脫氫酶活性檢測方法

1、活性污泥脫氫酶活性的測定一. 實驗?zāi)康牧私饣钚晕勰嗝摎涿富钚缘臏y定原理及方法二. 實驗原理活性污泥法對于有機物的降解，實質(zhì)上是微生物經(jīng)過一系列的酶的催化作用下的生物氧化還 原反應(yīng)。參加生物氧化的重要酶為氧化酶和脫氫酶二大類，其中脫氫酶類尤為重要。其中脫 氫酶能使氧化有機物的氫原子活化并傳遞給特定的受氫體實現(xiàn)石油烴的氧化和轉(zhuǎn)化。如果脫 氫酶活化的氫原子被人為受氫體接受，就可以通過直接測定人為受氫體濃度的變化間接測定 脫氫酶的活性，表征生物降解過程中微生物的活性。因此，脫氫酶的活性可以反應(yīng)處理體系 內(nèi)活性微生物量以及其對有機物的降解活性，以評價降解性能。脫氫酶活性測定方法有 MB.2H定性分析法和

2、TTC比色法，目前用得較多的為氯化三苯基四氮唑（ TTC ）比色法。利 用TTC作為人為受氫體，其還原反應(yīng)方程式如下：NN-CA +2eZ/N-N-CeHs.N=NC6H5科二 nC 具.:無色的TTC受氫后變成紅色的 TF（三苯基甲月替），根據(jù)紅色的深淺，測出相應(yīng)的光密度（0D 值），從而計算TF的生成量，求出脫氫酶的活性。三. 實驗設(shè)備及藥品1紫外-可見光分光光度計、分析天平、50mL棕色容量瓶、50mL三角瓶、比色皿2. 4mg/mL的TTC溶液：取400mg TTC （2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑，分析純）和 2g葡萄糖（O.1mol/L）分析純?nèi)苡谏倭空麴s水中，再稀釋到 100m

3、L的容量瓶中，貯存于棕色瓶中，一周更換一次。3. Tris-HCl緩沖液（pH=8.4）:稱取6.037g Tris（三羥甲基氨基甲烷, 分析純），再加入20ml 1mol/L 的鹽酸，再定容至 1L。4. 10%硫化鈉：稱取10gNa2S （分析純），定容到100mL的容量瓶中。5. 無氧水：0.36g亞硫酸鈉定容到100ml容量瓶中。四. 實驗步驟1 標準曲線的繪制 不同濃度的TTC系列溶液的配置：從 TTC溶液中移取1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7mL放入七個 50mL的容量瓶中，定容到 50mL。取7支試管，分別加入2mL Tris-HCl緩沖溶液、2mL無氧水、2mL不同濃度

4、的TTC溶液， 第八支為對照組。每支試管各加入1mL 10% Na2S溶液混合，搖勻，放置20min，使TTC全部還原成紅色的TF。各管加入5mL氯仿，振蕩搖勻以提取 TF，穩(wěn)定數(shù)分鐘。取下層的氯仿溶 液在分光光度計上，波長 485nm比色。并作出標準曲線。2. 土壤中微生物的脫氫酶活性測定取待測土樣2g于50mL三角瓶中，接種于20ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，放少許滅菌后的玻璃珠，放 入搖床震蕩2h。將土壤混合液全部轉(zhuǎn)入離心管離心，3000rpm, 15min，取出離心管，將上清液倒入50mL容量瓶中，再用純水離心洗滌三遍，上清液均倒入50mL容量瓶中，洗滌后沉淀用純水稀釋并轉(zhuǎn)移至另一 50mL容量瓶

5、中，分別定容從兩個容量瓶中各分取 5mL混合液，分別加入5mLTris-HCI緩沖溶液5mL蒸餾水及10mL TTC溶液；同時從每個容量瓶中分別吸取 5mL混合液，加入5mLTris-HCl緩沖溶液5mL蒸餾 水及10mL TTC溶液，再加入0.5mL甲醛固定以作樣品空白；將空白與待測樣品分別在37°C下振蕩培養(yǎng)30min，然后向管內(nèi)加入2mL硫酸終止酶反應(yīng)向樣品培養(yǎng)液及空白對照管內(nèi)各加入5mL氯仿萃取TF10min，3000r/min離心5min后取氯仿溶液，于波長485nm的進行比色，記錄吸光值，根據(jù)樣品顯色液與樣品空白的吸光值的差， 查標準曲線，進而得出脫氫酶的活性。對比以上清液和離心沉淀分別測得的吸光度值，確定土壤脫氫酶活性測定的取樣點。并確定以后的標準方法五. 實驗結(jié)果分析和思考題脫氫酶活性可按下式