樣品的采集和處理

1、耕品資料第一章樣品的采集和處理1范圍本章規(guī)定了用于人免疫缺陷病毒（HIV ）檢測的全血、血清、血漿、細胞、唾液、尿液以及濾紙干1111斑（DBS ）樣品的采集和處理方法，適用于HIV抗體檢測、抗原檢測、核酸檢測、耐藥檢測,CD4+和CD8+T淋巴細胞測定和HIV分離培養(yǎng)。2規(guī)范性引用文件艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標準中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS 293-2008艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴細胞檢測質(zhì)量保證指南（試行）（中國疾病預(yù)防控 制中心，2006年2月）HIV1病毒載量測定及質(zhì)量保證指南（試行）（中國疾病預(yù)防控制中心，2008年2月）Guideli nes for Usi

2、ng HIV Test ing Tech no logies in Surveilla neeWHO/CDS/CSR/EDC/2008可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定，衛(wèi)生部第45號令2006年2月1日3樣品種類及相應(yīng)的用途3.1全血、血清、血漿、唾液、尿液以及DBS樣品可用于HIV抗體檢測3.2抗凝全血可用于CD4+和CD8+T淋巴細胞測定3.3血漿可用于HIV1病毒載量、基因型及耐藥檢測DBS樣品可用于HIV1基因型及耐藥檢測°3.4全血、血漿、淋巴細胞富集液、外周血淋巴細胞PBMC ）及DBS樣品可用于HIV核酸的定性（檢測。3.5 PBMC、全血、淋

3、巴細胞富集液等可用于HIV-1分離培養(yǎng)。4操作步驟4.1采樣前準備根據(jù)檢測項目的具體要求，確定采集樣品的種類、處理、保存及運輸?shù)臅r限和方法，按照臨床采血技術(shù)規(guī)范 的要求操作，遵守生物安全要求（參見本規(guī)范第八章實驗室生物安全）。要檢查所需物品是否已備齊，是否在有效期內(nèi)，有無破損，是否足量，特別應(yīng)檢查受檢者信息與樣品容器表 面的標記是否一致，并注明樣品采集時間。選擇合適的室內(nèi)（外）采血空間，受檢者坐（臥）于合適的位 置，準備采血用具、皮膚消毒用品、采血管及試管架、硬質(zhì)廢棄物容器等。4.1.1樣品的編碼和記錄4.1.2應(yīng)制定樣品編碼的標準操作程序（SOP），規(guī)定樣品編碼的原則和方法，為樣品制定唯一性

4、編碼（編 號），保證其唯一性。4.1.3采血前，先對裝有樣品的離心管或濾紙進行標記，核對后編碼。要將標簽貼在試管的側(cè)面，最好使用 預(yù)先印制好的、專門用于冷凍儲存的耐低溫標簽。4.1.4應(yīng)使用專門的樣品記錄本或登記表記錄樣品，同時錄入電腦保存。4.2采集和處理樣品4.2.1血液4.2.1.1抗凝全血：消毒局部皮膚，用加有抗凝劑（EDTA鈉鹽或鉀鹽、枸掾酸鈉、肝素鈉）的真空采血管抽取適量靜脈血，或用一次性注射器抽取靜脈血，轉(zhuǎn)移至加有抗凝劑的試管中，輕輕顛倒混勻6 8 次，備用。421.2末梢全血：消毒局部皮膚（成人和 1歲以上兒童可選擇耳垂、中指、無名指或食指。1歲以 下兒童采用足跟部）。用采血針

5、刺破皮膚，用無菌紗布擦掉第一滴血。收集滴岀的血液，備用。421.3血漿:將采集的抗凝全血15003000r/min離心15min，上層即為血漿，吸出置于合適的容器中，備用。421.4血清：根據(jù)需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取510ml靜脈血，室溫下自然放置1 2h，待血液凝固、血塊收縮后再用15003000r/min離心15min，吸岀血清，置于合適的容器中，備用。 4.2.1.5淋巴細胞富集液：將采集的抗凝全血15003000r/min離心15min，吸取血漿層下的淋 巴細胞富集 液，置于合適的容器中，備用。4.2.1.6 PBMC :使用淋巴細胞分離液，進行密度梯度離心，吸岀PBM

