高效液相色譜法精華總結(jié)--資料

1、高效液相色譜法的發(fā)展在所有色譜技術(shù)中，液相色譜法（liquid chromatography ， LC）是最早（1903年）發(fā)明的，但其初期發(fā)展比較慢，在液相色譜普及之前，紙色譜法、氣相色譜法和薄層色譜法是色譜分析法的主流。到了 20 世紀(jì) 60 年代后期，將已經(jīng)發(fā)展得比較成熟的氣相色譜的理論與技術(shù)應(yīng)用到液相色譜上來(lái)，使液相色譜得到了迅速的發(fā)展。特別是填料制備技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)和高壓輸液泵性能的不斷改進(jìn)，使液相色譜分析實(shí)現(xiàn)了高效化和高速化。具有這些優(yōu)良性能的液相色譜儀于1969 年商品化。從此，這種分離效率高、分析速度快的液相色譜就被稱(chēng)為高效液相色譜法（high performance liqui

2、d chromatography ， HPLC ） ，也稱(chēng)高壓液相色譜法或高速液相色譜法。氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的有機(jī)化合物，而HPLC 則適合于分析那些用氣相色譜難以分析的物質(zhì)，如揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)?，F(xiàn)在，HPLC 的應(yīng)用范圍已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)氣相色譜，位居色譜法之首。高效液相色譜的類(lèi)型廣義地講，固定相為平面狀的紙色譜法和薄層色譜法也是以液體為流動(dòng)相，也應(yīng)歸于液相色譜法。不過(guò)通常所說(shuō)的液相色譜法僅指所用固定相為柱型的柱液相色譜法。通常將液相色譜法按分離機(jī)理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類(lèi)。其實(shí)，有些液相色譜方法并不能簡(jiǎn)單地歸

3、于這四類(lèi)。表8-1 列舉了一些液相色譜方法。按分離機(jī)理，有的相同或部分重疊。但這些方法或是在應(yīng)用對(duì)象上有獨(dú)特之處，或是在分離過(guò)程上有所不同，通常被賦予了比較固定的名稱(chēng)。液相色譜儀流程圖現(xiàn)在的液相色譜儀一般都做成一個(gè)個(gè)單元組件，然后根據(jù)分析要求將各所需單元組件組合起來(lái)。最基本的組件是高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（記錄儀、積分儀或色譜工作站）。此外，還可根據(jù)需要配置流動(dòng)相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、 柱后反應(yīng)系統(tǒng)和全自動(dòng)控制系統(tǒng)等。圖 8-1 是具有基本配置的液相色譜儀的流程圖。液相色譜儀的工作過(guò)程：輸液泵將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速（或壓力）輸送至分析體系，在色譜柱之前通過(guò)

4、進(jìn)樣器將樣品導(dǎo)入,流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱,在色譜柱中各組分因在固定相中的分配系數(shù)或吸附力大小的不同而被分離，并依次隨流動(dòng)相流至檢測(cè)器，檢測(cè)到的信號(hào)送至數(shù)據(jù)系統(tǒng)記錄、處理或保存。輸液泵高壓輸液泵是液相色譜儀的關(guān)鍵部件，其作用是將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜系統(tǒng)。對(duì)于帶在線脫氣裝置的色譜儀，流動(dòng)相先經(jīng)過(guò)脫氣裝置再輸送到色譜柱。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。1. 對(duì)輸液泵的基本要求流量準(zhǔn)確可調(diào)。對(duì)于一般的分析工作而言，流動(dòng)相的流速在0.5-2mL/min ，輸液泵的最大流量一般為5-10mL/min 。輸液泵的流量控制精度通常要求小于±0.5%。輸液泵必須能精確地

