20130807薄片培養(yǎng)基使用方法驗證方案要點

1、項目名稱：Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基使用方法驗證方案項目編碼：QA-F-2013-12版次：01驗證小組成員： 日期：驗證小組組長： 日期：審核人：日期：批準人： 日期：CL寅轂咨0L叩切爼臬誓6即帛蟄霧貝8即臺削Le場M冬觀9乙昶翦腆冬觀 9L肇迪中veL»iW 3va g ®<g -1. 驗證目的：通過對Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基使用方法的驗證來證明其檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)基的檢測結(jié)果相當(dāng)，可以替代傳統(tǒng)培 養(yǎng)基。2. 項目概述：Sanita-Kun是帶有無紡布的薄片狀、干燥、現(xiàn)成的微生物檢測培養(yǎng)基，由日本JNC株式會社生命化學(xué)部生產(chǎn)，其具有操作簡便，結(jié)果準確、

2、攜帶方便等特點。產(chǎn)品包括：Sanita-Kun包裝一般菌群用100張裝、1000張裝大腸桿菌菌群用100張裝、1000張裝黃色葡萄球菌用100張裝、1000張裝大腸桿菌大腸桿菌菌群用100張裝、1000張裝沙門氏菌用100張裝、1000張裝一般菌群快速型100張裝、1000張裝真菌用快速型100張裝、1000張裝3. 驗證范圍：適用于接觸碟法和棉簽取樣法檢測表面微生物以及潔凈環(huán)境沉降菌的檢測、薄膜過 濾法檢測微生物等。本次驗證僅對接觸碟法和棉簽取樣法檢測表面微生物進行驗證。4. 職責(zé)4.1. 驗證小組組長職責(zé)4.1.1保證在執(zhí)行前完成對驗證方案的審核和批準。4.1.2保證完全按照驗證方案實施。

3、4.1.3確保能及時發(fā)現(xiàn)偏差，并按照已經(jīng)達成一致偏差處理方法對其進行記錄、糾正、調(diào)查和最終確認。4.1.4驗證過程中，如有變更，保證按變更作業(yè)指導(dǎo)書執(zhí)行。4.1.5確保驗證報告的生成、審核和批準，以便對該驗證報告進行最終批準。4.2. QA驗證管理員4.2.1執(zhí)行前完成對驗證方案的審核。4.2.2負責(zé)驗證過程的監(jiān)控和檢查，保證驗證方案的實施，參與驗證結(jié)果評價。4.2.3參與驗證偏差的調(diào)查、處理、和評估。4.2.4驗證過程中，如有變更，保證按變更作業(yè)指導(dǎo)書執(zhí)行。4.3. QC檢驗員職責(zé)4.3.1. 嚴格按照標準操作規(guī)程進行操作驗證儀器4.3.2. 嚴格按照檢驗標準操作規(guī)程進行檢測4.3.3. 及

4、時準確出具檢測報告。第2頁共13頁4.4其它成員職責(zé)441執(zhí)行前確認驗證方案已批準，并經(jīng)過培訓(xùn)。4.4.2按驗證方案實施驗證，收集、整理驗證數(shù)據(jù)，完成驗證記錄和報告。4.4.3參與驗證偏差的調(diào)查和處理，確認通過偏差修訂和解決方案。4.4.4確認驗證過程中的變更在實施前已經(jīng)批準。4.5驗證小組成員名單：5. 驗證前確認5.1. 驗證設(shè)備及文件的確認：檢查所有可用的和操作相關(guān)的作業(yè)指導(dǎo)書，文檔和手冊。檢查結(jié)果見附件1：5.2. 相關(guān)儀器、儀表的校驗：檢查檢測用的儀器儀表具有有效的校驗證，匯總儀表的校驗合格信息，并付上校驗合格證的附件。檢查結(jié)果見附件2：5.3. 相關(guān)人員的培訓(xùn)：設(shè)備操作及維修人員均