6、C層，備用。4.2.1.7根據(jù)檢測要求選用適當?shù)目鼓齽?，如CD4+和CD8+T淋巴細胞測定可選用EDTA鈉鹽或鉀鹽、枸椽酸鈉、肝素鈉，HIV病毒分離、核酸定f生/定量檢測可選用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸椽酸鈉。4.2.1.8樣品采集后處理、保存、運輸?shù)臅r限和條件，因不同的檢測項目而異，應(yīng)參見不同檢測項目要求。4.2.1.9采血完成后的穿刺針頭必須丟棄于尖銳危險品容器里，妥善處理，防止發(fā)生職業(yè)暴露。4.2.2濾紙干血斑4.2.2.1根據(jù)需要，可將采集的各種血液樣品制備成濾紙干血斑，保存、運輸及檢測。最常用的是用抗凝全 血、末梢全血和血漿制備濾紙干血斑。4.2.2.2用移液器從樣品管中吸取100讓抗凝

7、全血（或血漿）樣品，對準濾紙印圈的中心處，將樣品滴在濾紙 上，或?qū)⒋┐毯笞云つw傷口流岀的末梢全血直接滴加在濾紙印圈的中心處。4.2.2.3根據(jù)需要，連續(xù)在數(shù)個印圈上滴加樣品。4.224于室溫下自然干燥至少4小時（潮濕氣候下至少干燥24小時），不要加熱或堆疊血斑，勿與其它界 面接觸。4.225血斑充分干燥后，將其放入密封袋中，避免血斑之間的相互污染，同時放入干燥劑及濕度指示卡，密 封包裝，保存?zhèn)溆谩?.2.3尿液和唾液4.2.3.1尿液：使用清潔的容器收集尿液。女性應(yīng)避開月經(jīng)期。尿液樣品可以在28 C下存放。存放時間、是否凍存以及是否添加防腐劑以試劑盒說明書為準。4.2.3.2唾液：使用試劑盒提

8、供的容器收集唾液樣品。存放時間和是否凍存以試劑盒說明書為準。4.3樣品的保存4.3.1用于抗體和抗原檢測的血清或血漿樣品，短期（1周）內(nèi)進行檢測的可存放于28 °C, 一周以上應(yīng)存放于20 C以下。4.3.2用于核酸檢測的血漿和血細胞樣品4天內(nèi)進行檢測的可存放于4C,3個月以內(nèi)應(yīng)存放于C以下。3個月以上應(yīng)置于70 C以下。4.3.3艾滋病檢測篩查實驗室檢測的篩查陽性樣品應(yīng)及時送確證實驗室，篩查陰性樣品，可根據(jù)具體需要決 定保存時間，建議至少保存12個月。特殊用途或?qū)ｍ楉椖康臉悠犯鶕?jù)具體要求確定保存時間。4.3.4艾滋病檢測確證實驗室收到的篩查陽性樣品，無論確證結(jié)果如何，均應(yīng)將剩余的樣

9、品保存至少10年， 特殊用途或?qū)ｍ楉椖康臉悠犯鶕?jù)具體要求確定保存時間。4.4樣品的運送4.4.1應(yīng)符合生物安全要求；要獲得相應(yīng)部門批準并由具有資質(zhì)的人員專程護送。4.4.2應(yīng)采用三層容器對樣品進行包裝，隨樣品應(yīng)附有與樣品唯一性編碼相對應(yīng)的送檢單。送檢單應(yīng)標明受 檢者姓名、樣品種類等信息，并應(yīng)放置在第二層和第三層容器之間。442.1第一層容器：直接裝樣品，應(yīng)防滲漏。樣品應(yīng)置于帶蓋的試管內(nèi)，試管上應(yīng)有明顯的標記，標明樣品 的唯一性編碼或受檢者姓名、種類和采集時間。在試管的周圍應(yīng)墊有緩沖吸水材料，以免碰碎。4.4.2.2第二層容器：容納并保護第一層容器，可以裝若干個第一層容器。要求不易破碎、帶蓋、防