5、調(diào)節(jié)流動(dòng)相流量，這可以通過(guò)電子線路調(diào)節(jié)電機(jī)轉(zhuǎn)速或沖程長(zhǎng)短來(lái)實(shí)現(xiàn)。流量的測(cè)定通常采用熱脈沖流量計(jì)。耐高壓。高效液相色譜柱是將很細(xì)顆粒(3-10 粒徑)的填料，在高壓下填充到柱管中的， 為了保證流動(dòng)相以足夠大的流速通過(guò)色譜柱，需要足夠高的柱前壓。通常要求泵的輸出壓力達(dá)到30-60MPa 的高壓。液流穩(wěn)定。輸液泵輸出的液流應(yīng)無(wú)脈動(dòng)，或配套脈沖抑制器。泵的死體積小。為了快速更換溶劑和適于梯度洗脫，泵的死體積通常要求小于0.5mL。泵的結(jié)構(gòu)材料應(yīng)耐化學(xué)腐蝕。2. 輸液泵輸液泵按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對(duì)液相色譜分析來(lái)說(shuō)，輸液泵的流量穩(wěn)定性更為重要，這是因?yàn)榱魉俚淖兓瘯?huì)引起溶質(zhì)的保留值的變化，而

6、保留值是色譜定性的主要依據(jù)之一。因此，恒流泵的應(yīng)用更廣泛。輸液泵按工作方式分為氣動(dòng)泵和機(jī)械泵兩大類(lèi)。機(jī)械泵中又有螺旋傳動(dòng)注射泵、單活塞往復(fù)泵、雙活塞往復(fù)泵和往復(fù)式隔膜泵。幾種輸液泵的基本性能總結(jié)于表8-2。(1) 活塞型往復(fù)泵活塞型往復(fù)泵是液相色譜儀中使用最廣泛的一種恒流泵。單活塞往復(fù)泵：如圖 8-2 所示，在活塞柱的一端有一偏心輪，偏心輪連在電動(dòng)機(jī)上，電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)偏心輪轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，活塞柱則隨之左右移動(dòng)。在活塞的另一端有上下兩個(gè)單向閥，各有 1-2 個(gè)藍(lán)寶石或陶瓷球，由其起閥門(mén)的作用。下面的單向閥與流動(dòng)相連通，為活塞的溶液入口； 上面的單向閥與色譜柱相連，為活塞的溶液出口?；钊c活塞缸壁之間是由耐

7、腐蝕材料制造的活塞墊，以防漏液?；钊蛲庖苿?dòng)時(shí)，出口單向閥關(guān)閉，入口單向閥打開(kāi)，溶液(流動(dòng)相)抽入活塞缸?；钊蚶镆苿?dòng)時(shí)，入口單向閥關(guān)閉，出口單向閥打開(kāi)，流動(dòng)相被壓出活塞缸，流向色譜柱。這種單純往復(fù)式單活塞泵構(gòu)造簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜?；钊囊苿?dòng)距離是可變的，流量由活塞的移動(dòng)距離所決定。因?yàn)槠妮喴话忝糠昼娹D(zhuǎn)50-60 次，也就是流動(dòng)相的抽入和吐出以每分鐘50-60 次的頻率周期性變化，所以，產(chǎn)生的脈沖很顯著。減緩脈沖的辦法就是在泵出口與色譜柱入口之間安裝一個(gè)脈沖阻尼器。脈沖阻尼器的種類(lèi)很多，但其共同特征是具有一定的容積和彈性。最常見(jiàn)和最簡(jiǎn)單的脈沖阻尼器是將內(nèi)徑0.2-0.5mm 的不銹鋼管繞成彈簧狀

8、，利用其繞性來(lái)阻滯壓力和流量的波動(dòng)，起到一定的緩沖作用。為了減小譜帶展寬，也為了便于清洗和更換流動(dòng)相，阻尼器的體積應(yīng)盡可能小。演示動(dòng)畫(huà)雙活塞往復(fù)泵：如圖 8-3(a)所示，雙活塞往復(fù)泵有一個(gè)精心設(shè)計(jì)的偏心凸輪，用同步電機(jī)或變速直流電機(jī)驅(qū)動(dòng)偏心凸輪，偏心凸輪再推動(dòng)兩活塞作往復(fù)運(yùn)動(dòng)。偏心凸輪短半徑端所對(duì)應(yīng)的活塞向外伸，使該活塞的下單向閥打開(kāi)吸入流動(dòng)相，與此同時(shí)，偏心凸輪的長(zhǎng)半徑端所對(duì)應(yīng)的另一活塞被推入，使其上單向閥打開(kāi)，并將流動(dòng)相送至色譜柱。于是， 兩活塞交替伸縮，往復(fù)運(yùn)動(dòng)，獲得的排液特性如圖8-3(b)所示，即具有穩(wěn)定的輸出流量，這樣就能避免單活塞泵液流脈沖的問(wèn)題。雙活塞往復(fù)泵的輸液流量比單活塞

