“護肝靈”預防酒精性肝損傷與營養(yǎng)素數(shù)量變化的關(guān)系

1、    “護肝靈”預防酒精性肝損傷與營養(yǎng)素數(shù)量變化的關(guān)系【關(guān)鍵詞】 護理；,酒精性肝損傷；,營養(yǎng)素；,大鼠摘要：目的觀察“護肝靈”對酒精性肝損傷的 影響 。 方法 給大鼠連續(xù)口服乙醇42 d，取其股動脈血離心后測肝功能，取肝臟勻漿的測考烏斯亮蘭蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶、維生素E。結(jié)果“護肝靈”低、中劑組均可提升考烏斯亮蘭蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶、維生素E的含量。結(jié)論 “護肝靈”緩解酒精性肝損傷過程中營養(yǎng)素的消耗。關(guān)鍵詞：護理； 酒精性肝損傷； 營養(yǎng)素； 大鼠乙醇只提供熱量，不提供營養(yǎng)素，因此長期大量飲酒可導致營養(yǎng)素缺乏，而營養(yǎng)養(yǎng)素缺乏又成為酒精性肝損傷的

2、致病因素。我們通過乙醇灌胃法復制酒精性肝損傷模型，來觀察“護肝靈”抗酒精性肝損傷與營養(yǎng)素數(shù)量變化之間的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下。 1 材料 1.1 動物 同批繁殖Wistar大鼠50只，全，體質(zhì)量180220 g, 四川大學華西動物中心提供，合格證書號：醫(yī)動字2401011號。1.2 95%乙醇（ethanol，EtOH）（ 分析 醇） 成都蜀都實業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，批號：200251。1.3 “護肝靈”膠囊 0.3 g/粒，相當于生藥2.14 g/粒，四川天然藥物 研究 所加工。1.4 多烯磷脂酰膽堿（Polyenephosphatidylcholie,APSULES、商品名：易善復） 生產(chǎn)廠：A.

3、Nattermann&Cie.Gmbh Koln，批號：H20020026。1.5 肝勻漿介質(zhì)pH 7.4，0.01 mol/L緩血酸氨（TrisHCl），0.0001 mol/L 乙二胺四乙酸鈉（EDTA2Na），0.01 mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉（NaCl）溶液,所用試劑在成都試劑廠購置。1.6 考馬斯亮蘭蛋白（CBBG250蛋白）試劑盒 南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20030916。1.7 谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)試劑盒 南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20030917 。1.8 維生素E（Vitamin E

4、 ,VE）試劑盒 南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號： 20030918。2 方法 2.1 動物分組造模及給藥 常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，稱量體質(zhì)量，按體質(zhì)量大小分4層后隨機分為正常對照組（簡稱正常組）、模型對照組（簡稱模型組）、“護肝靈”低劑量預防給藥組（簡稱低劑量組）、“護肝靈”高劑量預防給藥組（簡稱高劑量組）、易善復預防給藥對照組（簡稱對照組），每組10只；除正常組外，其余各組用50%乙醇按12 ml/Kg造模；低劑量組、高劑量組同時分別予“護肝靈”(0.15 gKg1d1)、(0.3 gKg1d1)劑量的稀釋液灌胃（予蒸餾水稀釋，依次相當于人每次用量的5倍、10倍，人每日用量的2.5倍、5倍）；

5、對照組予易善復（0.15 gKg1d1）稀釋液灌胃（予蒸餾水稀釋）；造模與給藥均連續(xù)42 d。2.2 觀察 造模及給藥期間，各組均普食普水飼養(yǎng)，連續(xù)觀察大鼠的活潑及自衛(wèi)、飲食飲水、體毛皮表、死亡及其它（大小便、分泌物）等情況，并記錄。2.3 標本采集和制作 造模及藥物干預結(jié)束后，禁食禁水12 h，稱量體質(zhì)量，取大鼠股動脈血2 ml，-196液氮保存攜帶，45溫箱孵育、3 000 r/min離心，取上清液檢測：甘油三酯（TG），白蛋白（ALB），球蛋白（GLOB），并 計算 A/G；剖開大鼠胸、腹腔，取肝、心、脾、肺、腎、睪丸等觀察色澤改變情況，并用 電子 天平稱量各臟器質(zhì)量，計算臟器系數(shù)；取大