5、接受適當(dāng)相關(guān)文檔的培訓(xùn)，培訓(xùn)的內(nèi)容、學(xué)員、教師應(yīng)記錄歸檔。檢查結(jié)果見附件3：6驗證內(nèi)容6.1菌種試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保 證試驗菌株的生物學(xué)特性。本次驗證所使用的菌種包括：大腸埃希菌CMCC(B)44 102金黃色葡萄球菌CMCC(B)26 003枯草芽抱桿菌CMCC(B)63 501白色念珠菌CMCC(F)98 001黑曲霉CMCC(F)98 003確認人： 復(fù)核人： 日期：日期：6.2菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18 24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬

6、丁培 養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 24 48小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液 制成每1ml含菌數(shù)為50 100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜 面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)57天，加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將 第2頁共13頁 抱子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯的0.9% 無菌氯化鈉溶液制成的每1ml含抱子數(shù)50 100cfu的抱子懸液。菌液制備后室內(nèi)放置應(yīng)在2小時內(nèi)使用；若2-8 °C保存可在24小時內(nèi)使用菌液名稱制備數(shù)量制備日期大腸埃希菌懸液金黃色葡萄球菌懸液枯草芽抱桿菌懸液

7、白色念珠菌懸液黑曲霉抱子懸液確認人： 復(fù)核人： 日期：日期：6.3棉簽取樣法驗證6.3.1細菌檢查：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各0.5ml(25 50cfu),使其分別均勻涂布于5cm*5cm潔凈無菌的玻璃板上面，待表面干燥后 按照表面微生物監(jiān)測作業(yè)指導(dǎo)書BD-WI-QO-020進行棉簽取樣，并將棉簽插入裝有6ml 無菌水的試管中，充分震蕩，以釋放微生物至無菌水中，最后每個樣品用玻璃注射器吸取 1ml接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和 Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基上，每株試驗菌平行制備 2個皿， 混勻，凝固，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置30-35 C培養(yǎng)48小時，計數(shù)；Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基

8、(一 般菌群用)35 C培養(yǎng)48小時；Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基(一般菌群快速型)35 C培養(yǎng)24小時。 取樣數(shù)量見下表：傳統(tǒng)培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2一般菌群用1一般菌群用2一般菌群快速型1一般菌群快速型2大腸埃希菌4-8cfu1ml1ml1ml1ml1ml1ml陰性對照1ml金黃色葡萄球菌4-8cfu1ml1ml1ml1ml1ml1ml陰性對照1ml枯草芽抱桿 菌4-8cfu1ml1ml1ml1ml1ml1ml陰性對照1ml6.3.2霉菌和酵母菌檢查：取白色念珠菌、黑曲霉各 0.5ml(25 50cfu),使其分別

9、 均勻涂布于5cm*5cni吉凈無菌的玻璃板上面，待表面干燥后按照表面微生物監(jiān)測作業(yè)指 導(dǎo)書BD-WI-QO-020進行棉簽取樣，并將棉簽插入裝有 6ml無菌水的試管中，充分震蕩, 以釋放微生物至無菌水中，最后每個樣品用玻璃注射器吸取1ml接種于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基上，每株試驗菌平行制備2個皿，混勻，凝固，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置23-28 C培養(yǎng)72小時；Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基（真菌快速型） 25°C培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取樣數(shù)量見下表：傳統(tǒng)培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 1玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 2真菌用快速型1真菌用快速型2白

10、色念珠菌4-8cfu1ml1ml1ml1ml陰性對照1ml黑曲霉4-8cfu1ml1ml1ml1ml陰性對照1ml6.3.3酵母菌檢查：取白色念珠菌0.5ml（25 50cfu），使其分別均勻涂布于 5cm*5cm 潔凈無菌的玻璃板上面，待表面干燥后按照表面微生物監(jiān)測作業(yè)指導(dǎo)書BD-WI-Q0-020 進行棉簽取樣，并將棉簽插入裝有6ml無菌水的試管中，充分震蕩，以釋放微生物至無菌 水中，最后每個樣品用玻璃注射器吸取 1ml接種于酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基上，每株試驗菌平行制備 2個皿，混勻，凝固，酵母浸出粉胨葡 萄糖瓊脂培養(yǎng)基置23-28 C培養(yǎng)72小時，S