9、泵小得多。其優(yōu)點(diǎn)是不必使用消除脈沖的阻尼器，避免了阻尼器的壓力消耗，但缺點(diǎn)是設(shè)備成本較高，流量調(diào)節(jié)也比單活塞泵復(fù)雜。（2） 隔膜型往復(fù)泵隔膜型往復(fù)泵也是一種恒流泵，其結(jié)構(gòu)如圖8-4 所示。一塊隔膜將泵缸分為兩部分，一部分充滿了油，另一部分充滿了流動(dòng)相?；钊c油接觸，當(dāng)活塞往復(fù)運(yùn)動(dòng)時(shí)，隔膜受到油壓的作用，對(duì)流動(dòng)相部分產(chǎn)生"吸引"或 "推壓"，使流動(dòng)相部分的單向閥吸液或排液，從而獲得穩(wěn)定的液流。通過(guò)調(diào)節(jié)泵活塞的沖程即可進(jìn)行流量調(diào)節(jié)。隔膜泵的活塞不直接與流動(dòng)相接觸，故不存在活塞密封墊磨損對(duì)流動(dòng)相的污染。隔膜泵的死體積?。s0.1mL） ，因此，更換流動(dòng)相后平衡

10、快，有利于梯度洗脫。隔膜泵的缺點(diǎn)是結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，價(jià)格較貴，和單活塞機(jī)械往復(fù)泵一樣，也產(chǎn)生脈沖，也需要配置阻尼裝置來(lái)消除脈沖。脫氣裝置1. 為什么要脫氣流動(dòng)相溶液往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡。氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪音峰。小氣泡慢慢聚集后會(huì)變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或出現(xiàn)流速不穩(wěn)定，致使基線起伏。氣泡一旦進(jìn)入色譜柱,排出這些氣泡則很費(fèi)時(shí)間。在熒光檢測(cè)中,溶解氧還會(huì)使熒光淬滅。溶解氣體還可能引起某些樣品的氧化或使溶液 pH 值發(fā)生變化。2. 脫氣方法目前， 液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫

11、氣。超聲波振蕩脫氣：將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣10-20min 。這種方法比較簡(jiǎn)便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，所以，目前仍廣泛采用。惰性氣體鼓泡吹掃脫氣：將氣源（鋼瓶）中的氣體（氦氣）緩慢而均勻地通入儲(chǔ)液罐中的流動(dòng)相中，氦氣分子將其它氣體分子置換和頂替出去，而它本身在溶劑中的溶解度又很小，微量氦氣所形成的小氣泡對(duì)檢測(cè)無(wú)影響。真空脫氣裝置：將流動(dòng)相通過(guò)一段由多孔性合成樹(shù)脂膜制造的輸液管，該輸液管外有真空容器，真空泵工作時(shí)，膜外側(cè)被減壓，分子量小的氧氣、氮?dú)?、二氧化碳就?huì)從膜內(nèi)進(jìn)入膜外而被脫除。圖 8-5 是單流路真空脫氣裝置的原理圖。一般的真空脫氣裝置有多條流路，可同時(shí)對(duì)多

12、個(gè)溶液進(jìn)行脫氣。梯度洗脫裝置1. 為什么要進(jìn)行梯度洗脫？在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。2. 梯度洗脫操作在液相色譜中流速（壓力）梯度和溫度梯度效果不大，而且還會(huì)帶來(lái)一些不利影響，因此， 液相色譜中通常所說(shuō)的梯度洗脫是指流動(dòng)相梯度，即在分離過(guò)程中改變流動(dòng)相的組成或濃度。線性梯度階梯梯度高壓梯度低壓梯度線性梯度：在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。階梯梯度：直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變?yōu)榱硪惠^高強(qiáng)度的流動(dòng)相。梯度洗脫

13、時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此， 梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問(wèn)題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。高壓梯度：一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A 和 B 兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的，其裝置結(jié)構(gòu)如圖 8-6 所示。高壓梯度系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是，只要通過(guò)梯度程序控制器控制每臺(tái)泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。其主要缺點(diǎn)是使用了兩臺(tái)高壓輸液泵，使儀器價(jià)格變得更昂貴，故障率也相對(duì)較高，而且只能實(shí)現(xiàn)

