亞低溫對(duì)局灶腦缺血再灌注后腦血流、血腦屏障、神經(jīng)細(xì)胞損傷作用的研究

1、    亞低溫對(duì)局灶腦缺血再灌注后腦血流、血腦屏障、神經(jīng)細(xì)胞損傷作用的研究        【摘要】目的對(duì)比研究不同時(shí)期亞低溫( MHT 32±0.2)對(duì)局灶腦缺血再灌注損傷的作用。方法64只雄性SD鼠被隨機(jī)分成常溫(NT)、缺血期亞低溫(MHTi)、 再灌注期亞低溫(MHTr)、缺血期加再灌注期亞低溫(MHTi+r)四組，并用改良Koizumi's局灶 腦缺血模型，分別觀察了動(dòng)物缺血3小時(shí)再灌注3小時(shí)過(guò)程中，缺血周邊和核心區(qū)局部腦血流 (rCBF)改變，再灌

2、注3小時(shí)后血腦屏障(BBB)破壞及再灌注72小時(shí)后缺血梗塞灶體積。結(jié)果MHTi+r及MHTi均有改善缺血周邊區(qū)再灌注后急性高灌注和繼 發(fā)低灌流及核心區(qū)持續(xù)低灌流、減輕血腦屏障破壞、減少缺血梗塞灶體積的作用。該作用 尤以MHTi+r為明顯。MHTr作用有限。結(jié)論MHTi+r對(duì)皮層的保護(hù)作用較MHTi好。由此可推知，局灶腦缺 血再灌注損傷是個(gè)持續(xù)的過(guò)程，亞低溫治療不但要考慮開(kāi)始時(shí)間，其持續(xù)時(shí)間對(duì)療效具有同 樣重要價(jià)值?！娟P(guān)鍵詞】腦缺血再灌注損傷亞低溫 The effect of mild hypothermia on cerebral blood flow blood-brain ba rrier

3、 and infarct volume after focal cerebral ischemia and reperfusion in r atsHUANG Fengping, ZHOU Liangfu.Dept. of Neurosurgery of HuaShan H os pital, SMU, Shanghai 200040【Abstract】ObjectiveTo compare the effects of mild hypothermia(MHT 32±0.2) induced in different time courses of cere bra l ische

4、mia and reperfusion. Methods64 male SD r a ts were divided into three mild hypothermic groups, which including intra-ische mi a(MHTi), intra-reperfusion(MHTr), intra-ischemia/reperfusion(MHTi+r) group, an d one normothermic group(NT 37±0.2) as control. Reversible focal ischemia wa s carried out

5、 in rats with modified Koizumi's model. Cortical blood flow was meas ured during 3hr of ischemia following 3hr of reperfusion. The permeability of bl ood-brain barrier(BBB) was estimated after 3hr of ischemia and 3hr of reperfusi o n. The infarct volume was measured at 72hr after reprefusion. Re

6、s ults The acute postischemic hyperperfusion and delayed hypoperfusion in ischemic perifocal region and sustained hypoperfusion in ischemic core were inhi bit ed in both MHTi+r and MHTi groups. The disruption of BBB and the infarct volume in the basal ganglia and cortex regions were significantly le

7、ss in both MHTi+r a nd MHTi groups, especially in the MHTi+r group. The effect of MHTr on prolonged ischemia/reperfusion injury was limited. ConclusionThis study demonstrated that MHTi+r has more substantial protective effects on reduc ing ischemia/reperfusion injury than MHTi. These differences bet

8、ween MHTi and MH Ti+r suggest that ischemic and reperfusional injury is an ongoing process, and t he concept of MHT therapeutic window must include not only the time of initiating but also the duration of the intervention.【Key words】Focal cerebral ischemiaReperfusion injury Mild hypothermia腦缺血后再灌注的作

