食品酶學(xué)復(fù)習(xí)資料

1、緒論1酶學(xué)（Enzymology）是研究酶的性質(zhì)、酶的反應(yīng)機(jī)理、酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制、酶的生物學(xué)功能及酶的應(yīng)用的科學(xué) 。酶的定義：具有生物催化功能的生物大分子，可以分為蛋白類酶（P酶）和核酸類酶（R酶）兩大類別。2什么是酶工程？酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的技術(shù)過程食品酶學(xué)：酶工程與食品生物技術(shù)相結(jié)合而形成的一門應(yīng)用性很強(qiáng)的學(xué)科。食品酶學(xué)主要內(nèi)容： 包括酶的基本知識(shí)，酶的分離與純化以及酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用等內(nèi)容。食品酶學(xué)主要任務(wù)： 講授酶學(xué)基本理論，酶的分離與純化以及酶在食品加工和保藏中的應(yīng)用等內(nèi)容。3米氏方程：表示一個(gè)酶促反應(yīng)的起始速度與底物濃度關(guān)系的速度方程。這個(gè)方程稱為Michaelis-Menten方

2、程，是在假定存在一個(gè)穩(wěn)態(tài)反應(yīng)條件下推導(dǎo)出來的，其中  值稱為米氏常數(shù)，  是酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，  為底物濃度。當(dāng)  時(shí)， ，Km等于酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值一半時(shí)的底物濃度。4酶與底物結(jié)合形成中間絡(luò)合物的理論1. 鎖鑰假說：認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣。2. 誘導(dǎo)契合假說：該學(xué)說認(rèn)為酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀.3. 酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制“操縱子學(xué)說”5酶的特點(diǎn)：催化效率高、專一性強(qiáng)

3、、反應(yīng)條件溫和、酶的活性是受調(diào)節(jié)控制絕對(duì)專一性： 指一種酶只能催化一種底物進(jìn)行反應(yīng)，這種高度的專一性稱為絕對(duì)專一性。相對(duì)專一性： 一種酶能催化一類結(jié)構(gòu)相似的底物進(jìn)行某種相同類型的反應(yīng)，這種專一性稱為相對(duì)專一性。6酶的系統(tǒng)名稱由兩部分組成：底物+反應(yīng)類型7酶分為六類：氧化還原酶類、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構(gòu)酶類、合成酶類1) 氧化還原酶（oxidoreductases）：催化底物的氧化或還原，而不是基團(tuán)的加成或者去除，反應(yīng)時(shí)需要電子的供體或受體。2) 轉(zhuǎn)移酶（Transferase）催化功能團(tuán)從一個(gè)底物向另一個(gè)轉(zhuǎn)移。3) 水解酶（Hydrolase）催化底物的水解反應(yīng)。4) 裂合酶（Ly

4、ase）能催化底物分子開裂成兩部分，其中之一含有雙鍵。這類酶催化反應(yīng)都是可逆的。開裂點(diǎn)可以是碳碳、碳氧或碳氮鍵。5) 異構(gòu)酶（Isomerase）催化底物的分子內(nèi)重排反應(yīng)，特別是構(gòu)型的改變和分子內(nèi)的氧化還原。6) 合成酶（Ligase）能將兩個(gè)底物連接成一個(gè)分子，在反應(yīng)時(shí)由ATP或其他高能的核苷三磷酸供給反應(yīng)所需的能量。8酶活力定義：是指酶催化反應(yīng)的能力，它表示樣品中酶的含量。酶活力通常以在最適條件下酶所催化的化學(xué)反應(yīng)的速度來確定。酶活力單位：用來表示酶活力的高低。在標(biāo)準(zhǔn)條件下（指溫度25，以及最適底物濃度、最適緩沖液離子強(qiáng)度和pH）1min內(nèi)催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為該酶的一個(gè)活力單

5、位。這個(gè)單位稱為酶的國(guó)際單位（IU, international unit ）酶的總活力：樣品的全部酶活力。 。總活力= 比活力 × 總體積（ml）或 = 比活力×總質(zhì)量（g）比活力: 指每毫克蛋白質(zhì)所含酶活力的單位數(shù)（單位/毫克蛋白）。比活力是酶純度指標(biāo)，比活力愈高表示酶愈純。酶的發(fā)酵生產(chǎn)固體培養(yǎng)發(fā)酵：培養(yǎng)基以麩皮、米糠等為主要原料，加入其他必要的營(yíng)養(yǎng)成分，制成固體或半固體的麩曲，經(jīng)滅菌、冷卻后，接入產(chǎn)酶菌株，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵。1固定化細(xì)胞：（又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。） 指采用各種方法將細(xì)胞固定在水不溶性的載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝的