11、anita-Kun薄片培養(yǎng)基（真菌快速型）25C培 養(yǎng)48小時，計數(shù)；取樣數(shù)量見下表：傳統(tǒng)培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基酵母浸岀粉胨葡萄糖 瓊脂培養(yǎng)基1酵母浸岀粉胨葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基2真菌用快速型1真菌用快速型2白色念珠菌4-8cfu1ml1ml1ml1ml陰性對照1ml634按上述方法連續(xù)操作三次并計算每次菌落平均值和回收率6.3.5判定標準若Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均數(shù)的回收率（Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均值 占傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值百分率）在 70% 130%以內(nèi)，貝U判斷Sanita-Kun薄片培養(yǎng) 基的檢測結(jié)果符合規(guī)定。6.3.6檢測結(jié)果見下表：表一：細

12、菌檢測結(jié)果傳統(tǒng)培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2一般菌群用1一般菌群用2一般菌群快速型1一般菌群快速型2大腸埃希菌14-8cfu陰性對照平均值回收率金黃色葡萄球菌14-8cfu陰性對照平均值回收率枯草芽孢桿菌14-8cfu陰性對照平均值回收率大腸埃希菌24-8cfu陰性對照平均值回收率金黃色葡萄球菌24-8cfu陰性對照平均值回收率枯草芽抱桿菌24-8cfu陰性對照平均值回收率大腸埃希菌34-8cfu陰性對照平均值回收率金黃色葡萄球菌34-8cfu陰性對照平均值回收率枯草芽抱桿4-8cfu菌3陰性對照平均值回收率回收率=（Sani

13、ta-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均值/傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值）x 100% 表二：霉菌和酵母菌檢測結(jié)果傳統(tǒng)培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基玫塊紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 1玫塊紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 2真菌用快速型1真菌用快速型2曰色念珠菌 14-8cfu陰性對照平均值回收率黑曲霉14-8cfu陰性對照平均值回收率白色念珠菌24-8cfu陰性對照平均值回收率黑曲霉24-8cfu陰性對照平均值回收率白色念珠菌34-8cfu陰性對照平均值回收率黑曲霉34-8cfu陰性對照平均值回收率回收率=（Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均值/傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值）x 100% 表三：酵母菌檢測結(jié)果第7頁共13頁傳統(tǒng)培養(yǎng)

14、基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基酵母浸岀粉胨匍萄糖 瓊脂培養(yǎng)基1酵母浸岀粉胨匍萄 糖瓊脂培養(yǎng)基2真菌用快速型1真菌用快速型2白色念珠菌14-8cfu陰性對照平均值回收率白色念珠菌24-8cfu陰性對照平均值回收率白色念珠菌34-8cfu陰性對照平均值回收率回收率=（Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均值/傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值）x 100%637棉簽取樣法驗證總結(jié)：確認人： 復(fù)核人： 日期：日期：6.4接觸碟取樣法檢查6.4.1細菌檢查：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌各0.5ml（25 50cfu）,使其分別均勻涂布于5cm*5cm潔凈無菌的玻璃板上面，待表面干燥后 按照表面微

