柱前衍生反相高效液相色譜法測定毛脈酸模根中氨基酸的含量

1、柱前衍生反相高效液相色譜法測定毛脈酸模根中氨基酸的含量        【摘要】     目的采用柱前衍生法測定毛脈酸模根中氨基酸的含量。方法利用柱前衍生反相高效液相色譜（RPHPLC）法測定毛脈酸模根中16種氨基酸。采用DikmaC18色譜柱；流動(dòng)相：A為0.05 mol/L乙酸鈉溶液中含1%N,N二甲基甲酰胺，B為乙腈水（11），梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測波長360 nm；柱溫40。結(jié)果氨基酸的摩爾濃度與峰面積成良好的線性關(guān)系，r均在0.999以上；

2、 16種氨基酸的回收率為94.7%112.9%。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于毛脈酸模根中氨基酸的含量測定。     【關(guān)鍵詞】  毛脈酸模 氨基酸 高效液相色譜法    Abstract:ObjectiveTo determine the amino acids in root of Rumex gmelini with precolumn derivatization. MethodsSixteen kinds of amino acids were determined in root of Ru

3、mex gmelini by pre-column of RPHPLC. HPLC analysis was performed on Dikma C18 column with mixture of 0.05mol/L sodium acetate to contain 1% N,N-dimethylformamide (A) and acetonitrile-water (11) (B) as mobile phase in gradient mode. The flow rate was 1.0ml/min. The detection wavelength was 360nm and

4、the column temperature was 40. ResultsThe molar concentrations of amino acids and peak areas achieved a nice linear relationship (r was higher than 0.999). The recoveries of sixteen kinds of amino acids were 94.7%112.9%. ConclusionThe method is accurate and repeatable for the determination of amino

5、acids in Rumex gmelini.Key words:Rumex gmelini;  Amino acids;  HPLC    毛脈酸模Rumex gmelini Turcz.為蓼科（Polyonaceae）酸模屬多年生宿根草本植物，廣泛分布于黑龍江省大小興安嶺及張廣才嶺等地區(qū)，是黑龍江省、吉林長白山地區(qū)的重要藥用資源植物。以根入藥，味甘，性寒，有清熱解毒、涼血止血、通便利尿之功，民間以治療癬病或止血著稱1,2。 化學(xué)成分研究表明，毛脈酸模根中含有白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚及酸模素等多種化合物35，具有抗真菌

6、、抗腫瘤、鎮(zhèn)咳祛痰、平喘降壓、抗病毒和抗氧化等作用68。因此，毛脈酸模有重要的開發(fā)價(jià)值。    氨基酸是植物中的重要有效成分。研究表明，氨基酸有抗心血管、衍生物有抗腫瘤等作用9。近年來開始對人參、田七等植物藥中的氨基酸進(jìn)行了研究10，但對毛脈酸模中的氨基酸的分析還未見報(bào)道過。本實(shí)驗(yàn)以2年生和3年生毛脈酸模為研究對象，采用高效液相色譜法對毛脈酸模根中的氨基酸進(jìn)行測定，以期為毛脈酸模的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。1  儀器與材料    Agilent-1100高效液相色譜儀，色譜柱為Dikma C18（200 mm×4.6

7、mm，5 m），Mettler 電子天平AE 240（瑞士），DIKMA 微孔濾膜（0.45 m），ZK82B型真空干燥箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）。    門冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、胱氨酸（Cys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸 （Try）購于Agilent公司；甲醇、乙腈為美國Dikma公司產(chǎn)品，色譜純；水為自制重蒸水；其余均為分析純。樣品于20041001采

8、自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園（所有樣品均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定）。2  方法與結(jié)果2.1  色譜條件色譜柱為DikmaC18柱；流動(dòng)相：A：0.05 mol/L乙酸鈉溶液中含1%N,N二甲基甲酰胺，B：乙腈水（11），流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1；柱溫40；流速1.0 ml/min；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量：對照品溶液進(jìn)樣20 l；供試品溶液進(jìn)樣50 l。表1  流動(dòng)相梯度洗脫程序（略）2.2   供試品溶液的制備  將采集后的樣品置40干燥后，粉碎成粉末（過80目篩），精密稱取粉末0.2 g，置索