6、細(xì)胞。固定化細(xì)胞發(fā)酵具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：（1） 提高產(chǎn)酶能力：固定化細(xì)胞的密度較高，反應(yīng)器水平的生產(chǎn)強(qiáng)度較大，可提高生產(chǎn)能力；（2） 穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用：發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以連續(xù)使用較長(zhǎng)的時(shí)間，易于連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)；（3） 提高設(shè)備利用率：細(xì)胞固定在載體上，流失較少，可在高稀釋率的情況下連續(xù)發(fā)酵，大大提高設(shè)備利用率；（4） 產(chǎn)品易分離純化：發(fā)酵液中含菌體較少，利于產(chǎn)品分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等。固定化細(xì)胞發(fā)酵的缺點(diǎn)：歷史不長(zhǎng)；技術(shù)要求較高（需要特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器）；只適用于胞外酶的生產(chǎn)，還存在不少問題待解決。固定化方法：吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法、交聯(lián)法、包埋法、熱處理法等。特點(diǎn)：1提高產(chǎn)酶率； 2

7、.可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間； 3基因工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失；4 . 發(fā)酵穩(wěn)定性好；5縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率；6產(chǎn)品容易分離純化；7適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)2發(fā)酵產(chǎn)酶的細(xì)胞必需具備的條件：（1）酶的產(chǎn)量高。高產(chǎn)細(xì)胞可以通過篩選、誘變、或采用基因工程、細(xì)胞工程等技術(shù)而獲得。（2）容易培養(yǎng)和管理。要求產(chǎn)酶細(xì)胞容易生長(zhǎng)繁殖，并且適應(yīng)性較強(qiáng)，易于控制，便于管理。（3）產(chǎn)量穩(wěn)定性好。能夠穩(wěn)定用于生產(chǎn)，不易退化。 （4）利于酶的分離純化。產(chǎn)酶細(xì)胞及雜質(zhì)易于和酶分離。（5）安全可靠，無毒性。細(xì)胞及代謝物安全無毒，不會(huì)影響生產(chǎn)人員和環(huán)境，也不會(huì)對(duì)酶的應(yīng)用產(chǎn)生不良影響。3常用的產(chǎn)酶微生物：枯草芽

8、孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、青霉、鏈霉菌、啤酒酵母大腸埃希氏菌（Escherichia coli）大腸桿菌，簡(jiǎn)稱E.coli 革蘭氏陰性菌枯草芽孢桿菌 革蘭氏陽(yáng)性菌革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色4誘變的方法有：物理誘變（紫外線、X-射線、-射線、快中子等）； 化學(xué)誘變；生物學(xué)；復(fù)合誘變；空間技術(shù)誘變。5培養(yǎng)基：指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組分一般包括碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長(zhǎng)因素，產(chǎn)酶促進(jìn)劑，阻遏劑等。碳源：指能夠向微生物提供組成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物（酶）中碳骨架的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?？梢宰鳛槲⑸锾荚吹奈镔|(zhì)很多（糖類）如葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜等；各種淀粉類農(nóng)作

9、物，如山芋粉、玉米粉、麩皮、米糠等石油中的各種烷烴、甲烷等含碳?xì)湓氐幕衔?；乙醇、乙酸等有機(jī)醇、酸類，也可作為碳源。碳源的選擇：考慮對(duì)酶生物合成的影響；根據(jù)微生物營(yíng)養(yǎng)要求的不同來選擇；原料的供求情況及經(jīng)濟(jì)實(shí)用性；常用碳源：淀粉及其水解物等。6pH的調(diào)節(jié)控制pH變化原因：不同細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖最適pH；發(fā)酵產(chǎn)酶最適pH；調(diào)控pH可改變各種酶間的產(chǎn)量比例；細(xì)胞代謝引起pH變化。pH調(diào)控方法：改變培養(yǎng)基組分或比例；使用緩沖溶液穩(wěn)定pH；添加適宜的酸、堿溶液。7溫度的調(diào)節(jié)控制溫度變化原因：不同微生物的最適生長(zhǎng)溫度有差別；產(chǎn)酶最適溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)最適溫度有所不同。調(diào)控方法：生產(chǎn)中常采用分段控溫技術(shù)；溫度調(diào)節(jié)一

