氨基酸的分離鑒定—紙層析法ppt課件

1、氨基酸的分別鑒定紙層析法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握氨基酸紙層析的方法和原理，學(xué)會(huì)分掌握氨基酸紙層析的方法和原理，學(xué)會(huì)分析待測(cè)樣品的氨基酸成分。析待測(cè)樣品的氨基酸成分。 二、實(shí)驗(yàn)原理 紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相流經(jīng)固定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分別。定相時(shí)，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分別。 溶質(zhì)在濾紙上的挪動(dòng)速度用溶質(zhì)在濾紙上的挪動(dòng)速度用RfRf值表示：值表示： Rf=Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心

2、的間隔原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的間隔/ /原點(diǎn)到溶劑前原點(diǎn)到溶劑前沿的間隔沿的間隔 在一定的條件下某種物質(zhì)的在一定的條件下某種物質(zhì)的RfRf值是常數(shù)。值是常數(shù)。RfRf值值的大小與物質(zhì)的構(gòu)造、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析的大小與物質(zhì)的構(gòu)造、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等要素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利濾紙的質(zhì)量和層析溫度等要素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分別氨基酸。用紙層析法分別氨基酸。 三、實(shí)驗(yàn)器材 1 1大燒杯大燒杯5000mL5000mL：1 1只只/ /組組 2 2培育皿：培育皿：1 1只只/ /組。組。 5 5層析濾紙長(zhǎng)層析濾紙長(zhǎng)20cm20cm、寬、寬12cm12cm的的 濾紙：濾紙：1 1張張/ /

3、組。組。 6 6直尺、鉛筆直尺、鉛筆 7 7電吹風(fēng)：電吹風(fēng)：1 1只只/ /組。組。 8 8托盤(pán)、雙面膠：托盤(pán)、雙面膠：1 1套套/ /組。組。 9 9手套：手套：1 1雙雙/ /組。組。 1010塑料薄膜：公用。塑料薄膜：公用。 1111量筒：量筒：50mL50mL，1 1只只/ /組。組。 四、實(shí)驗(yàn)試劑 1 1擴(kuò)展劑：擴(kuò)展劑： 將將4 4體積正丁醇和體積正丁醇和1 1體積冰醋酸放入分液漏斗中，體積冰醋酸放入分液漏斗中，與與3 3體積水混合，倒入分液漏斗充分振蕩，靜置體積水混合，倒入分液漏斗充分振蕩，靜置后分層，棄去下層水層。再按后分層，棄去下層水層。再按0.1%0.1%濃度的比例濃度的比例

4、參與質(zhì)量相當(dāng)?shù)能崛?。參與質(zhì)量相當(dāng)?shù)能崛?2 2氨基酸溶液：氨基酸溶液： 1 1、0.25%0.25%蛋氨酸規(guī)范溶液：準(zhǔn)確稱取蛋氨酸規(guī)范溶液：準(zhǔn)確稱取0.125g 0.125g 蛋蛋氨酸，氨酸， 溶于溶于50mL 50mL 蒸餾中，搖勻、充分溶解。蒸餾中，搖勻、充分溶解。 2 2、0.25%0.25%組氨酸規(guī)范溶液：準(zhǔn)確稱取組氨酸規(guī)范溶液：準(zhǔn)確稱取0.125g 0.125g 蛋蛋氨酸，溶于氨酸，溶于50mL50mL蒸餾水中，搖勻、充分溶解。蒸餾水中，搖勻、充分溶解。 3 3、 0.25%0.25%待測(cè)溶液：準(zhǔn)確稱取待測(cè)溶液：準(zhǔn)確稱取0.125g 0.125g 待測(cè)樣待測(cè)樣品，品， 溶于溶于

5、50mL 50mL 蒸餾中，搖勻、充分溶解。蒸餾中，搖勻、充分溶解。 實(shí)驗(yàn)試劑 五、實(shí)驗(yàn)操作 檢查培育皿能否枯燥、干凈；假設(shè)否，將其洗檢查培育皿能否枯燥、干凈；假設(shè)否，將其洗凈并置于枯燥箱內(nèi)凈并置于枯燥箱內(nèi)120120烘干。烘干。 1 1平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將平衡：剪一大塊塑料薄膜鋪在桌面上，將層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有層析缸或大燒杯到置于塑料薄膜上，再把盛有約約20mL20mL展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或展層溶液的小燒杯置于倒置的層析缸或大燒杯內(nèi)，用塑料薄膜密封起來(lái)，平衡大燒杯內(nèi)，用塑料薄膜密封起來(lái)，平衡20min20min。2規(guī)劃：帶上手套，取規(guī)劃：帶上手