14、二元梯度操作。低壓梯度：只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。因?yàn)楸壤y是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合，在常壓下混合往往容易形成氣泡，所以低壓梯度通常配置在線脫氣裝置，圖 8-7 是四元梯度系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。來(lái)自于四種溶液瓶的四根輸液管分別與真空脫氣裝置的四條流路相接，經(jīng)脫氣后的四種溶液進(jìn)入比例閥，混合后從一根輸出管進(jìn)入泵體。多元梯度泵的流路可以部分空置。進(jìn)樣器進(jìn)樣器是將樣品溶液準(zhǔn)確送入色譜柱的裝置，分手動(dòng)和自動(dòng)兩種方式。進(jìn)樣器要求密封性好，死體積小，重復(fù)性好，進(jìn)樣時(shí)引起色譜系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)要很小。 現(xiàn)在的液相色譜儀所采用的手動(dòng)進(jìn)

15、樣器幾乎都是耐高壓、重復(fù)性好和操作方便的六通閥進(jìn)樣器，其原理與氣相色譜中所介紹的相同。色譜柱1. 色譜柱的構(gòu)成色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。色譜填料：經(jīng)過(guò)制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10 粒徑的球形顆粒。色譜柱管：內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm。色譜柱：也稱(chēng)固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的,其結(jié)構(gòu)如圖8-8所示。2. 色譜柱的填充干法填充：在硬臺(tái)面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開(kāi)垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入 50-100mg 填料，然后垂直臺(tái)

16、面墩10-20 次。濕法填充：又稱(chēng)淤漿填充法，使用專(zhuān)門(mén)的填充裝置（圖8-9） 。3. 填料的結(jié)構(gòu)色譜填料是由基質(zhì)和功能層兩部分構(gòu)成?；|(zhì)： 又常稱(chēng)作載體或擔(dān)體，通常制備成數(shù)微米至數(shù)十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對(duì)分離不起明顯的作用，只是作為功能基團(tuán)的載體。常用來(lái)作基質(zhì)的有硅膠和有機(jī)高分子聚合物微球。功能層：是通過(guò)化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對(duì)樣品分子的保留起實(shí)質(zhì)作用的有機(jī)分子或功能團(tuán)。如圖8-10 是硅膠基質(zhì)的冠醚大分子固定相的結(jié)構(gòu)示意圖，功能層冠醚分子吸附或鍵合在硅膠基質(zhì)的表面。填料的物理結(jié)構(gòu)：分為微孔型（或凝膠型）、大孔型（全多孔型）、薄殼型和表面多孔型四

17、種類(lèi)型，如圖8-11 所示。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與自動(dòng)控制單元數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：又稱(chēng)色譜工作站。它可對(duì)分析全過(guò)程(分析條件、儀器狀態(tài)、分析狀態(tài))進(jìn)行在線顯示，自動(dòng)采集、處理和儲(chǔ)存分析數(shù)據(jù)。一些配置了積分儀或記錄儀的老型號(hào)液相色譜儀在很多實(shí)驗(yàn)室還在使用，但近年新購(gòu)置的色譜儀，一般都帶有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，使用起來(lái)非常方便。自動(dòng)控制單元：將各部件與控制單元連接起來(lái)，在計(jì)算機(jī)上通過(guò)色譜軟件將指令傳給控制單元，對(duì)整個(gè)分析實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制，從而使整個(gè)分析過(guò)程全自動(dòng)化。也有的色譜儀沒(méi)有設(shè)計(jì)專(zhuān)門(mén)的控制單元，而是每個(gè)單元分別通過(guò)控制部件與計(jì)算機(jī)相連，通過(guò)計(jì)算機(jī)分別控制儀器的各部分。液相色譜分離模式吸附色譜(adsorption c

18、hromatography)原理： 基于被測(cè)組分在固定相表面具有吸附作用，且各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保留和實(shí)現(xiàn)分離。固定相：固定相通常是活性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑，所以吸附色譜也稱(chēng)液固吸附色譜?；钚怨枘z最常用。活性硅膠：一種多孔性物質(zhì),因 -O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O- 結(jié)合而具有三維結(jié)構(gòu),表面具有硅羥基,作吸附劑的硅膠需經(jīng)加熱處理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔徑分布分為表面多孔和全多孔兩類(lèi)。硅膠既是吸附色譜最常用的固定相，也是分配色譜、離子色譜等色譜固定相的常用基質(zhì)。流動(dòng)相：弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構(gòu)