10、般采用熱水升溫、冷水降溫方法。8控制阻遏物濃度：有些酶的生物合成受到某些阻遏物的阻遏作用，結(jié)果導(dǎo)致該酶的合成受阻或者產(chǎn)酶量降低。為了提高酶產(chǎn)量，必須設(shè)法解除阻遏物引起的阻遏作用。例如：-半乳糖苷酶受葡萄糖引起的分解代謝物阻遏作用。在培養(yǎng)基中存在葡萄糖時(shí)，即使有誘導(dǎo)物存在，-半乳糖苷酶也無法大量生成。只有在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中或者培養(yǎng)基中葡萄糖被細(xì)胞利用完以后，誘導(dǎo)物的存在才能誘導(dǎo)該酶大量生成。9通過動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)下列功能蛋白質(zhì)：醫(yī)學(xué)(1) 疫苗：脊髓灰質(zhì)炎（小兒麻痹癥）疫苗、牲畜口蹄疫疫苗、風(fēng)疹疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、黃熱病疫苗、狂犬病疫苗、肝炎疫苗等。(2) 激素：催乳激素、生

11、長(zhǎng)激素、前列腺素、促腺性激素、淋巴細(xì)胞激素、紅細(xì)胞生成素、促濾泡素、胰島素等。(3) 多肽生長(zhǎng)因子：神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、纖維黏結(jié)素(4) 酶：膠原酶、纖維酶原活化劑、尿激酶等。(5) 單克隆抗體：通過雜交瘤細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)各種單克隆抗體。(6) 非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激因子等。酶的分離與純化1. 氨基酸分類：l 非極性氨基酸（疏水氨基酸）8種 丙氨酸（Ala）纈氨酸（Val）亮氨酸（Leu）異亮氨酸（Ile）脯氨酸（Pro）苯丙氨酸（Phe） 色氨酸（Trp）蛋氨酸（Met） l 極性氨基酸（親水氨基酸）： 極性不帶電荷：7種 甘氨酸（G

12、ly）絲氨酸（Ser）蘇氨酸（Thr）半胱氨酸（Cys）酪氨酸（Tyr）天冬酰胺（Asn）谷氨酰胺（Gln） 極性帶正電荷的氨基酸（堿性氨基酸） 3種 賴氨酸（Lys）精氨酸（Arg）組氨酸（His） 極性帶負(fù)電荷的氨基酸（酸性氨基酸） 2種 天冬氨酸（Asp）谷氨酸（Glu） .氨基酸名稱及簡(jiǎn)寫：甘氨酸 Glycine Gly G 丙氨酸 Alanine Ala A 纈氨酸 Valine Val V 亮氨酸 Leucine Leu L 異亮氨酸 Isoleucine Ile I 脯氨酸 Proline Pro P 苯丙氨酸 Phenylalanine Phe F 酪氨酸 Tyrosine T

13、yr Y 色氨酸 Tryptophan Trp W 絲氨酸 Serine Ser S 蘇氨酸 Threonine Thr T 半胱氨酸 Cystine Cys C 蛋氨酸 Methionine Met M 天冬酰胺 Asparagine Asn N 谷氨酰 Glutarnine Gln Q 天冬氨酸 Asparticacid Asp D 谷氨酸 Glutamicacid Glu E 賴氨酸 Lysine Lys K 精氨酸 Arginine Arg R 組氨酸 Histidine His H2連接方式：肽鍵 磷酸二酯鍵 糖苷鍵3乳糖操縱子：4.細(xì)胞破碎：細(xì)胞破碎是通過各種方法使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞

14、的技術(shù)過程。為什么細(xì)菌細(xì)胞不易破碎：5.細(xì)胞破碎方法： 機(jī)械破碎法 化學(xué)破碎法 酶促破碎法 物理破碎法通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用使組織細(xì)胞破碎的方法，稱為物理破碎法。物理破碎法多用于微生物細(xì)胞的破碎溫度差破碎法 超聲波破碎法 壓力差破碎法6.相對(duì)離心力（RCF）是指顆粒所受到的離心力與地心引力之比值。RCF表示為：RCF = F c /F g = 1.12×10 -5 . n 2 . rF c ：離心力 F g ：地心引力n：轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min） r：旋轉(zhuǎn)半徑（cm）離心力的大小與轉(zhuǎn)速的平方以及旋轉(zhuǎn)半徑成正比。在轉(zhuǎn)速一定的條件下，顆粒距離離心軸越遠(yuǎn)，其所受的離心

