小麥葉片類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體的分離和分析技術(shù)研究

1、研究報(bào)告生物技術(shù)通報(bào)BIOTECHNOLOGY BULLETIN2011年第7期小麥葉片類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體的分離和分析技術(shù)研究向小聰1，2孟慶石2鮑錦庫(kù)1潘映紅2（1四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都610065；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程，北京100081）摘要：膜蛋白復(fù)合體在生命活動(dòng)中執(zhí)行著重要的生物化學(xué)功能，具有重要的研究意義，但由于其低表達(dá)和高度疏水的特點(diǎn)，完整狀態(tài)和低豐度的膜蛋白復(fù)合體的分離分析仍是一大挑戰(zhàn)。首先，采用藍(lán)綠溫和膠非變性電泳作為第一維分離技術(shù)，大量分離制備葉綠體類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合物；其次，采用電洗脫方法差異富集第一維電泳分離到的各種蛋白

2、復(fù)合體；最后，采用SDS-PAGE 作為第二維分離技術(shù)，分析差異富集的不同種蛋白復(fù)合體的亞基構(gòu)成。研究結(jié)果表明，利用這種分離分析模式，能有效地富集膜蛋白復(fù)合體尤其是低豐度膜蛋白復(fù)合體，明顯提高第二維分離分析的分辨率和蛋白覆蓋率。關(guān)鍵詞：藍(lán)綠溫和膠電泳類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體電洗脫SDS-PAGE低豐度Technological Study on Separation and Analysis of ThylakoidMembrane Protein Complexes from Wheat LeavesXiang Xiaocong 1，2Meng Qingshi 2Bao Jinku 1Pan Yi

3、nghong 2（1College of Life Science ，Sichuan University ，Chengdu 610065；2The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement ，Institute of Crop Science ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081）Abstract ：Membrane protein complexes perform important biochemical fun

4、ction in cellular process ，but the analysis of membraneprotein complexes is a significant challenge due to their hydrophobic properties and relatively low abundanceIn this study ，blue-native polyacrylamide gel electrophoresis （BN-PAGE ）was used to separate and prepare a large number of chloroplast t

5、hylakoid membrane pro-tein complexes in the first dimensionThen ，electroelution was performed to differentially enrich various native protein complexes separa-ted in the first dimensionElectroeluted protein complexes were analyzed to determine the subunit composition with sodium dodecyl sul-fate pol

6、yacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE ）in the second dimensionThe application of the BN /SDS-PAGE strategy to the separation and analysis of membrane protein complexes ，especially in relative low-abundance ，demonstrated that a high resolution and protein coverage was achieved by enrichment of lo

7、w-abundant membrane protein and separation of complexes subunits in the second -di-mensional SDS /PAGEKey words ：BN-PAGE Thylakoid membrane protein complexes Electroelution SDS-PAGE Low-abundance收稿日期：2011-03-25基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30971874），國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2008AA10Z115），轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2009ZX08012-01

8、1B ）作者簡(jiǎn)介：向小聰，女，碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)組學(xué)；E-mail ：xxc8753yahoocn 通訊作者：潘映紅，男，研究員，E-mail ：pyh51yahoocomcn 生物體中的蛋白質(zhì)主要是通過(guò)蛋白與蛋白間的相互作用方式發(fā)揮其功能1，大多數(shù)相互作用的蛋白以結(jié)合態(tài)的復(fù)合體形式存在2，如在膜系統(tǒng)上，蛋白復(fù)合體執(zhí)行著呼吸作用，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子傳遞等重要的生物學(xué)功能3。通過(guò)蛋白復(fù)合體的研究，可以揭示體內(nèi)蛋白的互作關(guān)系和真實(shí)的動(dòng)態(tài)變化4，但分離分析完整狀態(tài)的蛋白復(fù)合體仍是當(dāng)前研究工作的難點(diǎn)之一5，特別是低豐度和高度疏水性膜蛋白復(fù)合體研究所面臨的難度更大68。建立適宜的技術(shù)方法是開(kāi)展蛋白

