多糖的提取和純化

1、多糖的提取和純化 多糖的提取和純化多糖的提取和純化摘 要 本文較 詳細(xì)地介紹了多糖的提取和純化方法，為多糖的研究和生產(chǎn) 提供參考依據(jù)。關(guān)鍵詞 多糖；提??；純化；活性炭多糖(polysacharides , PS),又稱多聚糖，是由 10個以上的單 糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化 合物。它廣泛分布于自然界高等植物、藻類、微生物(細(xì)菌 和真菌)與動物體內(nèi)。 20 世紀(jì) 60 年代以來，人們逐漸發(fā)現(xiàn) 多糖具有復(fù)雜的、多方面的生物活性和功能 1 ：(1) 多糖可 作為廣譜免疫促進(jìn)劑，具有免疫調(diào)節(jié)功能，能治療風(fēng)濕病、 慢性病毒性肝炎、癌癥等免疫系統(tǒng)疾病，甚至能抗AIDS 病毒2 。

2、如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用10 ，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強(qiáng)人 體免疫功能 3-5 。 (2) 多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、 降血糖、降血脂、促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成作用。如柴 胡多糖具有抗輻射，增強(qiáng)免疫功能等生物學(xué)作用 6 ，麥冬 多糖具有降血糖及免疫增強(qiáng)作用 7-8 ，動物黏多糖具有抗 凝血、降血脂等功能 9 。(3) 多糖能控制細(xì)胞分裂和分化， 調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老 作用10 ，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、 抗過敏、降血脂、 止咳祛痰、減肥等功能 11 。另外，多糖作為藥物，其毒性 極小，因而多糖的研究已引起人們極

3、大的興趣。 由于多糖具有的生物活性與其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，而多糖的結(jié)構(gòu)又是相當(dāng) 復(fù)雜的，所以在這一領(lǐng)域的研究相對緩慢。但人們在多糖的 分離提取與純化方面已做出了不少工作。 1. 多糖的提取 121.1 熱水浸提法： 1.1.1 多糖提取條件的優(yōu)選根據(jù)文獻(xiàn) 報(bào)道 13 ：影響熱水浸提多糖的因素主要有提取時(shí)間、提取 次數(shù)、溶劑體積、浸提溫度、 pH 值、醇析濃度和植物顆粒大 小等。在試驗(yàn)前對上述多種因素利用正交實(shí)驗(yàn)法做出優(yōu)選， 才能選出最佳提取方案。1.1.2其步驟為：原料t粉碎t脫 脂T粗提（2 - 3次）T吸濾或離心T沉淀T洗滌T干燥首先 除去表面脂肪。原料經(jīng)粉碎后加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮 或 1

4、： 1 的乙醇乙醚混合液， 水浴加熱攪拌或回流 1-3小時(shí)， 脫脂后過濾得到的殘?jiān)话阌盟魅軇ㄒ灿杏脷溲趸泬A 性水液、氯化鈉水液、1%醋酸和1%苯酚或0.1 - 1M氫氧化 鈉作為提取溶劑）提取多糖。溫度控制在90 100C，攪拌4 - 6小時(shí)，反復(fù)提取 2-3次。得到的多糖提取液大多較粘 稠，可進(jìn)行吸濾。也可用離心法將不溶性雜質(zhì)除去，將濾液 或上清液混合（得到的多糖若為堿性則需要中和） 。然后濃 縮，再加入 2- 5 倍低級醇（甲醇或乙醇）沉淀多糖；也可 加入費(fèi)林氏溶液或硫酸銨或溴化十六烷基三甲基銨等，與多 糖物質(zhì)結(jié)合生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀。然后依次用乙 醇、丙酮和乙醚洗滌。將洗干