19、烷烴(己烷、戊烷、庚烷等)、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等等。分離過(guò)程：硅羥基呈微酸性，易與氫結(jié)合，是吸附的活性點(diǎn)。流動(dòng)相溶劑在吸附劑表面形成單分子或雙分子吸附層，當(dāng)樣品分子進(jìn)入色譜柱，樣品主要靠氫鍵結(jié)合力吸附到硅羥基上， 與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附點(diǎn)。樣品分子反復(fù)地被吸附，又反復(fù)地被流動(dòng)相分子頂替解吸， 隨著流動(dòng)相的流動(dòng)而在柱中向前移動(dòng)。因?yàn)椴煌臉悠贩肿釉诠潭ㄏ啾砻娴奈侥芰Σ煌?，因而吸?解吸的速度不同，各組分被洗脫的時(shí)間（保留時(shí)間）也就不同，使得各組分相互分離。應(yīng)用： 吸附色譜在早期的HPLC 中應(yīng)用得最多，現(xiàn)在，很多以前用吸附色譜分離的物質(zhì)被更方便和更有效的化學(xué)鍵合相反相分配色譜所代替。

20、由于硅羥基活性點(diǎn)在硅膠表面常按一定幾何規(guī)律排列，因此吸附色譜用于結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍是最有效的方法。如農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油中烷、烯、芳烴的分離。分配色譜（partition chromatography）原理： 主要基于樣品分子在流動(dòng)相和固定相間的溶解度不同（分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式。鍵合固定相：分配色譜原本是基于樣品分子在包覆于惰性載體（基質(zhì)）上的固定相液體和流動(dòng)相液體之間的分配平衡的色譜方法，因此也稱(chēng)液-液分配色譜。因?yàn)樽鞴潭ㄏ嗟囊后w往往容易溶解到流動(dòng)相中去，所以重現(xiàn)性很差，不大為人們所采用。后來(lái)發(fā)展起來(lái)的鍵合固定相以化學(xué)鍵合的方法將功能分子結(jié)合到惰性載體上，固定相就不會(huì)

21、溶解到流動(dòng)相中去了。這種化學(xué)鍵合型固定相是當(dāng)今HPLC 最常用的固定相，大約占HPLC 固定相的四分之三。極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子。非極性鍵合固定相：鍵合在載體表面的功能分子是烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。如最常用的ODS（ Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18 柱就是最典型的代表，它是將十八烷基三氯硅烷通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與硅膠表面的硅羥基結(jié)合，在硅膠表面形成化學(xué)鍵合態(tài)的十八烷基，其極性很小。正相 HPLC（ normal phase HPLC） ： 是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動(dòng)相所組成的 HPLC

22、 體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動(dòng)相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC ， 早期的液相色譜中曾廣泛采用這種體系。對(duì)于一些在非極性疏水固定相中強(qiáng)烈保留的有機(jī)分子常常采用正相HPLC 模式。反相 HPLC （ reversed phase HPLC） ： 由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC 體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠，代表性的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。是當(dāng)今液相色譜的最主要分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物質(zhì)的分離。凝膠色譜（gel chromatography）原理： 以多孔性物質(zhì)作固定相，樣品分子受固定相

23、孔徑大小的影響而達(dá)到分離的一種液相色譜分離模式。樣品分子與固定相之間不存在相互作用力（吸附、分配和離子交換等），因而凝膠色譜又常被稱(chēng)作體積排斥色譜、空間排阻色譜、分子篩色譜等。比固定相孔徑大的溶質(zhì)分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，迅速流出色譜柱，不能被分離。比固定相孔徑小的分子才能進(jìn)入孔內(nèi)而產(chǎn)生保留，溶質(zhì)分子體積越小，進(jìn)入固定相孔內(nèi)的機(jī)率越大，于是在固定相中停留（保留）的時(shí)間也就越長(zhǎng)（圖8-12） 。固定相：化學(xué)惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝膠、親水凝膠、無(wú)機(jī)多孔材料。流動(dòng)相：在凝膠色譜中，流動(dòng)相的作用不是為了控制分離，而是為了溶解樣品或減小凝膠過(guò)濾色譜（gel filtration chromatograp