9、復(fù)合體研究的關(guān)鍵。許多傳統(tǒng)的方法被用于膜蛋白復(fù)合體的分離分析，如基于液相色譜的多維LC MS /MS9，10、免疫共沉淀11、標(biāo)簽或串聯(lián)親和純化12、以及基因槍蛋白組學(xué)13，14。但是，由于膜蛋白豐度低，在純化過(guò)程中易損失且亞基容易解聚，這些方法仍然存在很大的局限性?；谀z的非變性電泳技術(shù)已發(fā)展為當(dāng)前蛋白復(fù)合體分離的主要技術(shù)方法，如非變性等電聚焦電泳15、藍(lán)綠溫和聚丙烯酰胺凝膠電泳（BN-PAGE ）16、清澈溫和非變性凝膠電泳（CN-PAGE ）17和高分辨清澈溫和非變性凝膠電泳（HrCN-PAGE ）18等，其中BN-PAGE 技術(shù)已被廣泛用于膜蛋白復(fù)合體的分離16，1922。在這些方法

10、基礎(chǔ)上建立起來(lái)的二維電泳技術(shù)，比如BN/BN-PAGE 23，hrCNE/SDS-PAGE 24，IEF/SDS-PAGE 25和BN/SDS-PAGE 26已廣泛用于分離分析膜蛋白復(fù)合體。通過(guò)優(yōu)化膜組分制備和膜蛋白復(fù)合體抽提技術(shù)，結(jié)合第一維BN-PAGE 分離和第二維SDS-PAGE 分離，可以實(shí)現(xiàn)低豐度和高度疏水性膜蛋白復(fù)合體如植物類(lèi)囊體蛋白復(fù)合體的富集與分離分析2729，但實(shí)際研究顯示，第一維BN-PAGE 分離出的各種蛋白復(fù)合體常存在較大的濃度差異，直接進(jìn)行第二維SDS-PAGE 分離極容易損失豐度較低的復(fù)合體的信息。為了更深入全面地開(kāi)展膜蛋白復(fù)合體研究，本研究將在已經(jīng)建立一套分離分析

11、小麥葉片葉綠體類(lèi)囊體蛋白復(fù)合體的系統(tǒng)流程（Meng ，et al待發(fā)表）的基礎(chǔ)上，通過(guò)電洗脫技術(shù)富集第一維BN-PAGE 分離到的低豐度蛋白復(fù)合體，提高第二維SDS-PAGE 分離分析的分辨率和蛋白覆蓋率。1材料與方法1. 1材料將小麥（Triticum aestivum ）Taichuang29種子用0. 1%的雙氧水20 下浸種2d 后，播于花盆中在恒溫20 的溫室培養(yǎng)并每天給予16h 的光照。以7d 小麥幼苗葉片為材料提取葉綠體。1. 2方法1. 2. 1完整葉綠體的提取取20g 葉片剪碎后，加入100mL 4 預(yù)冷的提取緩沖液（330mmol /L山梨醇；50mmol /LHepes-

12、KOH ，pH7. 8；5mmol /LEDTA ；5mmol /LEGTA ；1mmol /L氯化鎂；10mmol /L碳酸氫鈉；1. 9mmol /L抗壞血酸和1mmol /L苯甲基磺酰氟（PMSF ）用時(shí)再加）。用勻漿機(jī)低轉(zhuǎn)速勻漿3min ，4層紗布過(guò)濾；2000r /min離心5min 去除細(xì)胞碎片，上清經(jīng)5000r /min離心15min （Sorvall RC6，SLA-1500），得到的沉淀懸浮于提取緩沖液中，懸浮液置于預(yù)先鋪好的蔗糖梯度（30%/40%/60%，W /W），水平離心13200r /min，1h （Beckman Optima L-100XP SW 32Ti ）。

13、收集位于40%和60%間的綠色部分即完整的葉綠體，用提取緩沖液洗23次以去除多余的蔗糖。1. 2. 2類(lèi)囊體膜蛋白的制備用低滲緩沖液（50mmol /LHepes-KOH ，pH7. 8；10mmol /LEDTA ；2mmol /L氯化鎂）將完整葉綠體在冰上漲破，8000r /min離心5min ，得到的沉淀為類(lèi)囊體。將類(lèi)囊體懸浮于裂解緩沖液（20mmol /LBis-Tris ，pH7. 0；500mmol /L6-氨基己酸；20mmol /LNaCl ；2mmol /LED-TA ；10%甘油；1mmol /LPMSF ），加入10%去污劑十二烷基麥芽糖苷（DDM ）使其終濃度為1%，冰