6、鼠肝臟胸側(cè)葉下第二層的三葉中的右側(cè)葉肝臟作標本, -196液氮保存攜帶、-60保存,肝標本用0.86%冷生理鹽水洗滌，濾紙吸干水份，準確稱重，移取9倍肝重冷勻漿介質(zhì)的1/3到勻漿玻璃管中，剪碎，約12 000 r/min冰水中間隙勻漿4次，吸出到離心管，其余冷勻漿介質(zhì)2/3洗滌勻漿玻璃管，移到前述離心管，3 000 r/min離心15 min，取上清液，制成10%的肝勻漿儲備液，按試劑盒說明書檢查CBBG250蛋白、GSHPx、VE。 2.4 統(tǒng)計學方法使用PEMS3.1統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，所有計量資料用(±s)表示，組間比較用 t檢驗(方差齊時)或秩和檢驗(方差不齊時)。P0.05為

7、有統(tǒng)計學意義。3 結(jié)果3.1 活潑及自衛(wèi)、體毛光順、飲水飼食、死亡等情況 在整個實驗過程中，正常組大鼠活潑、自衛(wèi)意識強烈、體毛光順、飲水飼食正常、無死亡。其余各組大鼠活潑、自衛(wèi)意識均有降低，尤其以模型組為甚，交替出現(xiàn)煩躁、嗜睡、明顯疲軟狀態(tài)；體毛光順程度下降，表現(xiàn)為毛逆、成團、欠光澤；飲水飼食能力略有下降；在整個實驗過程中，高劑量第3只大鼠死亡、對照組第4只大鼠死亡，死亡原因為咬打，大體解剖無異常發(fā)現(xiàn)。3.2 大鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟質(zhì)量及臟器系數(shù)等情況 體質(zhì)量、內(nèi)臟質(zhì)量、睪丸質(zhì)量等結(jié)果見表1。各組間體質(zhì)量、心臟質(zhì)量、肺臟質(zhì)量、腎臟質(zhì)量、睪丸質(zhì)量等相互比較，差異均無顯著性（P0.05）；模型組大鼠肝臟

8、質(zhì)量、脾臟質(zhì)量均較正常組明顯升高（P0.05）；“護肝靈”高劑量和低劑量的大鼠肝臟質(zhì)量、脾臟質(zhì)量均低于模型組，差異有顯著性（P0.05）。3.3 大鼠血中TG，ALB，GLOB及A/G測定結(jié)果 見表3。各組間TG，ALB，GLOB及A/G相互比較，差異均無顯著性（P0.05）。3.4 大鼠肝組織勻漿檢測CBBG250蛋白，GSHPx，VE含量 結(jié)果見表4。模型組大鼠肝勻漿中CBBG250蛋白，GSHPx，VE的含量較正常組明顯降低，差異有顯著性（P0.05）；“護肝靈”高劑量組和低劑量組肝組織勻漿中CBBG250蛋白，GSHPx含量均較模型組明顯升高，差異有顯著性（P0.05）；“護肝靈”低劑

9、量組肝組織勻漿中V-E的含量較模型組明顯升高，差異有顯著性（P0.05），“護肝靈”高劑量組肝組織勻漿中V-E的含量較模型組有升高趨勢，差異無顯著性（P0.05）。表1 大鼠體質(zhì)量、內(nèi)臟質(zhì)量、睪丸質(zhì)量等結(jié)果（略）與正常組比較 *P0.05; 與模型組比較 #P0.05臟器系數(shù)（臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）結(jié)果見表2 。各組間心臟、肺臟、腎臟、睪丸等的臟器系數(shù)相互比較，差異均無顯著性（P0.05）；模型組大鼠肝臟、脾臟的臟器系數(shù)均較正常組明顯升高（P0.05）；“護肝靈”高劑量和低劑量的大鼠脾臟的臟器系數(shù)均低于模型組，差異有顯著性（P0.05）。表2 大鼠臟器系數(shù)結(jié)果（略）與正常組比較