5、后疏松的多糖迅速轉(zhuǎn)入裝有五 氧化二磷和氫氧化鈉的真空干燥器中減壓干燥（若沉淀的多糖為膠狀或具粘著性時(shí)，可直接冷凍干燥) 。干燥后可得粉 末狀的粗多糖。 1.2 微波輔助提取法：其原理為利用不同極 性的介質(zhì)對微波能的不同吸收程度，使基體物質(zhì)中的某些區(qū) 域和萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使萃取物質(zhì) 從基體或體系中分離出來，進(jìn)入到介電常數(shù)小，微波吸收能 力較差的萃取劑中 14 。由于微波能極大加速細(xì)胞壁的破 裂，因而應(yīng)用于中草藥中有效成分的提取能極大加快提取速 度，增加提取產(chǎn)率。而且由于其選擇性好，提取后基體能保 持良好的性狀，提取液也較一般的提取方法澄清 15 。聶金 源等在柴胡多糖和黃酮

6、化合物的提取 18 中對微波輔助提 取法、超聲輔助法和索氏提取法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)微波輔助提 取法所需時(shí)間最短(10min),多糖的提取率最高(28.46 %) 1.3 超聲輔助法：其原理是利用超聲波的空化作用加速植物 有效成分的浸出提取， 另外超聲波的次級效應(yīng)， 如機(jī)械振動、 乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散 釋放并充分與溶劑混合，利于提取 16 。超聲波輔助法與常 規(guī)提取法相比，具有提取時(shí)間短、產(chǎn)率高、無需加熱等優(yōu)點(diǎn) 17 。1.4 索氏提取法：將植物粉末置于索氏提取器中，加 入石油醚，60 C -90 C條件下提取至無色(一般為6小時(shí))。過濾， 濾渣揮發(fā)干燥完溶媒后加入

7、80%乙醇， 再提取 6 小時(shí)， 過濾，濾渣乙醇揮發(fā)干燥后加蒸餾水?；亓魈崛?2 次，趁熱 過濾，濾液減壓濃縮，再除蛋白，醇沉，除色素。60C干燥，稱重。 1.5 醇提法：先后將 90%和 50%乙醇加入植物粉末中， 振蕩充分再抽濾。濾液中加入足量無水乙醇，至于4C冰箱中過夜。減壓抽濾，再除去色素，得多糖粗品，在60C通風(fēng)干燥箱中干燥，再置干燥皿中恒重保存。醇提法方法簡單， 易于操作，但提取率較低，乙醇使用量大，不宜大規(guī)模提取 使用。 1.6 其它方法：多糖的提取方法還有稀堿液浸提法、 稀酸液浸提法、酶法等。但由于稀酸、稀堿條件下，易使多 糖發(fā)生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發(fā)生水解而使多糖的提取率

8、減少，因而很多試驗(yàn)中避免采用稀堿液浸提法和稀酸液浸提 法。 2. 多糖的純化 2.1 多糖中雜質(zhì)除去方法 粗多糖中往 往混雜著蛋白質(zhì)、 色素、低聚糖等雜質(zhì)， 必須分別除去。 2.1.1 除蛋白質(zhì)采用醇沉或其它溶劑沉淀所獲得的多糖，?；煊休^ 多的蛋白質(zhì)，脫去蛋白質(zhì)的方法有多種：如選擇能使蛋白質(zhì) 沉淀而不使多糖沉淀的酚、三氯甲烷、鞣質(zhì)等試劑來處理， 但用酸性試劑宜短，溫度宜低，以免多糖降解。常用的方法 有19 ：2.1.1.1 沙維積法（ Sevag 法） 20 ：根據(jù)蛋白質(zhì) 在氯仿等有機(jī)溶劑變性而不溶與水的特點(diǎn)，將多糖水溶液、 氯仿、戊醇（或正丁醇）之比調(diào)為 25:5:1 或 25:4:1 ，混

9、合 物劇烈振搖 20 到 30 分鐘，蛋白質(zhì)與氯仿戊醇 （或正丁醇） 生成凝膠物而分離，然后離心，分去水層和溶劑層交界處的 變性蛋白質(zhì)。此種方法較溫和，在避免降解上有較好效果， 但效率不高，如五味子多糖的提取實(shí)驗(yàn)中要重復(fù)處理達(dá)三十 幾次。并且每次除去蛋白質(zhì)變性膠狀物時(shí)，不可避免的溶有 少量多糖，另外少量多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白聚糖和糖蛋 白，在處理時(shí)會沉淀下來，造成多糖的損失。如能配合加入 一些蛋白質(zhì)水解酶，再用 Sevage 法效果更佳。 2.1.1.2 三 氟三氯乙烷法 21 ：多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合， 低溫下攪拌 10min 左右，離心得上面水層，水層繼續(xù)用上述 方法處理幾次，即