14、上放置30min 后，42900r /min超速離心1h ，棄不溶性沉淀，上清即為類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體，用于非變性電泳。1. 2. 3第一向BN-PAGE 分別配制1mmol /L厚制備型和0. 75mmol /L厚分析型4%15%（W /V）（Protean II xi cell electrophoresis system ，Bio-Rad ）梯度的聚丙烯酰胺分離膠，3. 5%的濃縮膠30，凝膠中含有01%DDM 。上清加入溶于裂解緩沖液的10%考馬斯亮藍(lán)G250使其終濃度為01%，充分混勻后，進(jìn)行電泳。電泳在4 下進(jìn)行，陰極緩沖液為50mmol /LTricine ，15mmol /LBi

15、s-Tris ，pH7. 0，0. 01%（W /V）G250。陽(yáng)極緩沖液為50mmol /LBis-Tris ，pH7. 0。當(dāng)電泳一半時(shí)，用不含G250的陰極緩沖液取代陰極緩沖液。1. 2. 4電洗脫蛋白電泳完后，切下制備型BN 膠的目的蛋白帶，用SDS-PAGE 電泳緩沖液（25mmol /LTris ，192mmol /L甘氨酸，1%SDS ）平衡30min ，室溫下進(jìn)行電洗脫（165-1250Whole Gel Eluter ，伯樂(lè)）30min ，恒流為200mA 。1. 2. 5第二向SDS-PAGE 收集電洗脫蛋白樣品，丙酮沉淀，沉淀用增溶液（7mol /L尿素，2mol /L硫

16、脲，1. 5%DTT ）裂解后，加入上樣緩沖液并在室溫條件下放置30min ，點(diǎn)樣于含8mol /L尿素，分離膠濃度為12%的SDS-PAGE ，恒壓為80V 。電泳完后，用考馬斯亮藍(lán)R250染色。對(duì)于分析型BN 膠，切下一個(gè)完整的泳道用平衡液（6mol /L尿素；4. 0%SDS ；25%甘油；140mmol /LTris-HCl ，pH6. 8；5%-巰基乙醇）在室溫平衡30min ，將膠條旋轉(zhuǎn)90 水平放置于預(yù)先配好的含8mol /L尿素的12%的SDS 膠上方，緊密接觸防止膠接觸界面產(chǎn)生氣泡。100V 恒壓電泳30min ，再恒壓150V 直至溴酚藍(lán)跑至凝膠底部，停止電泳。電泳完后，用

17、考馬斯亮藍(lán)R250染色。2結(jié)果與分析2. 1葉綠體組分的富集在提取葉綠體時(shí)，以新鮮葉片為材料，低轉(zhuǎn)速間歇?jiǎng)驖{以保證細(xì)胞在大量破碎的情況下，釋放更多完整的葉綠體。在低速離心去除一部分細(xì)胞殘留碎片后，再高速離心以沉淀葉綠體。用提取緩沖液懸浮粗葉綠體后，平鋪于預(yù)先鋪好的用不含山梨糖醇的提取緩沖液配制蔗糖梯度（30%/40%/60%，W /W）頂部。用超速離心機(jī)水平離心后，會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)明顯的綠色條帶，位于上層的條帶為破碎的葉綠體，下層的條帶為完整的葉綠體，小心收集40%與60%間的葉綠體，用提取緩沖液洗滌兩次以去除多余的蔗糖后，得到的沉淀為干凈的完整葉綠體。通過(guò)差速離心和不連續(xù)蔗糖梯度分離和富集葉綠體，

18、提高了后續(xù)分離蛋白即低豐度的類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體的檢出率。2. 2膜蛋白復(fù)合體的裂解用低滲溶液漲破葉綠體以釋放類(lèi)囊體，離心等比富集類(lèi)囊體后，要完全去除上清液體，以避免可溶性蛋白對(duì)膜蛋白的污染以及對(duì)非變性電泳的影響。用BN-PAGE 樣品制備液懸浮類(lèi)囊體沉淀，加入蛋白酶抑制劑PMSF ，以防止蛋白的降解。裂解緩沖液必須是低鹽濃度的緩沖液，低濃度的鹽可以增加膜蛋白的溶解性，而較高的離子濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白在凝膠上樣孔堆積以及高濃度的膜蛋白聚集31。在低離子濃度時(shí)，兩性離子化合物6-氨基己酸可以保持溶液所需的離子強(qiáng)度以溶解和穩(wěn)定膜蛋白復(fù)合體32。低濃度的6-氨基己酸和EDTA 可以抑制蛋白酶的水解作用。10

