流式細(xì)胞儀常用的幾種檢測方法

1、流式細(xì)胞儀常用的幾種檢測方法(轉(zhuǎn)載)一、測定用乙醇固定的DNA的含量1、培養(yǎng)細(xì)胞的 DNA含量的測定制備單細(xì)胞懸液于 200卩1的PBS緩沖液中；加入2ml預(yù)冷的70%乙醇，4C保存；附: 細(xì)胞固定的一般步驟1)? ? ? 取單細(xì)胞懸液 12X 106個細(xì)胞于 PBS( PH=)緩沖液中；2) ? ? ?300g 離心 5 分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；4C條件下3)? ? ? 重懸細(xì)胞于 PBS 緩沖液中；4)? ? ?將細(xì)胞懸液放置于 23ml冷70%乙醇中，混勻，保存于4C,至少30分鐘。在可保存 23 周。2? ? ? 根據(jù)實驗的要求，固定劑也可選用1 3%多聚甲醛；2? ? ? 將乙醇作為

2、固定劑時，乙醇應(yīng)預(yù)冷至04C；2? ? ? 細(xì)胞在固定時，固定劑應(yīng)緩慢滴入細(xì)胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加，并不斷震搖，以免 細(xì)胞成團(tuán)(特別是用乙醇固定時)。2? ? ? 300g 離心5分鐘，去上清，再重懸于400卩l(xiāng) PBS 中；2? ? ? 顯微鏡下觀察，若有明顯的黏附，須再用篩網(wǎng)過濾；2? ? ? 加入PI (含Rnase)，避光孵育 30分鐘；2? ? ? 上機(jī)檢測。2、新鮮組織的 DNA含量的測定1)? ? ?用200mg濕重組織用機(jī)械法制成單細(xì)胞懸液；2)? ? ?500g 離心 5 分鐘；3) ? ? ? 棄上清，重懸于 10ml 染色 -去污劑中；4)? ? ?再過濾，用2

3、00目的篩網(wǎng)或7080卩m的篩網(wǎng)過濾；5)? ? ? 上機(jī)檢測。3、石蠟包埋組織切片的DNA含量的測定1)? ? ?從石蠟包埋切取切片50卩m厚，23片，制成單細(xì)胞懸液；2)? ? ?用PBS緩沖液洗滌，500g離心5分鐘，棄上清；3)? ? ? 加入 PI 液 1ml 室溫避光 30 分鐘；4)? ? ? 調(diào)整細(xì)胞濃度為 1X106/ml；5)? ? ? 上機(jī)檢測。二、細(xì)胞凋亡檢測及相關(guān)分子檢測1、細(xì)胞DNA含量分布(由細(xì)胞DNA降解方式檢測細(xì)胞凋亡)2? ? ? 收集已固定的單細(xì)胞懸液約5X 1051X 106/ml ;2? ? ? 離心除去固定液， 3ml PBS 重懸細(xì)胞 ;2? ?

4、? 1500rpm 離心， 5 分鐘 ，棄去 PBS；2? ? ? 加 PI 染液 1 m l ，室溫避光 20分鐘；2? ? ? 調(diào)整細(xì)胞濃度 5 X 105/ml ;2? ? ? 上機(jī)檢測。2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細(xì)胞凋亡1) ? ? ?常規(guī)制備單細(xì)胞懸液 ，用PBS洗兩次.(若為全血要先溶 ？ ? ? ? ? ? ? ? ? ?血),取約5X 106個細(xì)胞，1500rpm離心，棄上清，用400卩l(xiāng) 1 X Binding Buffer 重懸；2)? ? ? 分成 a、 b、 c、 d、 e 五管，每管約 1X106 個細(xì)胞a)? ? ? 陰性對照，不加任何試劑；b)? ? ?陽性對照

5、，加2%多聚甲醛固定 30分鐘，加AnnexinV 5卩1 ,室溫10mi n,用1 X Bin di ng Buffer 洗一次，棄上清再加190卩l(xiāng)緩沖液、10卩l(xiāng) PI 避光15分鐘？ ？C)? ? ?力廿10卩l(xiāng) PI，避光孵育 15分鐘；d)? ? ?力廿5卩l(xiāng) AnnexinV液，室溫避光孵育15min ；e)? ? ?力廿10卩l(xiāng) PI 和5卩l(xiāng) AnnexinV 液，室溫避光孵育 5min ；3)? ? ? 每管各加 400 卩 l 1 X Binding Buffer 。4)? ? ? 上機(jī)檢測。注意 a. 操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞；b. 操作時注意避光；C. 反應(yīng)

6、完畢后盡快檢測，最好在一小時內(nèi)檢測。3、用單克隆抗體檢測細(xì)胞凋亡1)? ? ?放置1X 106個細(xì)胞到試管中；2) ? ? ? 室溫離心 200g， 6min；3)? ? ? 棄上清，加入 100卩1冷的(4C)在 PBSF溶液中含100卩g/ml的digit onnin，輕輕地重懸細(xì)胞，在冰上孵育 20min ；4)? ? ? 加入 2ml 冷的(4C) PBSF液，室溫離心 200g，6min ；5)? ? ?棄上清，加入 20卩l(xiāng) PE標(biāo)記的單克隆抗體和80卩1 PBSF液，用vortex輕輕震蕩，室溫避光孵育 15 分鐘；6)? ? ? 加入 2ml PBSF 液，室溫離心 200g，