15、生物監(jiān)測作業(yè)指導(dǎo)書 BD-WI-QO-020進行表面接觸碟法（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基） 取樣，同時使用Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基取樣（按照Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基說明書先滴加 1.0ml滅菌稀釋液并靜放10分鐘以上），每株試驗菌平行制備 2個皿，混勻，凝固，營 養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置30-35 C培養(yǎng)48小時，計數(shù)；Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基（一般菌群用）35 C 培養(yǎng)48小時；Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基（一般菌群快速型）35 °C培養(yǎng)24小時。6.4.2霉菌和酵母菌檢查：取白色念珠菌、黑曲霉各0.5ml（25 50cfu）,使其分別均勻涂布于5cm*5cni吉凈無菌的玻璃板上面，

16、待表面干燥后按照表面微生物監(jiān)測作業(yè)指 第 7頁共13頁 導(dǎo)書BD-WI-QO-02C進行表面接觸碟法（玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）取樣，同時使用Sanita-Kun 薄片培養(yǎng)基取樣（按照Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基說明書先滴加1.0ml滅菌稀釋液并靜放10 分鐘以上），每株試驗菌平行制備2個皿，混勻，凝固，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置23-28 C 培養(yǎng)72小時；Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基（真菌快速型）25C培養(yǎng)48小時，計數(shù)；6.4.3酵母菌檢查：取白色念珠菌0.5ml（25 50cfu），使其分別均勻涂布于 5cm*5cm 潔凈無菌的玻璃板上面，待表面干燥后按照表面微生物監(jiān)測作業(yè)指導(dǎo)書BD-WI-Q

17、O-020 進行表面接觸碟法（酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）取樣，同時使用Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基取樣（按照Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基說明書先滴加1.0ml滅菌稀釋液并靜放10分鐘 以上），每株試驗菌平行制備2個皿，混勻，凝固，酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基置 23-28 C培養(yǎng)72小時，Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基（真菌快速型）25°C培養(yǎng)48小時，計數(shù)；6.4.4按上述方法連續(xù)操作三次并計算每次菌落平均值和回收率6.4.5判定標準若Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均數(shù)的回收率（Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均值 占傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值百分率）在 70% 1

18、30%以內(nèi)，貝U判斷Sanita-Kun薄片培養(yǎng) 基的檢測結(jié)果符合規(guī)定。6.4.6 檢測結(jié)果見下表:表一：細菌檢測結(jié)果傳統(tǒng)培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基2一般菌群用1一般菌群用2一般菌群快速型1一般菌群快速型2大腸埃希菌1陰性對照平均值回收率金黃色葡萄球菌1陰性對照平均值回收率枯草芽抱桿菌1陰性對照平均值回收率大腸埃希菌2陰性對照平均值回收率金黃色葡萄球菌2陰性對照平均值回收率枯草芽孢桿菌2陰性對照平均值回收率大腸埃希菌3陰性對照平均值回收率金黃色葡萄3球菌陰性對照平均值回收率枯草芽抱桿菌3陰性對照平均值回收率回收率=（Sani

19、ta-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均值/傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值）x 100% 表二：霉菌、酵母菌檢測結(jié)果傳統(tǒng)培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基1玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基2真菌用快速型1真菌用快速型2白色念珠菌1陰性對照平均值回收率黑曲霉1陰性對照平均值回收率白色念珠菌2陰性對照平均值回收率黑曲霉2陰性對照平均值回收率白色念珠菌3陰性對照平均值回收率黑曲霉3陰性對照平均值回收率回收率=（Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均值/傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值）x 100% 表三：酵母菌檢測結(jié)果傳統(tǒng)培養(yǎng)基Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基酵母浸岀粉胨葡萄糖 瓊脂培養(yǎng)基1酵母浸岀粉胨葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基2真菌用快速型1真菌用快速型2白色念珠菌1陰性對照平均值回收率白色念珠菌2陰性對照平均值回收率白色念珠菌3陰性對照第10頁共13頁平均值回收率回收率=（Sanita-Kun薄片培養(yǎng)基菌落平均值/傳統(tǒng)培養(yǎng)基菌落數(shù)的平均值）x 100%647接觸碟取樣法驗證結(jié)論：確認人： 復(fù)核人： 日期：日期：7. 偏差7.1不