9、用已被廣泛研究。短期缺血后再灌注有減輕缺血損傷的 作用，長(zhǎng)時(shí)間的缺血后再灌注可導(dǎo)致急性高灌注和(或)繼發(fā)持續(xù)低灌流、加劇血腦屏障破壞 和腦水腫、加重腦缺血損傷1。近期研究表明，缺血期亞低溫有抑制缺血后過(guò)度 灌注、減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用2。但是，采取缺血期持續(xù)至再灌注期的亞低溫 對(duì)缺血再灌注后腦血流改變、血腦屏障破壞及神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究用SD鼠改良Koizumi's3局灶腦缺血模型，通過(guò)測(cè)量局部腦血流(CBF)、血 腦屏障(BBB)及梗塞灶體積，對(duì)比研究缺血期(MHTi), 再灌注期(MHTr) 及缺血期加再灌注期 (MHTir)亞低溫(mild hypothermia

10、 MHT32)對(duì)局灶腦缺血再灌注損傷的作用。材料和方法1.動(dòng)物準(zhǔn)備：雄性SD鼠，體重280310g。實(shí)驗(yàn)時(shí)動(dòng)物行氣管插管，呼吸機(jī)(rod ent ventilator model 683. Harvard USA)吸入0.5%1%異氟醚與70%N2O、30%O2的 混 合氣體維持麻醉。PE50管行右側(cè)股動(dòng)脈插管，以連續(xù)監(jiān)測(cè)血壓，并于缺血前5分鐘、缺血后9 0分鐘、再灌注后90分鐘抽血，做血?dú)?、血糖測(cè)定，以利調(diào)整呼吸機(jī)。測(cè)體溫探頭經(jīng)肛門(mén)插 入，并與自動(dòng)控溫儀相連(MTA-4702，Meditherm Gaymar Inc. USA)以控制體溫在32或37 。2.動(dòng)物模型：實(shí)驗(yàn)采用改良Koizum

11、i's大鼠大腦中動(dòng)脈(MCA)局灶缺血模型3。 缺血時(shí)間為3小時(shí)，再灌注時(shí)間為3小時(shí)或72小時(shí)。3.腦溫的測(cè)定和維持：腦溫用硬膜外溫(EDT)間接反映。切開(kāi)右側(cè)頭皮，于前囪右旁3mm前1 mm處鉆孔，于硬膜外內(nèi)扳下間隙插入26G測(cè)溫探頭(E-type Omega Engineering Inc. USA) 并與測(cè)溫儀(450 AET Omega)連接。EDT維持在37者為常溫組，32者為亞低溫組。腦溫的 升降及維持，采用60W白熾燈加熱、冰袋降溫、調(diào)節(jié)自動(dòng)控溫儀來(lái)完成。4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)分常溫組(NT)、缺血期亞低溫組(MHTi)、再灌注期亞低溫組(MHTr) 、缺血期持續(xù)至再灌注

12、期亞低溫組(MHTir)四組，每組動(dòng)物16只。其中8只大鼠缺血3小時(shí) 再灌注3小時(shí)后處死行BBB破壞體積測(cè)定，另8只缺血3小時(shí)再灌注3小時(shí)過(guò)程中行CBF測(cè)定，再 灌注72小時(shí)后動(dòng)物處死，行梗塞灶測(cè)定。5.梗塞灶測(cè)定：動(dòng)物麻醉斷頭取腦，冠狀切片層厚2mm，2%TTC磷酸緩沖液(pH7.4)37恒 溫染色30分鐘，4%Formalin緩沖液(DBpH7.4)固定30分鐘后拍照留用。梗塞灶體積計(jì)算用電 腦完成(Medical Image Processing System， FG-100 Series. Imaging Technoloyg Inc. USA)。6.局部腦血流量測(cè)定：用激光多普勒血流

13、測(cè)定儀(LDF：Multichannel Laser Doppler Syst em, Perimed Sweden)，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)側(cè)前囪后1mm，旁開(kāi)5mm和1mm兩點(diǎn)(該兩點(diǎn)分別代表本 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿毖畹暮诵膮^(qū)及周邊區(qū)4)腦皮層表面血流。以缺血前CBF為基值，缺 血期、再灌注期各點(diǎn)CBF值為基值的百分比。7.BBB測(cè)定：本實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3小時(shí)，經(jīng)靜脈注入3%Evan's藍(lán)Krebs平衡液0.5 ml，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，加深動(dòng)物麻醉，先用100ml肝素鹽水(肝素100mg/L)心內(nèi)灌注沖洗，再用4% 多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)灌注固定20分鐘，取腦冠狀切片，層厚2mm，拍照留