10、得無蛋白質(zhì)的多糖溶液，此法效率高，但 溶劑沸點(diǎn)較低，易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。 2.1.1.3 三氯醋酸 法：在多糖水溶液中滴加 5 30三氯醋酸，直至溶液不 再繼續(xù)混濁為止，在 5- 10C放置過夜，離心除去沉淀即得 無蛋白質(zhì)的多糖溶液。此法會引起某些多糖的降解。 Sevag 法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三種方法均不適合糖肽， 因糖肽也會像蛋白質(zhì)那樣沉淀出來。對于對堿穩(wěn)定的糖蛋 白，在硼氫化鉀存在下，用稀堿溫和處理，可以把這種結(jié)合 蛋白質(zhì)分開 1 。2.1.1.4 酶解法 22 ：在樣品溶液中加入 蛋白質(zhì)水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉 蛋白酶等，使樣品中的蛋白質(zhì)降解。通常將其與

11、 Sevag 法綜 合使用除蛋白質(zhì)效果較好。 2.1.1.5 鹽酸法 23 ：取樣品濃 縮液，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)其PH至3,放置過夜，在3000r/min 條件下離心，棄去沉淀，即脫去蛋白質(zhì)。另有李知敏 23 和 葉將瑜 25 等人分別在植物多糖實(shí)驗(yàn)中證明：鹽酸法、三氯 乙酸法及 Sevag 法脫蛋白率分別為 72.5 、 46.1 和42.3 ，多糖的損失率分別為 15.1%、6.1 和 14.3 。鹽 酸法脫蛋白率高，但多糖的損失率也較高 ; 三氯乙酸法較溫 和，但除蛋白效率不高； Sevag 法的脫蛋白效果不及前兩種。2.1.1.6 其它方法：可以加入 5%ZnSO4溶液和飽和 Ba

12、 (OH2 溶液，振蕩后離心去蛋白。此法除蛋白不夠徹底，可結(jié)合Sevag法使用。還可在提取液中加入50%勺TCA溶液至沉淀完全，在4000r/min的條件下離心10min，收集上清液，即 為除蛋白液。還有人使用 4:1 勺氯仿 - 乙醇溶液除蛋白，將 混合液清搖，再靜置，取上清液。此過程需重復(fù)多次方可除 盡蛋白。除去蛋白質(zhì)的樣品用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)，觀察在 280mm處是否有吸收，如果無吸收則表明蛋白質(zhì)已經(jīng)除盡24 。 2.1.2 除色素 2.1.2.1 活性炭( activated carbon ) 除色素 12 ：活性炭屬于非極性吸附劑，有著較強(qiáng)的吸附能 力，特別適合于水溶性物質(zhì)的分離。它

13、的來源充足，價(jià)格便 宜，上柱量大，適用于大量制備性分離。目前用于色譜分離 的活性炭主要分為粉末狀活性炭、顆粒狀活性炭、錦綸活性 炭三種。一般情況下，盡量避免用活性炭處理，因?yàn)榛钚蕴?會吸附多糖，造成多糖的損失。 2.1.2.2 對于植物來源的多 糖，可能含有酚型化合物而顏色較深，這類色素大多呈負(fù)性 離子，不能用活性炭吸收劑脫色，可用弱堿性樹脂DEAE纖維素或 DuoliteA 7來吸附色素。 2.1.2.3 若糖和色素時(shí)結(jié) 合的，易被DEAE纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可 進(jìn)行氧化脫色：以濃氨水或 NaOH夜調(diào)至PH8.0左右，50 C 以下滴加H2O2至淺黃色，保溫2小時(shí)。2.124

