fmoc) , BOC-Asp (OFm), FMOC 策略中可以采用 FMOC-Lys (Aloc) , FMOC-Asp (Allyl)。對(duì)于首尾 環(huán)肽，還可以先合成保護(hù)的多肽，然后在液相中環(huán)化生成目標(biāo)多肽。3.1.4. 烯I鍵(RCM)RCM反應(yīng)是一個(gè)過渡金屬催化反應(yīng)，其反應(yīng)中使用催化劑：(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh,可以催化烯姓環(huán)化，過程中脫去一分子乙烯Fmc-X-Resin1.20M pip/DMFIFmoc-Xl/HBTU/HOBt/DlEAm Xn*X-Re sin僅供學(xué)習(xí)與交流，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除 謝謝19(Cy3P)2a2Ru=CHPh. DCM.rcfluicXtn . Xu-X-5-Csincleavage rea