24、hy, GFC） ： 以水或緩沖溶液作流動(dòng)相的凝膠凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography, GPC） ： 以有機(jī)溶劑作流動(dòng)相的凝膠色主要適合于脂溶性高分子的分離。如甲苯和四氫呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC 主要用于合成高分子的分子量（分布）的測(cè)定。離子色譜法(ion chromatography, IC)1. 離子交換色譜法(ion exchange chromatography, IEC )2. 離子排斥色譜法(ICE)3. 離子對(duì)色譜(ion-pair chromatography, IPC )1. 離子交換色譜法（ion exchange chr

25、omatography, IEC ）IEC 使用的是低交換容量的離子交換劑，這種交換劑的表面有離子交換基團(tuán)。帶負(fù)電荷（如磺酸基和羧酸基）可以用于陽(yáng)離子的分離，帶正電荷的交換基團(tuán)（如季胺鹽）8-13 是陰離子交換過(guò)程的示意圖。由于靜電場(chǎng)相互作用，樣品（也稱(chēng)淋洗離子）都與固定相中帶正電荷的交換基團(tuán)作用，樣品離又不斷地被淋洗離子交換而進(jìn)入流動(dòng)相，在兩相中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，不電荷密度大的離子與交換基的作用力大，在樹(shù)2. 離子排斥色譜法（ICE）因?yàn)殡x子排斥色譜的英文也可寫(xiě)作ion chromatography exclusion ，所以用ICE 作為其縮IEC 相區(qū)別。ICE 的分離機(jī)理是以樹(shù)脂的Donn

26、an 排斥為基礎(chǔ)的分配過(guò)程。分離陰離子用強(qiáng)酸性高交換容量的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，分離陽(yáng)離子用強(qiáng)堿性高交換容量的陰離子交換樹(shù)脂。下面以陰離子分離為例（如圖8-14）說(shuō)明離子排斥色譜的原理。強(qiáng)電解質(zhì)Cl-形成 H+Cl- ，因受排斥作用不能穿過(guò)半透膜進(jìn)入樹(shù)脂的微孔，迅速通過(guò)色譜柱而無(wú)保留。而弱電解質(zhì)CH3COOH 可以穿過(guò)半透膜進(jìn)入樹(shù)脂微孔。電解質(zhì)的離解度越小，受排斥作用也越小，因而在樹(shù)脂中的保留也就越大。3. 離子對(duì)色譜（ion-pair chromatography, IPC ）無(wú)機(jī)離子以及離解很強(qiáng)的有機(jī)離子通常可以采用離子交換色譜或離子排斥色譜進(jìn)行分離。 有很多大分子或離解較弱的有機(jī)離子需要采用通

27、常用于中性有機(jī)化合物分離的反相（或正相） 色譜。然而，直接采用正相或反相色譜又存在困難，因?yàn)榇蠖鄶?shù)可離解的有機(jī)化合物在正相色譜的硅膠固定相上吸附太強(qiáng)，致使被測(cè)物質(zhì)保留值太大、出現(xiàn)拖尾峰，有時(shí)甚至不能被洗脫。在反相色譜的非極性（或弱極性）固定相中的保留又太小。在這種情況下，就可采用離子對(duì)色譜。離子對(duì)色譜也稱(chēng)離子相互作用色譜，是在流動(dòng)相中加入適當(dāng)?shù)木哂信c被測(cè)離子相反電荷的離子，即"離子對(duì)試劑"，使之與被測(cè)離子形成中性的離子對(duì)化合物，此離子對(duì)化合物在反相色譜柱上被保留。保留的大小主要取決于離子對(duì)化合物的解離平衡常數(shù)和離子對(duì)試劑的濃度。離子對(duì)色譜也可采用正相色譜的模式，即可以用硅膠

28、柱，但不如反相色譜效果好，多數(shù)情況下采用反相色譜模式，所以離子對(duì)色譜也常稱(chēng)反相離子對(duì)色譜。液相色譜檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)器：用來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。檢測(cè)器利用溶質(zhì)的某一物理或化學(xué)性質(zhì)與流動(dòng)相有差異的原理，當(dāng)溶質(zhì)從色譜柱流出時(shí)， 會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相背景值發(fā)生變化，從而在色譜圖上以色譜峰的形式記錄下來(lái)。幾種主要檢測(cè)器的基本特性列于表8-3。紫外-可見(jiàn)光（UV-VIS）檢測(cè)器原理： 基于 Lambert-Beer 定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。很多有機(jī)分子都具紫外或可見(jiàn)光吸收基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見(jiàn)光吸收能力，因此UV-VIS 檢測(cè)器既有較高