10、 *P0.05；與模型組比較 # *P0.05；與低劑量比較 *P0.05肉眼可見正常組大鼠肝臟顏色鮮紅，被膜光滑，膽囊、胰臟、肺臟、心臟、脾臟、睪丸均正常，腹下脂肪較少。模型組大鼠肝臟顏色紫暗，質(zhì)稍軟，無光澤，有的與鄰近器官輕度粘連，肉眼可見肝臟出現(xiàn)腫大現(xiàn)象，肺臟出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，腹壁下脂肪層肥厚堆積。各給藥組大鼠肝臟顏色介于正常組與模型組之間呈暗紅色，內(nèi)臟大小適度，未觀察到異?，F(xiàn)象，肉眼可見給藥各組大鼠體內(nèi)腹壁下脂肪少于模型組大鼠。表3 大鼠 TP、ALB、GLOB及A/G結(jié)果（略）組間比較差異無顯著性 P0.05表4 大鼠肝組織勻漿中CBBG250蛋白、GSHPx、VE含量（略）與正常組比較

11、*P0.05；與模型組比較 #P0.05；與低劑量組比較 P0.054 討論對于酒毒，中醫(yī)認為“戒酒”是根本的 治療  方法 ，而不飲酒則是最佳預防措施，但正如靈樞師傳第二十九中說：“血食之君，驕恣從欲輕人，而無能禁之。禁之則逆其志，順之則加其病，便之奈何？治之何先？”執(zhí)行情況常不如人意。素問藏氣法時論篇第二十九認為：“肝苦急，急食甘以緩之，肝欲散，急食辛以散之，用辛散之、酸瀉之”。金元李杲脾胃論立“飲酒過傷”專篇，提出“只當發(fā)汗，汗出則愈矣，其次莫如利小便。二者乃上下分消其濕”1 。酒之為病屬濕熱為患，清熱祛濕為具體防治方法。清熱以性寒之品，祛濕用味苦之品可燥濕、芳香之品

12、可化濕、健脾之品可運濕。所以，“護肝靈”以“未病先防”為大法，取“以疏代堵”為小法：清熱、祛濕、運脾、發(fā)汗、利小便等為具體方法。在博士后導師張立實教授指導下，作為潘年松博士在博士后流動站期間的自由 研究 課題，共同精選枳、虎杖、砂仁、白茅根等中藥組方，其具體組方及工藝已由四川大學 科技 處申請專利保護，專利申請?zhí)枮?0041004864.2。4.1 CBBG250蛋白 蛋白質(zhì)分子具有NH3基團，當棕紅色的CBBG250顯色劑加入蛋白標準液或樣品中時，CBBG250染料上的陰離子與蛋白NH3結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{色，通過測吸光度可 計算 出蛋白含量。如此測得的是肝組織勻漿中的總蛋白。4.2 GSHP

13、x 是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。GSHPx的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSHPx的必須部分，每克分子酶含4 g原子硒。測定GSHPx的活力可以作為衡量機體硒水平的一項生化指標。4.3 VE VE在菲羅啉的存在下，可使三價鐵離子還原成二價鐵離子，后者在特定的環(huán)境下可與菲羅啉形成紅色復合物，通過比色，在標準曲線上可查出VE的含量，或者通過公式計算出V-E的含量。4.4 乙醇與營養(yǎng)素 乙醇只提供能量，不提供營養(yǎng)素。所以，長期飲酒會 影響 營養(yǎng)素的供給繼而引起營養(yǎng)素不良。營養(yǎng)素不良在酒精性肝病