19、%的甘油可以防止去污劑敏感型的膜蛋白的解聚，在電泳過(guò)程中對(duì)蛋白起沉降作用。裂解膜蛋白時(shí)，溫和的去污劑的種類(lèi)和濃度選擇很重要。一個(gè)理想的去污劑在保持膜蛋白的可溶性狀態(tài)的同時(shí)，不影響脂質(zhì)雙分子層包裹狀態(tài)時(shí)的功能、結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)特性33。最佳的去污劑濃度不僅能把膜蛋白從膜上解離下來(lái)，防止其聚集，還要保持膜蛋白的復(fù)合體狀態(tài)。在確定最佳的去污劑種類(lèi)和濃度后（Meng ，et al待發(fā)表），本試驗(yàn)加入裂解效果較好的10%DDM 使其終濃度為1%，冰上放置1h ，以有效解離類(lèi)囊體膜上的蛋白，并保證其復(fù)合體狀態(tài)，防止膜蛋白的聚集。超速離心去除不溶性蛋白，以減少不溶性蛋白對(duì)非變性電泳的影響，所得上清即為類(lèi)囊體膜蛋

20、白復(fù)合體。2. 3用藍(lán)綠溫和膠電泳分離小麥類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體用于藍(lán)綠溫和膠電泳的類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體在點(diǎn)樣之前，需加入0. 5%的陰離子染料G250。大量的染料分子與疏水性膜蛋白結(jié)合后，使蛋白帶上負(fù)電荷而在電泳過(guò)程中向陽(yáng)極移動(dòng)。膜蛋白因表面大量的負(fù)電荷而相互排斥，這在一定程度上減少了蛋白的聚集；另一方面，膜蛋白與染料結(jié)合后失去了其疏水特性而溶解性增加。因此，在G250與蛋白結(jié)合后，BN 膠中不需要加去污劑，這不僅減少了電泳過(guò)程中去污劑敏感型的蛋白的變性機(jī)率，還對(duì)膜蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)有保護(hù)作用34。膜蛋白在電泳中的移動(dòng)決定于所結(jié)合G250的負(fù)電荷以及蛋白復(fù)合體的大小和形狀。點(diǎn)樣后，加入含001%G2

21、50的陰極緩沖液，以源源不斷地補(bǔ)充蛋白在遷移過(guò)程中損耗的G250，在電泳一半時(shí)，更換陰極緩沖液為不含G250的無(wú)色緩沖液，以降低凝膠的背景而能檢測(cè)到相互作用較弱的蛋白復(fù)合體。從圖1可以看出，1%DDM 增溶小麥類(lèi)囊體膜蛋白后，能在藍(lán)綠溫和膠中檢測(cè)到12條主要條帶。條帶5、7、9、11是含量比較高的膜蛋白復(fù)合體，其余的為豐度比較低的蛋白，這些低豐度膜蛋白的研究是當(dāng)前分離分析技術(shù)面臨的難點(diǎn)之一。2. 4復(fù)合體亞基的SDS-PAGE為了更進(jìn)一步研究類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體，采用經(jīng)典的BN /SDS-PAGE 技術(shù)對(duì)組成膜蛋白復(fù)合體的亞基進(jìn)行了第二維SDS-PAGE 分離分析（圖2）。從圖2可以看出，膜蛋白

22、復(fù)合體的各亞基分別按分子量不同在SDS 膠內(nèi)分開(kāi)，得到的總亞基數(shù)為40。在第一維BN-PAGE 分離了12條主要蛋白條帶時(shí)，各膜蛋白復(fù)合體在經(jīng)平衡液處理后，解離成亞基蛋白。平衡液中高濃度的尿素通過(guò)破壞疏水鍵和離子鍵使蛋白去折疊增加了疏水性膜蛋白在膠內(nèi)的溶解度，同時(shí)斷裂二硫鍵解聚膜蛋白復(fù)合體成亞基。SDS 在2011年第7期向小聰?shù)龋盒←溔~片類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體的分離和分析技術(shù)研究 圖1類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體的BN-PAGE 圖譜aBN-PAGE 分離的類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體；b水平轉(zhuǎn)移BN 膠中蛋白到SDS 膠后亞基的分布情況圖2類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體的經(jīng)典二維BN /SDS-PAGE 圖譜解聚復(fù)合體的同時(shí)