9、氏提取器中，以50%乙醇為溶劑回流4 h，提取液回收至干，殘?jiān)盟芙?，過濾，濾渣和濾器用水洗滌，將濾液和洗液合并，用水定容至10 ml，作為供試品溶液。2.3  供試品的衍生  取供試品1.0 ml，加入0.5 mol/L碳酸鈉緩沖液（以0.5 mol/L碳酸鈉調(diào)0.5 mol/L碳酸氫鈉置pH為9.0）1.0 ml和1%的2,4二硝基氟苯的乙腈溶液1.0 ml，搖勻，60水浴暗處放置60 min，取出冷卻后，加入磷酸鹽緩沖液（pH7.0）10 ml，搖勻，過0.45 m的濾膜。2.4  對照品溶液的制備  取Agilent公司提供的對照品溶液，分別制

10、備成濃度為25，100 ，250 ，500 ，1000 pmol/l的對照品溶液，按2.3項(xiàng)下衍生后進(jìn)樣20 l，以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)作曲線（見表2）。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。表2  16種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（略）圖1  毛脈酸模樣品（a）和氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（b）的HPLC圖（略）2.5  精密度實(shí)驗(yàn)  用氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液做6次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果16種氨基酸的RSD均小于5%。表明精密度良好。2.6  穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)  取毛脈酸模根的粉末0.2 g 1份。按2.2項(xiàng)，2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10

11、h進(jìn)樣，結(jié)果16種氨基酸的RSD均小于5%。表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.7   加樣回收率實(shí)驗(yàn)  采用單點(diǎn)和多點(diǎn)加入法將各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液定量加入樣品溶液中，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果各種氨基酸的回收率為94.7%112.9%。2.8   樣品測定  按2.2，2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣50 l。16種氨基酸含量測定結(jié)果見表3。從表中可知，16種氨基酸都存在于毛脈酸模的樣品中，精氨酸含量最高，而賴氨酸含量最低。其余的氨基酸的含量都在0.01%0.09%之間。在16種氨基酸中有7種是人體必需的氨基酸，其總量為0.254 2%，約占氨基酸

12、總量的30.41%。表3  16種氨基酸含量及總量的測定結(jié)果（略）*人體必需氨基酸； 氨基酸總量；*人體必需氨基酸總量3  討論    樣品衍生時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制衍生的時(shí)間，保證衍生時(shí)間的充足；pH值對衍生有重要的影響，衍生時(shí)也應(yīng)嚴(yán)格控制衍生的pH值；另外溫度不可過低，否則將造成衍生不完全。本法流動(dòng)相中含有鹽，應(yīng)控制柱溫（最好為40），柱溫不可過低，過低將易導(dǎo)致流動(dòng)相中出現(xiàn)結(jié)晶，堵塞色譜柱，產(chǎn)生柱壓過高等現(xiàn)象。    氨基酸是植物中重要的有效成分，其中谷氨酸可促進(jìn)人體內(nèi)消化液的分泌，具有預(yù)防貧血及解毒作用；精氨酸可控制體

13、內(nèi)細(xì)胞的退化；胱氨酸是毛發(fā)的成分，具有促進(jìn)毛發(fā)生長和防止皮膚老化作用，也可用于抗過敏、肝炎、白血球減少等癥；蘇氨酸在人體內(nèi)有轉(zhuǎn)變氨基酸達(dá)到平衡的作用。正確地利用這些氨基酸，是充分發(fā)揮毛脈酸模藥用價(jià)值的重要因素之一。    【參考文獻(xiàn)】  1 劉慎譚. 東北草本植物志, 第2卷M.北京：科學(xué)出版社，1959：24.2 吉林省中醫(yī)中藥研究所. 長白山植物藥志M.吉林：人民出版社, 1982：299.3 王振月, 李延冰, 匡海學(xué), 等. 毛脈酸模中大黃酚、大黃素的分離鑒定J.中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 1996 , 24(2)：54.4 王振月, 蔡學(xué)勤, 康毅

14、華, 等. 毛脈酸模中兩個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)研究J.中草藥, 1996, 27 (12)：714.5 閆 靜, 王振月, 劉丹寧, 等. 白藜蘆醇及其甙的生物活性研究進(jìn)展J.中醫(yī)藥學(xué)報(bào), 2000, 28 (2)：39.6 鄭水慶 , 陳萬生 , 曾 明 , 等. 酸模屬藥用植物的資源利用研究概況J.藥學(xué)實(shí)踐雜志 , 2000 , 18(5): 347.7 Schneider Y , Vincent F , et al. Anti-proliferative effect of resveratrol , a natural component of grapes and wine on human colonic cancer cel