14、（ALD） 的發(fā)生機制中的常見原因有：飲食脂肪的影響， 應(yīng)用 植物油與酒精同時投予的試驗表明, 高脂肪比低脂肪易于引起ALD而且程度較重；微量元素的影響，過多的鐵因可增強脂質(zhì)過氧化而為ALD之促進因子, 鋅則因有膜穩(wěn)定和抗氧化作用而可減輕ALD；其它如VE、谷胱甘肽（GSH） 等抗過氧化物質(zhì)之不足則為ALD之促進因素2。肝細胞合成白蛋白的能力強而迅速，正常人每天能合成10 g 左右的蛋白質(zhì),當肝功能嚴重受損時,血漿膠體滲透壓可因ALB的合成不足而降低，同時GLOB濃度反而增高，導致血漿A/ G 降低。肝功能受損時，會降低肝細胞制造ALB的能力,使血清中A/ G的比例降低3。同時，酒精引起肝細胞

15、受損時,乙醇代謝產(chǎn)生的乙醛影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運和分泌4。每日飲酒大于100 g且蛋白攝入少者易發(fā)生脂肪肝5。肝臟低溫保存再灌注過程中，肝細胞內(nèi)高糖原含量能顯著拮抗再灌注期間肝實質(zhì)細胞凋亡的發(fā)生；其可能與高糖原含量的肝實質(zhì)細胞內(nèi)三磷酸腺苷充裕，細胞膜上鈣離子三磷酸腺苷酶功能完善，細胞內(nèi)外鈣離子平衡相對穩(wěn)定有關(guān)6。肝臟缺血初期肝細胞內(nèi)的無氧糖酵解無疑是其賴以生存的能量來源,但隨著缺血時間的延續(xù),胞漿內(nèi)貯存的能量代謝底物不斷耗竭,細胞無氧糖酵解功能也逐漸減退,最終將導致細胞內(nèi)生物能量缺乏并引發(fā)一系列病理改變。因此,若能增加肝細胞能量代謝底物的負荷,則有望延長肝臟耐缺血時間,從而減輕肝臟缺血再灌注損傷程度7

16、。5 結(jié)論 本研究的結(jié)果顯示：各組間大鼠血中ALB、GLOB、A/G均無明顯改變（P0.05）。模型組大鼠肉眼觀察下肝臟顏色較正常組暗，肝臟質(zhì)量、脾臟質(zhì)量及肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)均較正常組明顯升高（P0.05），肝勻漿中CBBG250蛋白、GSHPx、VE的含量較正常組明顯降低（P0.05）?！白o肝靈”高劑量組和低劑量組均可改善肉眼觀察下肝臟顏色改變；均可明顯降低大鼠肝臟質(zhì)量、脾臟質(zhì)量和脾臟系數(shù)（P0.05）；均可明顯升高肝組織勻漿中CBBG250蛋白、GSHPx含量（p0.05），其中CBBG250蛋白含量均接近正常組（p0.05）；“護肝靈”低劑量組可明顯升高肝組織勻漿中V-E的含量（P0.0

17、5），“護肝靈”高劑量組有升高趨勢（P0.05）。另外，各組大鼠血中ALB、GLOB、A/G均無明顯改變（P0.05），而模型組大鼠肝組織勻漿中CBBG250蛋白卻較正常組明顯減少（P0.05），說明血中的ALB、GLOB、A/G在反映肝組織中蛋白質(zhì)含量方面，不如肝組織勻漿中CBBG250蛋白敏感。 參考  文獻 ：1 湖南省中藥研究所.脾胃論注釋M.北京：人民衛(wèi)生出版社,1976：402.2 森本道雄.酒精性肝損傷的最新研究進展J.日本醫(yī)學介紹,1997，18(10)：447.3 向 敏,王光蓮,丁龍其.復方玄駒膠囊對實驗性肝損傷小鼠的保護作用J. 中國  現(xiàn)代 醫(yī)學雜志,2002,12(24):60.4 Knittel T,Dinter C,Kobold D,Neubauer K,Mehde M,Eichhorst S,Ramadori G.Expression and regulation of cell adhesion molevules by hepatic atellate cells ( HSC) of rat liver : involvment of HSC in recruitment of onflammator