23、，與亞基蛋白結(jié)合增加蛋白的電荷性，促進(jìn)膜蛋白的溶解和在膠內(nèi)的電泳移動(dòng)性。-巰基乙醇還原二硫鍵而增加膜蛋白的溶解度。保持膜蛋白的高度溶解性，使膜蛋白不易在第一向膠內(nèi)聚集，大大提高了膜蛋白進(jìn)入第二向膠的轉(zhuǎn)移率。這種方法能夠直觀地看到膜蛋白復(fù)合體亞基的真實(shí)位置，但是二維圖上的亞基大多屬于一維膠中濃度較高的膜蛋白復(fù)合體的亞基，各低豐度的膜蛋白復(fù)合體的亞基均未檢測(cè)到。解決這一問(wèn)題的方法是電洗脫膜蛋白復(fù)合體進(jìn)行差異富集，以提高低豐度蛋白的電泳分辨率。切取BN 膠的4個(gè)復(fù)合體條帶（5、9、10、11），在SDS-PAGE 電泳緩沖液平衡30min 后，進(jìn)行電洗脫，收集洗脫的蛋白進(jìn)行電泳。平衡后，膜蛋白復(fù)合體

24、解聚成亞基，在與SDS 結(jié)合后帶負(fù)電荷，在洗脫過(guò)程中向陽(yáng)極移動(dòng)。因?yàn)槟さ鞍椎娜芙庑暂^低，在配制SDS-PAGE 凝膠時(shí)，加入8mol /L尿素增加膜蛋白在凝膠內(nèi)的溶解度，在蛋白點(diǎn)樣時(shí)，膜蛋白與SDS-PAGE 上樣緩沖液充分混勻后，在室溫下放置30min ，膜蛋白與緩沖液中的SDS 充分結(jié)合，溶解性增加不易發(fā)生蛋白的聚集，提高SDS-PAGE 的分辨率。80V 低電壓電泳使電泳過(guò)程中產(chǎn)熱減少，膜蛋白不會(huì)發(fā)生熱變性而影響分辨率。從圖3可以看出，各復(fù)合體蛋白所含亞基的數(shù)目和種類(lèi)不同。復(fù)合體蛋白5在解聚后形成12個(gè)亞基；復(fù)合體蛋白9解聚后形成10個(gè)亞基；復(fù)合體蛋白10在解聚后形成12個(gè)亞基；復(fù)合體蛋

25、白11在解聚后形成10個(gè)亞基。在所選的4個(gè)蛋白復(fù)合體中，第二維的SDS-PAGE 已檢測(cè)到44個(gè)蛋白亞基；與經(jīng)典的BN/SDS-5，9，10，11分別為復(fù)合體蛋白5、9、10、11的亞基在含8mol /L尿素的SDS-PAGE 分離圖3類(lèi)囊體膜蛋白的第二維SDS-PAGE 圖譜151生物技術(shù)通報(bào)BiotechnologyBulletin2011年第7期PAGE 相比，電洗脫方法富集低豐度膜蛋白能顯著提高二維電泳的分辨率和蛋白的覆蓋率。3結(jié)論由于膜蛋白表達(dá)量低和高度疏水的特點(diǎn)，分離分析完整狀態(tài)和低豐度的膜蛋白復(fù)合體面臨較大的困難。一般情況下，通過(guò)差速離心和不連續(xù)蔗糖梯度等比富集膜組分，再使用適宜

26、濃度的去污劑，從膜上完整地解離出膜蛋白復(fù)合體并保持其溶解性，通過(guò)非變性藍(lán)綠溫和膠電泳使膜蛋白在保持其復(fù)合體狀態(tài)的條件下得到良好的分離，然后直接進(jìn)行第二維SDS-PAGE 分析蛋白復(fù)合體的亞基構(gòu)成。但在這種經(jīng)典的二維BN /SDS-PAGE 電泳過(guò)程中，極容易損失豐度較低的復(fù)合體的信息，即在第二維電泳中很難檢測(cè)到低豐度膜復(fù)合體的亞基。以小麥葉片類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體為材料進(jìn)行的研究表明，通過(guò)電洗脫技術(shù)差異富集第一維電泳分離出的各種蛋白復(fù)合體后，利用含尿素的SDS-PAGE 電泳技術(shù)進(jìn)行亞基蛋白的分離分析，可明顯提高分析的分辨率和蛋白覆蓋率，獲得更多的低豐度膜蛋白復(fù)合體的信息。該技術(shù)流程特別適用于低豐

27、度膜蛋白復(fù)合體的分離和分析研究，具有較廣泛的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1Janin J ，Bahadur RP ，Chakrabarti PProtein-protein interaction andquaternary structure Q Rev Biophys ，2008，41（2）：133-802Langosch D ，Arkin ITInteraction and conformational dynamics ofmembrane-spanning protein helices Protein Sci ，2009，18（7）：1343-583Alexandersson E ，Saal

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