29、的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS 對(duì)環(huán)境溫度、流速、 流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS 檢測(cè)器。用 UV-VIS 檢測(cè)時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng)，但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長(zhǎng)，另外， 應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒(méi)有背景吸收的流動(dòng)相。二極管陣列檢測(cè)器（diode-array detector, DAD ） ： 以光電二極管陣列（或CCD 陣列，硅靶攝像管等）作為檢測(cè)元件的UV-VIS 檢測(cè)器（圖8-15） 。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再

30、入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后， 對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。與普通 UV-VIS 檢測(cè)器不同的是，普通 UV-VIS 檢測(cè)器是先用單色器分光，只讓特定波長(zhǎng)的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列UV-VIS 檢測(cè)器是先讓所有波長(zhǎng)的光都通過(guò)流動(dòng)池，然后通過(guò)一系列分光技術(shù)，使所有波長(zhǎng)直接紫外檢測(cè)：所使用的流動(dòng)相為在檢測(cè)波長(zhǎng)下無(wú)紫外吸收的溶劑，檢測(cè)器直接測(cè)定被測(cè)組分的紫外吸收強(qiáng)度。多數(shù)情況下采用直接紫外檢測(cè)。間接紫外檢測(cè)：使用具有紫外吸收的溶液作流動(dòng)相，間接檢測(cè)無(wú)紫外吸收的組分。在離子色譜中使用較多，如以具有紫外吸收的鄰苯二甲酸氫鉀溶液作陰離子分離的流動(dòng)相，

31、無(wú)紫外吸收的無(wú)機(jī)陰離子被洗脫到流動(dòng)相中時(shí)，會(huì)使流動(dòng)相的紫外吸收減小。柱后衍生化光度檢測(cè)：對(duì)于那些可以與顯色劑反應(yīng)生成有色配合物的組分（過(guò)渡金屬離子、氨基酸等），可以在組分從色譜柱中洗脫出來(lái)之后與合適的顯色劑反應(yīng)，在可見(jiàn)光區(qū)檢測(cè)生成的有色配合物。示差折光檢測(cè)器（differential refractometers, RI）原理： 基于樣品組分的折射率與流動(dòng)相溶劑折射率有差異，當(dāng)組分洗脫出來(lái)時(shí)，會(huì)引起流動(dòng)相折射率的變化，這種變化與樣品組分的濃度成正比。示差折光檢測(cè)法也稱(chēng)折射指數(shù)檢測(cè)法。絕大多數(shù)物質(zhì)的折射率與流動(dòng)相都有差異，所以RI 是一種通用的檢測(cè)方法。雖然其靈敏度比其他檢測(cè)方法相比要低1-3

32、個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)于那些無(wú)紫外吸收的有機(jī)物（如高分子化合物、糖類(lèi)、脂肪烷烴）是比較適合的。在凝膠色譜中是必備檢測(cè)器，在制備色譜中也經(jīng)常使用。RI 檢測(cè)器根據(jù)其設(shè)計(jì)原理可分為反射型（根據(jù) Fresnel 定律） 、 折射型 （根據(jù) Snell 定律）和干涉型三種類(lèi)型。熒光檢測(cè)器(fluorescence detecto) r原理： 許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、生化物質(zhì)，如有機(jī)胺、維生素、激素、酶等， 被一定強(qiáng)度和波長(zhǎng)的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長(zhǎng)要長(zhǎng)的熒光。熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度、量子效率和樣品濃度成正比。有的有機(jī)化合物雖然本身不產(chǎn)生熒光，但可以與發(fā)熒光物質(zhì)反應(yīng)衍生化后檢測(cè)。結(jié)構(gòu)：如圖8-1

