PCR原理與應用

1、PCR原理與應用 Principle and application of PCR目錄PCR原理 應用 PCR可以被認為是與發(fā)生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。簡述簡述0501020304PCR五要素模板Mg2+引物原料dNPTDNA聚合酶 單、雙鏈DNA均可，一般為雙鏈。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。模板濃度過高會導致反應的非特異性增加。（1）模板濃

2、度過高易導致模板與引物錯配,反應特異性下降。酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產量。（2）引物濃度（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種dNTP濃度應相等 濃度過高易產生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應產量 dNTP可與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（4）dNTP（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降； Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合,所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。

3、變變性性退退火火延延伸伸主要步驟變性退火復性模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；DNA模板-引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。循環(huán)參數(shù) 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 變性 94oC 20-30秒 延伸 70-75,一般為72循環(huán)次數(shù)25至35 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結合;降低溫度

4、可增加反應的靈敏性延伸時間由擴增片段長度決定次數(shù)過多： 擴增效率降低錯誤摻入率增加PCR不對稱PCR逆轉錄PCR差異顯示PCR錨定PCR多重PCR單鏈構象多態(tài)性PCR實時熒光定量PCR反向PCR隨機引物PCR延伸。延伸。PCR技術在不斷進化，而種類也會越來越多。1）不對稱PCR(asymmetric PCR) 目的：擴增產生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01 0.5M,關鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結構功能的研究 PCR的類型應用2）、逆轉錄PCR (revers

5、e transcription PCR, RT-PCR) RT-PCR先在逆轉錄酶的作用下以mRNA為模板合成cDNA，再以cDNA為模板加入dNTP和兩種特異引物及Taq酶進行PCR反應，這樣低豐度的mRNA被擴增放大易于檢測。 RT-PCR中的關鍵步驟是RNA的逆轉錄，要求RNA模板必須是完整的，且不含DNA、蛋白質等雜質。RT-PCR圖解 3）、錨定PCR(anchored PCR, A-PCR) 該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補的引物作為錨定引物，在與基因配對互補結合后進行PCR擴增。4）、）、反向反向PCR (in

6、verse PCR, IPCR)IPCR是是擴增未知序列擴增未知序列的一種簡捷方法。其基礎是：用的一種簡捷方法。其基礎是：用限制性內切酶消化限制性內切酶消化DNA，然后環(huán)化切割的產物，再用，然后環(huán)化切割的產物，再用切割后已知序列上兩端相反方向的引物序列進行切割后已知序列上兩端相反方向的引物序列進行PCR (圖圖8-3)，也可將環(huán)化，也可將環(huán)化DNA線性化后再進行線性化后再進行PCR。5）、）、隨機引物隨機引物PCR (arbitrary primer PCR, AP-PCR) RAPD建立在建立在PCR基礎之上，它是利用一系列不基礎之上，它是利用一系列不同的隨機排列的寡核苷酸鏈同的隨機排列的寡

7、核苷酸鏈(通常為十聚體通常為十聚體)為引物，為引物，對所研究基因組對所研究基因組DNA進行進行PCR擴增，擴增產物通過擴增，擴增產物通過聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)EB染色來檢染色來檢測擴增測擴增DNA片段多態(tài)性?？捎糜谄味鄳B(tài)性?？捎糜谶M行基因組指紋圖進行基因組指紋圖譜的構建，并利用指紋圖譜進行品種鑒定和對物種進譜的構建，并利用指紋圖譜進行品種鑒定和對物種進行親緣關系和系統(tǒng)進化的研究。行親緣關系和系統(tǒng)進化的研究。 6）、差異顯示差異顯示RT-PCR(differential display RT-PCR,DDRT-PCR) DDRT-PCR技術最大的優(yōu)

8、點是技術最大的優(yōu)點是省去了省去了cDNA克隆和隨后繁雜的克克隆和隨后繁雜的克隆篩選工作隆篩選工作。但此方法也存在需要合成的引物多、費用大、操作技。但此方法也存在需要合成的引物多、費用大、操作技術要求高、虛假特異區(qū)帶出現(xiàn)較多等缺點，仍有待進一步完善。如術要求高、虛假特異區(qū)帶出現(xiàn)較多等缺點，仍有待進一步完善。如圖圖8-4。7 ） 、） 、 單 鏈 構 象 多 態(tài) 性單 鏈 構 象 多 態(tài) 性 P C R ( s i n g l e s t r a n d construction polymor-phism PCR, SSCP-PCR) 其原理是單鏈其原理是單鏈DNA分子因單一核苷酸不同，其二分子

9、因單一核苷酸不同，其二級結構有所差異，級結構有所差異，PCR產物常表現(xiàn)在非變性凝膠電泳產物常表現(xiàn)在非變性凝膠電泳中電泳遷移率不同。通過比較中電泳遷移率不同。通過比較DNA的電泳類型，即的電泳類型，即可測出突變。其優(yōu)點是所需樣品可測出突變。其優(yōu)點是所需樣品DNA量極少，靈敏量極少，靈敏度高，度高，可檢測出點突變，以及插入、缺失突變，能一可檢測出點突變，以及插入、缺失突變，能一次篩選多個樣品次篩選多個樣品。8）、）、多重多重PCR (multiplex PCR) 多重多重PCR是在同一反應中采用多對引物同時擴增幾個不同是在同一反應中采用多對引物同時擴增幾個不同的的DNA片段；如果被測基因某一區(qū)段缺

10、失，則相應的電泳圖譜片段；如果被測基因某一區(qū)段缺失，則相應的電泳圖譜上此區(qū)段上此區(qū)段PCR擴增產物長度減少或消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常擴增產物長度減少或消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常(圖圖8-5)。多重。多重PCR具有靈敏、快速特點，特別具有靈敏、快速特點，特別適用檢測單拷貝基因適用檢測單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變，其結果與缺失、重排、插入等異常改變，其結果與Southern雜交結果同雜交結果同樣可靠，且多重樣可靠，且多重PCR尚可檢測小片段缺失。尚可檢測小片段缺失。9）、實時熒光定量）、實時熒光定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）主要用于主要用于PCR產物實時監(jiān)控。產物實時監(jiān)控。應用生命科學臨床應用檢疫法學鑒定農業(yè)科學生命科學 人類基