14、用。BBB破 壞程度以Even's藍(lán)滲漏出血管壁而著色的腦組織體積表示，具體計(jì)算方法同梗塞灶體積測(cè)定 。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：各組間CBF值比較，用配對(duì)資料t檢驗(yàn)；各組間BBB和值比較，用非配 對(duì)資料t檢驗(yàn)。各數(shù)值均用mean±SD表示，P0.05示差別顯著。結(jié)果1.亞低溫對(duì)生理指標(biāo)影響：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各生理指標(biāo)包括血壓、血?dú)?、?糖均控制在正常范圍內(nèi)。雖然各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物缺血開(kāi)始后平均動(dòng)脈壓均有不同程度下降，但下 降后的平均動(dòng)脈壓值仍維持在正常生理范圍內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組間，生理指標(biāo)統(tǒng)計(jì)無(wú)差異。2.亞低溫對(duì)腦血流的影響：缺血開(kāi)始后，各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CBF值均迅速下降，20分鐘后趨于穩(wěn)定 。其中缺

15、血周邊區(qū)平均下降至缺血前的12%30%，核心區(qū)降至8%15%，各實(shí)驗(yàn)組缺血周邊 和核心區(qū)CBF值無(wú)顯著差異。再灌流后，在缺血周邊區(qū)，MHTr和NT組可見(jiàn)明顯的急性高灌注 和繼發(fā)低灌流；MHTi+r組維持在87%103%之間；MHTi組再灌注早期CBF變化與MHTi+r組相似 ，再灌注2小時(shí)后CBF明顯下降，與MHTi+r組比P0.05。在缺血核心區(qū)，MHTr和NT組再 灌注后則表現(xiàn)為持續(xù)低灌流。尤其是NT組，再灌注后CBF值尚不到缺血前的30%；MHTi組再 灌注1小后CBF下降至61%±16%，與對(duì)照組相比P0.05，與MHTi+r組比無(wú)顯著差異。3.亞低溫對(duì)血腦屏障的影響：4個(gè)實(shí)

16、驗(yàn)組共8只假手術(shù)動(dòng)物中，除1只因鉆孔放置硬膜外測(cè)溫 探頭時(shí)，誤傷皮層造成該皮層區(qū)點(diǎn)狀Even's blue濃染外，余7只動(dòng)物腦組織均無(wú)染色，因此 ，亞低溫并不影響正常BBB的通透性。但各實(shí)驗(yàn)組間，BBB通透性差異明顯(1)。1各組動(dòng)物血腦屏障破壞及分布情況*P0.05 vs NT,P0.05 vs MHTra P0.05 vs MHTi4.亞低溫對(duì)缺血梗塞灶的影響：實(shí)驗(yàn)72小時(shí)內(nèi)，MHTi+r組和MHTi組無(wú)一例動(dòng)物死亡，MHTr 組死 亡1例，NT組死亡2例。尸體解剖示3例均死于腦腫脹。且MHTi+r和MHTi組梗塞灶體積明顯較N T和MHTr組小(2)。2各組動(dòng)物72小時(shí)后皮層，基

17、底節(jié)及總的缺血梗塞灶體積*P0.01 vs NT, P0.05 vs MHTr a P0.05 vs MHTi討論本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MHTi和MHTi+r有減輕局灶腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷、BBB破壞、C BF紊亂的作用，MHTi對(duì)局灶腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，在不同的缺血模型中均得到證 實(shí) 2，5。MHTi+r的作用卻未見(jiàn)報(bào)道。從臨床角度看，降溫麻醉(如腦、心臟等手 術(shù))經(jīng)常形成于手術(shù)開(kāi)始之前，并維持到手術(shù)結(jié)束，復(fù)溫是個(gè)緩慢、漸進(jìn)過(guò)程；顱腦外傷病 人亞低溫治療初步結(jié)果提示，持續(xù)24小時(shí)以上的亞低溫治療效果明顯，且不增加出凝血障礙 、腦內(nèi)出血、感染等并發(fā)癥6。因此，MHTi+r作用的研究，對(duì)臨床上