33、6。特點(diǎn)： 有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測(cè)法高2-3 個(gè)數(shù)量級(jí)。而且所需樣品量很小，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。conductivity detector, CD)原理： 基于離子性物質(zhì)的溶液具有導(dǎo)電性，其電導(dǎo)率與離子的性質(zhì)和濃度相關(guān)。電導(dǎo)檢測(cè)器是離子色譜中必備的檢測(cè)器。電導(dǎo)檢測(cè)器的構(gòu)成：由電導(dǎo)池、測(cè)量電導(dǎo)率所需的電子線路、變換靈敏度的裝置和數(shù)字顯示儀等幾部分組成，電導(dǎo)池是其核心。電導(dǎo)池的結(jié)構(gòu)：檢測(cè)體積可達(dá)到微升甚至納升級(jí)。其基本結(jié)構(gòu)是在柱流出液中放置兩根電極，然后通過(guò)適當(dāng)?shù)碾娮泳€路測(cè)量溶液的電導(dǎo)。圖8-17 是一種簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的電導(dǎo)池。電導(dǎo)檢測(cè)器工作原理：電導(dǎo)池工作時(shí)

34、，電極間及電極附近溶液中所發(fā)生的電化學(xué)過(guò)程可以用圖8-18 表示。當(dāng)向電導(dǎo)池的兩個(gè)電極施加電壓時(shí)，溶液中的陰離子向陽(yáng)極移動(dòng)，陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)。在電解質(zhì)溶液中的離子數(shù)目和離子的移動(dòng)速率決定溶液的電阻大小，離子的遷移率或單位電場(chǎng)中離子的速率取決于離子的電荷及其大小、介質(zhì)類(lèi)型、溶液溫度和離子濃度。 離子的遷移速率取決于施加電壓的大小。所施加的電壓既可以是直流電壓，也可以是正弦波或方波電壓。當(dāng)施加的有效電位確定后，即可測(cè)量出電路中的電流值，即能測(cè)出電導(dǎo)值。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light-scattering detector, ELSD)ELSD 是基于溶質(zhì)的光散射性質(zhì)的檢測(cè)器。

35、由霧化器、加熱漂移管（溶劑蒸發(fā)室）、激光光源和光檢測(cè)器（光電轉(zhuǎn)換器）等部件構(gòu)成（圖8-19） 。色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣 （壓縮空氣或氮?dú)猓╈F化成微細(xì)液滴，液滴通過(guò)加熱漂移管時(shí)，流動(dòng)相中的溶劑被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過(guò)光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。因?yàn)樯⑸涔鈴?qiáng)只與溶質(zhì)顆粒大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)本身的物理和化學(xué)性質(zhì)無(wú)關(guān)， 所以 ELSD 屬通用型和質(zhì)量型檢測(cè)器。適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。其靈敏度與載氣流速、汽化室溫度和激光光源強(qiáng)度等參數(shù)有關(guān)。與示差折光檢測(cè)器相比，它的基線漂移不受溫度影響，信噪比高，也可用于梯度洗脫。其

36、它色譜方法除氣相色譜和液相色譜之外,還有以電場(chǎng)、激光或超臨界流體為驅(qū)動(dòng)力（或流動(dòng)相）的色譜，簡(jiǎn)介如下。超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography, SFC ）超臨界流體：指高于臨界壓力和臨界溫度時(shí)的一種物質(zhì)狀態(tài)，它既不是氣體，也不是液體，但它兼具氣體的低粘度和液體的高密度以及介于氣體和液體之間的較高擴(kuò)散系數(shù)等特征。SFC： 以超臨界流體作流動(dòng)相，以固體吸附劑（如硅膠）或鍵合在載體（或毛細(xì)管壁）上的有機(jī)高分子聚合物作固定相的色譜方法。常用流動(dòng)相：超臨界狀態(tài)下的、氧化亞氮、乙烷、三氟甲烷等。最常用，因?yàn)樗呐R界溫度低（31）、臨界壓力適中（7.29MPa） 、無(wú)毒、便宜，但其缺點(diǎn)是極性太低，對(duì)一些極性化合物的溶解能力較差，所以，通常要用另一臺(tái)輸液泵往流動(dòng)相中添加1-5的甲醇等極性有機(jī)改性劑。色譜柱： 液相色譜的填充柱和氣相色譜的毛細(xì)管柱都可以使用，但由于超臨界流體的強(qiáng)溶解能力，所使用的毛細(xì)管填充柱的固定相必須交聯(lián)。應(yīng)用： 從理論上講，S