15、力越大。在離心過程中，隨著顆粒在離心管中移動(dòng)，其所受到的離心力也在變化。一般離心力的數(shù)據(jù)是指其平均值，即在離心溶液中點(diǎn)處顆粒所受的離心力。78. 微濾，超濾，反滲透9.等電點(diǎn)沉淀法：利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法。原理特點(diǎn) 溶液的pH值等于溶液中某兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該兩性電解質(zhì)分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下來。 由于在等電點(diǎn)時(shí)兩性電解質(zhì)分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物質(zhì)仍有一定的溶解度，從而使沉淀不完全。所以在實(shí)際使用時(shí)，等電點(diǎn)沉淀法

16、往往與其他方法一起使用。 在酶的沉淀分離中，等電點(diǎn)沉淀法經(jīng)常與鹽析沉淀、有機(jī)溶劑沉淀和復(fù)合沉淀等一起使用。有時(shí)單獨(dú)使用主要是用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。 在加酸或加堿調(diào)節(jié)pH值的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加進(jìn)，以防止局部過酸或過堿而引起酶的變性失活。10.層析分離： 又稱為色譜分離法，是利用混合液中各組分的理化性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同比例分布在兩相中。其中一個(gè)相是固定的，稱為固定相；另一個(gè)相是流動(dòng)的，稱為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，從而使不同的組分分離純化。 層次分離法是近40年來研究開

17、發(fā)的用以分離酶等生物活性蛋白質(zhì)以及多肽、核酸、多糖等生物大分子物質(zhì)的一種新技術(shù)。11.層析分離的優(yōu)缺點(diǎn)： 色譜分離法的優(yōu)點(diǎn)：分離效率高，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，條件溫和，不易造成物質(zhì)變性等優(yōu)點(diǎn)，操作方法和條件的多樣性使色譜分離能適用于多種物質(zhì)的提純。 色譜分離法的缺點(diǎn)：處理量小，操作周期長(zhǎng)，不能連續(xù)操作，因此主要用于實(shí)驗(yàn)室中。12根據(jù)分離的機(jī)理，色譜法可以分為： 吸附色譜法利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離； 分配色譜法利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同而使各組分分離； 離子交換色譜法利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的； 凝膠色譜法以各種

18、多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離； 親和色譜法利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化； 層析聚焦法將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離。13.離子交換層析： 離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。 離子交換劑：含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)，通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。14凝膠層析定義：又稱分子篩層析、凝膠過濾或分子排阻層析，是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各

19、種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠種類： 葡聚糖凝膠 瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠原理：層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，各組分在層析柱內(nèi)同時(shí)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng)。一種是隨著溶液流動(dòng)而進(jìn)行的垂直向下的移動(dòng)，另一種是無定向的分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)）。 大分子物質(zhì)由于分子直徑大， 不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。 較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分。15.親和層析定義：是近幾年發(fā)展起來的并有效地應(yīng)用于分離純化生

20、物活性大分子的一種新技術(shù)。利用生物分子與配基之間所具有的可逆的親和力，使生物分子分離純化的層析技術(shù)?；驹恚豪蒙锓肿娱g酶與輔酶、酶與底物、抗原與抗體、激素與受體等具有較高專一性且能可逆形成酶-配基絡(luò)合物。將這類配基(Ligand） 偶聯(lián)固定于待分離純化系統(tǒng)的溶液中，便可從中把待分離純化的目的物質(zhì)“抓”出來。配基條件：（1） 配基與酶要有較強(qiáng)的親和力。 因?yàn)槲胶拖疵摱加蛇@種力來決定。若要純化某種酶，則要加入對(duì)此酶有專一親和力的物質(zhì)，如底物類似物、抑制劑、輔助因子、效應(yīng)劑、輔酶等。（2） 配基本身應(yīng)具有供偶聯(lián)固定用的活潑基團(tuán)，同時(shí)與載體結(jié)合后，不應(yīng)影響或破壞配基與酶間的相互作用。（3） 配