6、套，取寬約寬約12cm、高約、高約20cm的層析濾紙一張。在紙的層析濾紙一張。在紙的下端距邊緣的下端距邊緣2cm處悄處悄然用鉛筆劃一條平行于然用鉛筆劃一條平行于底邊的直線底邊的直線A，在直線，在直線上做上做3個(gè)記號(hào)個(gè)記號(hào) ，記，記號(hào)之間間隔號(hào)之間間隔3cm，這就，這就是原點(diǎn)的位置。另在距是原點(diǎn)的位置。另在距左邊緣左邊緣1cm處畫(huà)一條平處畫(huà)一條平行于左邊緣的直線行于左邊緣的直線B，在在B線上以線上以A、B兩線的兩線的交點(diǎn)為原點(diǎn)標(biāo)明刻度交點(diǎn)為原點(diǎn)標(biāo)明刻度以厘米為單位，參以厘米為單位，參見(jiàn)左圖。見(jiàn)左圖。 3 3點(diǎn)樣：用毛細(xì)管將各氨基酸樣品分別點(diǎn)在點(diǎn)樣：用毛細(xì)管將各氨基酸樣品分別點(diǎn)在中間中間3 3個(gè)記

7、號(hào)個(gè)記號(hào)上，風(fēng)干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)上，風(fēng)干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)在紙上分散的直徑，最大不超越在紙上分散的直徑，最大不超越3 mm3 mm。每人須。每人須點(diǎn)點(diǎn)3 3個(gè)樣，其中個(gè)樣，其中2 2個(gè)是知樣，個(gè)是知樣，1 1個(gè)是待測(cè)樣品。個(gè)是待測(cè)樣品。 4 4層析：用雙面膠將濾紙粘成筒狀，點(diǎn)層析：用雙面膠將濾紙粘成筒狀，點(diǎn)樣面向外，紙的兩側(cè)邊緣不能接觸且要堅(jiān)樣面向外，紙的兩側(cè)邊緣不能接觸且要堅(jiān)持平行，參見(jiàn)圖持平行，參見(jiàn)圖3-33-3。向培育皿中參與擴(kuò)展。向培育皿中參與擴(kuò)展劑，使其液面高度到達(dá)劑，使其液面高度到達(dá)1cm1cm左右，將點(diǎn)好樣左右，將點(diǎn)好樣的濾紙筒直立于培育皿中點(diǎn)樣的一端在的濾紙筒直立于培育皿中點(diǎn)樣的

8、一端在下，擴(kuò)展劑的液面在下，擴(kuò)展劑的液面在A A線下約線下約1cm1cm，罩上，罩上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。當(dāng)展開(kāi)劑上大燒杯，仍用塑料薄膜密封。當(dāng)展開(kāi)劑上升到升到8 810cm10cm，取出濾紙，剪斷雙面膠連線，取出濾紙，剪斷雙面膠連線，立刻用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干。立刻用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干。 5 5顯色：用噴霧器顯色：用噴霧器在通風(fēng)廚中向?yàn)V紙上在通風(fēng)廚中向?yàn)V紙上均勻噴上均勻噴上0.1%0.1%茚三酮茚三酮正丁醇溶液，然后立正丁醇溶液，然后立刻用熱風(fēng)吹干，即可刻用熱風(fēng)吹干，即可顯出各層析斑點(diǎn)，參顯出各層析斑點(diǎn)，參見(jiàn)左圖。見(jiàn)左圖。 6 6計(jì)算各種氨基酸的計(jì)算各種氨基酸的RfRf值，并判別混合樣值，并判別混

9、合樣品中都有哪些氨基酸，各人將本人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果品中都有哪些氨基酸，各人將本人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，見(jiàn)表貼在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上，見(jiàn)表3-23-2。 7 7以層析時(shí)間為橫坐標(biāo)，擴(kuò)展劑上升高度以層析時(shí)間為橫坐標(biāo)，擴(kuò)展劑上升高度為縱坐標(biāo)畫(huà)圖，求出擴(kuò)展劑上升到為縱坐標(biāo)畫(huà)圖，求出擴(kuò)展劑上升到18cm18cm時(shí)所需時(shí)所需求的時(shí)間。求的時(shí)間。 8 8將微量注射器內(nèi)外用蒸餾水清洗干凈，將微量注射器內(nèi)外用蒸餾水清洗干凈，倒掉用過(guò)的展層液和平衡液，將培育皿洗凈，倒掉用過(guò)的展層液和平衡液，將培育皿洗凈，整理好桌面上的儀器和試劑，并留意清潔本人整理好桌面上的儀器和試劑，并留意清潔本人的操作臺(tái)，請(qǐng)教師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場(chǎng)交給教的操作臺(tái)，請(qǐng)教師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場(chǎng)交給教師。師。 計(jì)算：計(jì)算：Rf=Rf=