10、滲漏、容器的材料要易于消毒處理。4.4.2.3第三層容器：容納并保護第二層容器的運輸用外層包裝箱。外面要貼上醒目的標簽，注明數(shù)量、收樣 和發(fā)件人及聯(lián)系方式，同時要注明“小心輕放、防止日曬、小心水浸、防止重壓”等字樣，還應(yīng)易于消毒。4.424用于抗體檢測的血清和血漿樣品應(yīng)在凍存條件下運送。用于CD4+和CD8+T淋巴細胞測定的樣品應(yīng)在室溫下（1825 C）或4C （特殊要求時）運送。用于病毒載量檢測的樣品應(yīng)在20C以下運 輸。DBS樣品應(yīng)在室溫下（1825 C）運送。每一件包裝的體積以不超過50mL為宜。4.4.2.5運送樣品必須有記錄。4.4.2.6特殊情況下經(jīng)有尖部門批準可以用特快專遞郵寄樣

11、品，但必須按三層包裝，將樣品管包扎好， 嚴禁使用玻璃容器。4.5樣品的接收4.5.1樣品包裹必須在具有處理感染性材料能力的實驗室內(nèi)、由經(jīng)過培訓(xùn)的、穿戴防護衣、戴口罩、防護眼鏡的工作人員在生物安全柜中打開，用后的包裹應(yīng)及時進行消毒。4.5.2核對樣品與送檢單，檢查樣品管有無破損和溢漏。如發(fā)現(xiàn)溢漏應(yīng)立即將尚存留的樣品移岀，對樣品管 和盛器消毒，同時報告實驗室負責(zé)人和上一級實驗室技術(shù)人員。4.5.3檢查樣品的狀況，記錄有無嚴重溶血、微生物污染、血脂過多以及黃疸等情況。如果污染過重或者認 為樣品不能被接受，應(yīng)將樣品安全廢棄。并將樣品情況立即通知送樣人。4.5.4接收樣品時應(yīng)填寫樣品接收單。1樣品采集1

12、.1血清樣品采集：用注射器抽出3毫升靜脈血，室溫下自然放置 2小時待血液凝I和血塊收縮后離心15分鐘，吸岀血清備用。1 -2抗凝血樣品采集：用加有抗凝劑的真空采血管抽取靜脈血，轉(zhuǎn)移至加有抗凝劑的試管。反復(fù)輕搖。分離 血漿和血細胞備用。應(yīng)根據(jù)實驗要求選用適當?shù)目鼓齽‥DTA、肝素、枸橡酸鈉等），如需進行病毒RNA測定，應(yīng)在48小時以內(nèi)分離血漿。1.3采樣注意事項1.3.1臨床采血技術(shù)規(guī)范及試劑說明書要求進行。1.3.2注意安全，直接接觸HIV感染者或艾滋病病人血液和體液的操作應(yīng)戴雙層手套。建議采用真空采血管 及蝶形針具，以免直接接觸血液。2樣品的保存2.1用于抗體檢測的血清或血漿樣品應(yīng)存放于-

13、20 C以下，短期（1周）內(nèi)進行檢測的樣品可存放于28 °Co2.2用于抗原和核酸檢測的血漿和血細胞樣品應(yīng)凍存于-20 C以下，進行病毒RNA檢測的樣品如長期（3個月以上）保存應(yīng)置于80c。3樣品的運送3.1傳遞的樣品應(yīng)為血清或血漿，除特殊情況外一般不運送全血。樣品應(yīng)置于帶蓋的試管內(nèi)，試管上應(yīng)有明 顯的標記，標明樣品的編號或受檢者姓名、種類和采集時間。隨樣品應(yīng)附有送檢樣，送檢樣應(yīng)與標本分開， 不能混放。3.2裝入專用帶蓋的容器內(nèi)，容器的材料要易于消毒處理。在試管的周圍應(yīng)墊有緩沖吸水材料，以免碰碎。 如果路程較遠或氣候炎熱，應(yīng)在2 8 C條件下運送。用于抗體檢測的樣品可在短期內(nèi)（48小時）室溫遞送。每一包裝的體積不得超過50ml。運送感染性材料必須有記錄。3.3如需對個別樣品進行復(fù)測，可以用特快專遞形式投