21、基應(yīng)具有一定的偶聯(lián)量。 其配基偶聯(lián)量過高或過低均不適宜，前者可造成洗脫困難，也會(huì)造成空間障礙和非專一性吸附，后者分離效果不佳。一般配基偶聯(lián)量 1-20mol/mL膨潤(rùn)膠較為合適。16.酶的結(jié)晶方法： 酶在結(jié)晶時(shí)，酶液應(yīng)達(dá)到一定的濃度。濃度太低則無法析出結(jié)晶。 一般來說，酶的濃度越高，就越容易結(jié)晶。但濃度過高時(shí)，會(huì)形成許多小晶核，結(jié)晶小，不易長(zhǎng)大。故此結(jié)晶時(shí)應(yīng)控制好酶液濃度。 在結(jié)晶過程中還要控制好溫度、 pH值、離子強(qiáng)度等結(jié)晶條件。 酶結(jié)晶的方法多種多樣。其主要目的是為了使母液中酶的溶解度慢慢降低，使處于稍微過飽和狀態(tài)，而使酶析出結(jié)晶。酶的分子修飾與模擬1.酶的分子修飾： 通過各種方法使酶分子

22、的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。2.天然酶在應(yīng)用中的限制因素：§ 容易變性失效： 一般經(jīng)不起高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑及時(shí)間等的考驗(yàn)；§ 作為異體蛋白在體內(nèi)難于吸收、易引起免疫反應(yīng)和被識(shí)別降解；§ 酶的活性、作用專一性和最適條件不一定能適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)工藝要求。3.核苷酸鏈剪切修飾：在核苷酸鏈的限定位點(diǎn)進(jìn)行剪切，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法。4.氨基酸置換修飾：將酶分子肽鏈上的某一個(gè)氨基酸置換成另一個(gè)氨基酸，則會(huì)引起酶蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的催化特性和功能的修飾方法。v 通過氨基酸置換修飾，可

23、以提高酶的催化效率、 增加酶的穩(wěn)定性以及改變酶的催化專一性，更有利于酶的應(yīng)用。v 氨基酸置換修飾可以用化學(xué)修飾法進(jìn)行。但現(xiàn)在常用的是 定點(diǎn)突變技術(shù)。l 寡核苷酸引物指導(dǎo)的定點(diǎn) 突變( (Kunkelsmethod) )原理：體利用噬菌體M13 的單鏈化與雙鏈化互變。優(yōu)點(diǎn)：很好的普適性，可改變、添加或刪除原基因中的核苷酸或核苷酸片段5. 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)（注意化學(xué)鍵、結(jié)合鍵）：酶的固定化1、 酶的固定化方法：通常采用的固定化方法可大體概括為： 吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法和熱處理法等。2、 共價(jià)結(jié)合法：特點(diǎn)：p 優(yōu)點(diǎn)： 酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。p 缺點(diǎn)： 反應(yīng)條件較激烈，

24、易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。3、 交聯(lián)法：定義：利用雙功能或多功能試劑在酶分子間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，制備固定化酶的方法。常用試劑：戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等雙功能試劑。特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 操作簡(jiǎn)便，結(jié)合牢固，可長(zhǎng)時(shí)間使用。p 缺點(diǎn)： 交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，且制成的固定化酶顆粒較小，機(jī)械強(qiáng)度也較低。4、 包埋法：v 定義：將酶包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。常用載體：瓊脂、海藻酸鈉（CaCl2）、卡拉膠、明膠、聚丙烯酰胺、火棉膠等。根據(jù)載體材料和方法的不同，包埋法可分為：凝膠包埋法、半透膜（微膠囊）包埋法。特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：條件較溫和，操作

25、簡(jiǎn)便，對(duì)酶活性影響較?。籶 缺點(diǎn)：不利于大分子底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散進(jìn)出。凝膠包埋法：5 、熱處理法v 定義：將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)而制得。v 特點(diǎn)：只適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化。p 熱處理時(shí)，要嚴(yán)格控制好加熱溫度和時(shí)間，以免引起酶的變性失活。v 例如：鏈霉菌細(xì)胞中葡萄糖異構(gòu)酶的固定化，可采用6065下處理15min，葡萄糖異構(gòu)酶將全部固定在菌體內(nèi)。6、 固定化酶的性質(zhì)：1、穩(wěn)定性提高 2、最適溫度3、最適 Ph 4、底物特異性5、活性：通常是降低的最適pH：載體性質(zhì)對(duì)最適pH值的影響：p 載體帶負(fù)電荷，則制得的固定酶最適pH向堿性一側(cè)偏移；p 載體帶正電荷，則