14、依次用丙 酮、無水乙醚和無水乙醇洗滌多糖，即可得到較為純凈的多 糖。此法較為簡單， 便于操作， 多糖損失也較小。 2.1.2.5 用 4:1 的氯仿 - 正丁醇除色素。操作簡單，多糖有一定損失。2.1.2.6 發(fā)酵來源的多糖顏色一般較淺，色素含量較少，一 般可不除色素。 2.1.2.7 對于動物，微生物等提取得到的多 糖也可根據(jù)不同情況按上述方法處理。 2.1.3 除低聚糖等小 分子雜質(zhì) 2.1.3.1 采用逆向流水透析法。即準(zhǔn)備好一桶蒸餾 水，用一根導(dǎo)管將水通入透析袋的燒杯底部，另用一根導(dǎo)管 將水引出，根據(jù)水量控制流速，使水緩慢流動 48 小時(shí)。這 樣得到的就是多糖的半精品。 2.1.3.2

15、 利用溶液濃度擴(kuò)散效 應(yīng)，將分子量小的物質(zhì)如無機(jī)鹽、低聚糖等從透析袋滲透到 袋外的蒸餾水中，不斷換水即可保持濃度差，從而除盡小分 子雜質(zhì)。具體的做法是根據(jù)多糖溶液的體積截取相應(yīng)長度的 透析袋，用透析夾夾住一端，灌入多糖液，離液面23cm處夾緊透析袋，置于一大燒杯中，注入蒸餾水至完全浸沒透 析袋后，用磁力攪拌器慢速攪拌，每 12小時(shí)換一次水，重 復(fù) 34 次。 2.2 多糖的純化方法 純化是將多糖混合物分 離為單一多糖的過程，純化的方法主要有以下幾種：2.2.1分部沉淀法 根據(jù)各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具 有不同溶解度的性質(zhì)，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇 或丙酮， 收集不同濃度下析出

16、的沉淀， 經(jīng)反復(fù)溶解與沉淀后， 直到測得的物理常數(shù)恒定（最常用的是比旋光度測定或電泳 檢查）。這種方法適合于分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩(wěn)定，常在pH7進(jìn)行，唯酸性多糖在pH7時(shí)COOH 是以C00離子形式存在的，需在 pH2- 4進(jìn)行分離，為了 防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖制成各種衍生 物如甲醚化物、乙?；锏?，然后將多糖衍生物溶于醇中， 最后加入乙醚等極性更小的溶劑進(jìn)行分級沉淀分離。 2.2.2 鹽析法 在天然產(chǎn)物的水提液中，加入無機(jī)鹽，使其達(dá)到一 定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉淀析出， 與其它水溶性較大的雜質(zhì)分離。常做鹽析的無機(jī)鹽的有氯化 鈉、硫酸鈉

17、、硫酸鎂、硫酸銨等。 2.2.3 季銨鹽沉淀法 季 銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉 淀，常用于酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物并不 與中性多糖產(chǎn)生沉淀，但當(dāng)溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時(shí)，也會與中性多糖形成沉淀。常用的季 銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（ CTAB及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide , CTA OH 和十 六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride , CP OH。CTAB或 CP- OH的濃度一般為1 % 10%（ W/V的多糖溶液中，酸 性多糖可從中性多糖中沉淀出來，所

18、以控制季銨鹽的濃度也 能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小于9,而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉淀出來。 2.2.4 柱層析：包括纖維素柱層析、纖維素 陰離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和層析、高壓液相層析 和其它柱層析。如用活性炭及硅膠做載體的柱層來分離多 糖；或用硼砂型的離子交換樹脂分離中性多糖。纖維素柱層 析 纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質(zhì)，又具 有分配色譜的性質(zhì)，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水 溶液，流出柱的先后順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性 差的最后出柱，與分級沉淀法正好相反。纖維素陰離子交換 柱層析 最常見的交換劑為 DEA1纖維素(硼酸型或堿型)， 洗脫劑可用不同濃度的堿溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方 法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適于分 離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。般單糖、低聚糖因醛 基而發(fā)生的顏色反應(yīng)在多糖上不明顯，電泳后常用的顯色劑 是p 茴香胺硫酸溶液(p anisidine )和過碘酸希夫試劑 等。2.3.3 凝膠柱層析 常用的凝膠是 Sephadex、Sepharose、 Sephacryl ，展開劑為 0.02 0.2molNaCl 溶液或 0.04mol 吡 啶與 0.02