7、 6min；7)? ? ? 棄上清，加入 1ml PBSF液重懸細(xì)胞；8)? ? ? 避光保存，直到流式細(xì)胞儀檢測。? ? ?PBSF :含 % FCS(v/v )和 NaN3( w/v )的 PBS三、用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA周期分析? ?1、方法：同 DNA含量檢測? ?2 、注意：單細(xì)胞濃度應(yīng)約 106/ml，以免影響檢測的CV值和檢測結(jié)果；制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量 (如細(xì)胞是否聚集或過多碎片) ，以保證得到足夠的細(xì)胞含量；醛類固定會影響 PI 與核酸的結(jié)合。四、免疫熒光標(biāo)記法1 、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測法間接標(biāo)記法1)? ? ? 制備單細(xì)胞懸液；2)? ? ?細(xì)胞計數(shù)，取

8、岀1 X 106個細(xì)胞于試管中；3)? ? ?用臺盼藍(lán)染色計活細(xì)胞數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù) >9095%4) ? ? ?在試管中加入一抗，(劑量按照說明書的要求)，孵育3060分鐘；5)? ? ?PBS 洗滌12次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；6)? ? ? 加入二抗，孵育 20 30 分鐘；7)? ? ?PBS 洗一次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；8)? ? ?加300卩l(xiāng) PBS 上機(jī)檢測(若不能及時上機(jī)檢測，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)直接標(biāo)記法同間接標(biāo)記法在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻，孵育30分鐘；用PBS洗2次，1500rpm,離心3分鐘，棄上清；加3

9、00卩l(xiāng) PBS(PH=，上機(jī)檢測。2、細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法間接免疫熒光標(biāo)記法1)? ? ?取已制備好的單細(xì)胞懸液，用13%勺多聚甲醛固定 30分鐘(也可4C保存過夜)；2)? ? ?用PBS洗兩次，棄上清；3)? ? ?細(xì)胞膜打孔，加入 皂素200卩l(xiāng)，室溫10分鐘；4)? ? ? 用PBS洗滌兩次；5) ? ? ?加入第一抗體，室溫3060分鐘，或4C過夜，同時須設(shè)陰性對照或同型對照管；6)? ? ? 用PBS洗滌兩次；7)? ? ? 加入二抗(熒光標(biāo)記的抗體)室溫 20 分鐘，避光；8)? ? ?用PBS洗滌12次，棄上清；9)? ? ?重懸細(xì)胞于 500卩l(xiāng)PBS中，上機(jī)檢測。直接

10、熒光標(biāo)記法同間接熒光標(biāo)記法；加入熒光素標(biāo)記好的抗體，避光 30 分鐘(同時做同型對照管)；用PBS洗滌12次，棄上清；加300卩l(xiāng) PBS上機(jī)檢測。細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法(直標(biāo)法)1)? ? ?取岀已制備好的未固定的單細(xì)胞懸液1X 10 6個細(xì)胞于試管中；2)? ? ? 用PBS洗滌兩次；3)? ? ? 加入用熒光素標(biāo)記的抗體來標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原，同時加上陰性對照管，室溫孵育20 分鐘；4)? ? ?在試管中加入1%3%多聚甲醛1ml，固定30分鐘；5) ? ? ?PBS 洗滌兩次 1500rpm 3 分鐘，棄上清 ;6) ? ? ?打孔，加入皂素 200卩1室溫10分鐘；7)? ? ?用P

11、BS洗滌兩次，棄上清；8)? ? ? ? ?加入用熒光素標(biāo)記的抗體，標(biāo)記膜內(nèi)的抗原(標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標(biāo)記的 熒光素的顏色務(wù)必不相同)室溫 20分鐘孵育 ;9)? ? ?用PBS洗一遍棄上清；10)? ? 用300卩1PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測五、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點注意事項：1 、對照組的設(shè)置：? ? ? 在流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量都是相對值，不是絕對值。如需知道絕對值時必須設(shè)置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。( 1 )、陰性對照的設(shè)置2? ? ? 在實驗過程中，如做間接標(biāo)記法，可設(shè)置與一抗無關(guān)的實驗，即在實驗中不加一抗而只加上帶 有熒光標(biāo)記的第二抗體作為陰性對照管

12、，作為陰性對照。2? ? ? 在實驗過程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可設(shè)置理論上的陰性細(xì)胞作為陰性對照管，實驗過程及步驟與實驗組務(wù)必相同。(做間接標(biāo)記法時，同樣也可同時設(shè)置“陰性細(xì)胞”的陰性對照管作為陰性對照。2? ? ? 在實驗過程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可將實驗組細(xì)胞，取一管，加上與實驗抗體所標(biāo)記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。( 2)、陽性對照的設(shè)置：在實驗過程中如涉及到表達(dá)缺失或減少的實驗，應(yīng)設(shè)置陽性對照組，其設(shè)置方法與陰性對照設(shè)置相同。2、幾點建議：1)? ? ?在實驗過程中，在保證實驗的科學(xué)性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量減少實驗工序和過程。由于間接標(biāo)記法的工序多，實驗過程長，如再加之操作的不熟練，細(xì)胞更容易丟失和受損，而造成實驗結(jié)果的誤差。因此，在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量做直接