26、制得的固定酶最適pH向酸性一側(cè)偏移；p 載體不帶電，則制得的固定酶最適pH一般不改變。產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)最適pH值的影響（考慮載體對(duì)產(chǎn)物的擴(kuò)散阻礙）：p 產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適pH要比游離酶高一些；p 產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶的最適pH要比游離酶低一些；p 產(chǎn)物為中性時(shí)，最適pH一般不改變。7、 細(xì)胞固定化：通過各種方法將細(xì)胞與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過程。固定化細(xì)胞： 固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞。固定化細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，所以又稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞都可以制成固定化細(xì)胞。酶反應(yīng)器1、 常

27、見的酶反應(yīng)器類型：按結(jié)構(gòu)區(qū)分 攪拌罐式反應(yīng)器(Stirred Tank Reactor, STR) 鼓泡式反應(yīng)器(Bubble Column Reactor, BCR) 填充床式反應(yīng)器(Packed Bed Reactor, PBR) 流化床式反應(yīng)器(Fluidized Bed Reactor, FBR) 膜反應(yīng)器(Membrane Reactor, MR)按操作方式區(qū)分 分批式反應(yīng)(batch) 連續(xù)式反應(yīng)(continuous)混合形式 連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器(Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR) 分批攪拌罐反應(yīng)器(Batch Stirred Tank R

28、eactor, BSTR)2、 各種酶反應(yīng)器的特點(diǎn)（了解）：酶的工業(yè)應(yīng)用1、 酶在食品工業(yè)方面的應(yīng)用（了解）制糖工業(yè) 酶法生產(chǎn)葡萄糖 過去國(guó)內(nèi)外葡萄糖生產(chǎn)通常采用酸法水解，現(xiàn)在大都采用酶法。 原料：淀粉。 酶：-淀粉酶和糖化酶。都要求達(dá)到一定純度，尤其是糖化酶中應(yīng)不含葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶。通常使用游離酶分批方式，也可采用固定化糖化酶進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。 工藝流程：果葡糖漿的生產(chǎn) 果葡糖漿是由葡萄糖異構(gòu)酶催化葡萄糖異構(gòu)化生成部分果糖而得到的混合糖漿。由于甜度提高，可減少用量，且攝取果糖后血糖不易升高，有一定保健功能。 原料：葡萄糖，一般由淀粉通過酶法水解制得。但需經(jīng)過層析等方法精制后使用。 酶：葡萄糖異構(gòu)酶

29、。最適pH可由于來源不同而有所差別；溫度不宜超過70。 高果糖漿：通常果葡糖漿含果糖42%左右，若將其中的葡萄糖與果糖分離，將分離出的葡萄糖再進(jìn)行異構(gòu)化，如此反復(fù)，可得到果糖含量達(dá)70%、 90%甚至更高的糖漿，稱為高果糖漿。酶與食品安全1、 酶作用產(chǎn)生有毒的和不利于健康的物質(zhì)： 在生物材料中，酶和底物處在細(xì)胞的不同部位，僅當(dāng)生物材料破碎時(shí)，酶和底物的相互作用才有可能發(fā)生。 其次，濕度、 pH、溫度、輔酶和金屬離子等條件也是重要的。 有時(shí)底物本身是無毒的，在經(jīng)酶催化降解后變成有害物質(zhì)。例如：木薯含有生氰糖苷，雖然它本身并無毒，但是在內(nèi)源糖苷酶的作用下，產(chǎn)生氫氰酸2、 酶作用導(dǎo)致食品中營(yíng)養(yǎng)組分的損失：雖然在食品加工中營(yíng)養(yǎng)組分的損失大多是由于非酶作用所引起的，但是食品材料中一些酶的作用也是不能忽視的。例如：脂肪氧化酶催化胡蘿卜素降解而使面粉漂白，顯然，此酶在其他食品中也存在。例如：一些蔬菜的加工過程中也參與了胡蘿卜素的破壞過程。在蔬菜凍結(jié)前的熱燙能有效地破壞它所含有的脂肪氧合酶。在食品加工過程中維生素B的損失，也有例子可以說明酶參與了維生素B的破壞過程。例如：在一些用發(fā)酵方法加工的魚制品中，由于魚和細(xì)菌中的硫胺素酶的作用，使