18、開(kāi)展亞低溫 治療具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)第一次對(duì)比研究MHTi和MHTi+r的作用，發(fā)現(xiàn)MHTi+r具有明顯地 減輕 腦缺血損傷作用，且其作用較MHTi更顯著，尤其是對(duì)皮層損傷的保護(hù)作用。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看 ，單純的MHTr對(duì)梗塞灶大小并無(wú)明顯的保護(hù)作用，這與Xue等5實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反 。結(jié)果不同原因，可能與梗塞灶計(jì)算時(shí)間不同有關(guān)。研究證明腦缺血再灌注損傷是慢性、進(jìn) 行性的，低溫可延緩腦梗塞發(fā)生，一般到實(shí)驗(yàn)后72小時(shí)，腦梗塞才定型7。Xue 等 在實(shí)驗(yàn)6小時(shí)后即計(jì)算梗塞灶體積，顯然較實(shí)際小，不能真實(shí)反映腦缺血再灌注損傷程度及 亞低溫的作用。局部腦血流的改變，是腦缺血和再灌注損傷的根本原因。局部腦組織血供的

19、下降，使該部分 腦組織能量代謝障礙，各種能量依賴(lài)型的離子通道功能 失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)多種神經(jīng)遞質(zhì)的大 量釋放、調(diào)節(jié)酶失衡、自由基生成、細(xì)胞膜破壞、蛋白質(zhì)合成障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的急 性或慢性死亡8。缺血后再灌注早期的急性高灌注，會(huì)加劇血腦屏障破壞和腦水 腫，是再灌注后繼發(fā)性腦損傷的重要因素4。再灌注后持續(xù)低灌流對(duì)腦缺血再灌 注損傷的直接作用目前尚不明確，但干擾藥物實(shí)驗(yàn)表明，抑制持續(xù)低灌流能明顯減小腦缺血 梗塞灶體積9。因此改善缺血腦組織血供，抑制再灌注后急性高灌注和持續(xù)低灌 流，是預(yù)防治療腦缺血再灌注損傷的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，MHTi和MHTi+r，尤其是后者， 明顯具有抑制再灌注后的急性高灌

20、注和繼發(fā)低灌流，改善持續(xù)低灌流的作用。血腦屏障破壞是血管內(nèi)血清蛋白，水分及各種有害物質(zhì)外滲，繼發(fā)血管性腦水腫和腦實(shí)質(zhì)損 傷的基礎(chǔ)10。Dietrich等11用全腦暫時(shí)性缺血模型證實(shí)，MHTi(3 033)能有效降低缺血再灌注后血腦屏障對(duì)辣根過(guò)氧化酶的通透性。本實(shí)驗(yàn)用局灶腦缺 血模型也得出了同樣結(jié)論。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，MHTi+r對(duì)血腦屏障，尤其是皮層血腦屏障的保護(hù)作 用較MHTi更明顯(1)。研究證實(shí)，血腦屏障通透性的增加與各種原因引起的缺血后高灌注 有關(guān)，阻止高灌注的發(fā)生，就能明顯抑制血腦屏障的破壞和血管源性腦水腫的發(fā)生，減輕繼 發(fā)性腦損傷。結(jié)合前面的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)結(jié)論也證實(shí)了這一點(diǎn)。但單用

21、這一機(jī)制很難 解釋本實(shí)驗(yàn)第二個(gè)結(jié)論即MHTi+r對(duì)血腦屏障保護(hù)作用較MHTi更強(qiáng)。從本實(shí)驗(yàn)看，MHTi+r組和 MHTi組動(dòng)物除缺血周邊區(qū)再灌注2小時(shí)后局部血流存在差異外，并無(wú)其它明顯差別。由此可 推知，血腦屏障破壞程度，與繼發(fā)低灌流也有密切聯(lián)系。作者單位：200040上海醫(yī)科大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)外科參考文獻(xiàn)1Memezawa H, Smith ML, Siesjo BK. Penumbral tissues salvaged b y reperfusion following middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1992, 23:5

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