《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》elisa

1、.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)（三）免疫標(biāo)記技術(shù)張蓓張蓓.檢測(cè)檢測(cè)Ag-Ab的體外實(shí)驗(yàn)的體外實(shí)驗(yàn)123凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標(biāo)免疫標(biāo)記技術(shù)記技術(shù).標(biāo)記免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記示蹤物標(biāo)記靈敏性靈敏性特異性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù).常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別 標(biāo)記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測(cè)定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測(cè)定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測(cè)定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin

2、免疫分析測(cè)定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測(cè)定 .分分 類類免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法雙抗體夾心法競(jìng) 爭(zhēng) 法雙抗原夾心法間 接 法雙位一點(diǎn)法.l主要試劑主要試劑: : 酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)記的抗體或抗原l酶標(biāo)物特點(diǎn)：酶標(biāo)物特點(diǎn)： 免疫學(xué)活性免疫學(xué)活性 酶對(duì)底物的催化活性酶對(duì)底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性酶高效催化反應(yīng)的專一性ELISA ELISA 原理及特點(diǎn)原理及特點(diǎn).特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好準(zhǔn)

3、確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒有操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒有污染。污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的衍生出適用范圍更廣的新方法新方法。原理：原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析定性或定量的測(cè)定分析 原理及特點(diǎn)原理及特點(diǎn).酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）雙抗體夾心法（雙位點(diǎn)一步雙抗體夾心法（雙位點(diǎn)一步法）測(cè)甲胎蛋白（法）測(cè)甲胎蛋白（AFP） .【臨床意義】si

4、gnificance in clinical practise1 1、原發(fā)性肝癌的大規(guī)模、原發(fā)性肝癌的大規(guī)模普查普查 2、可以用作檢測(cè)胎兒畸形和畸胎瘤.一、一、ELISA雙抗體夾心法測(cè)雙抗體夾心法測(cè)AFP原理原理l用抗用抗AFP抗體包被固相載體，加入待檢標(biāo)本，標(biāo)抗體包被固相載體，加入待檢標(biāo)本，標(biāo)本中的本中的AFP與固相載體上的抗體結(jié)合，再加入酶與固相載體上的抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的抗標(biāo)記的抗AFP抗體，形成抗體抗體，形成抗體-抗原抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加底物顯色，顏色的深淺與相應(yīng)合物，加底物顯色，顏色的深淺與相應(yīng)AFP的量的量呈正相關(guān)。呈正相關(guān)。l雙位點(diǎn)一步法：雙位點(diǎn)一步法：包被抗體

5、包被抗體和和酶標(biāo)抗體分別酶標(biāo)抗體分別是抗是抗AFP不同位點(diǎn)的不同位點(diǎn)的McAb.ELISA原原理理圖圖【實(shí)驗(yàn)原理】【實(shí)驗(yàn)原理】Experiments mechanism.principleEAFPAb包被固相載包被固相載體體+S顯色EE待測(cè)待測(cè)AFP抗抗AFP-E.抗抗AFPMcAb抗體抗體抗抗AFPMcAb抗體抗體AFP雙位點(diǎn)一步法：抗雙位點(diǎn)一步法：抗AFP不同位點(diǎn)的不同位點(diǎn)的McAb.二、試劑材料二、試劑材料1、AFP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)試劑盒2、AFP參考標(biāo)準(zhǔn)液（參考標(biāo)準(zhǔn)液（0、25、50、100、200、400ng/ml）。）。3、DW4、終止液（、終止液（2M H2SO4）。）。5、酶標(biāo)測(cè)

6、定儀、酶標(biāo)測(cè)定儀、37溫箱。溫箱。6、微量加樣器、滴管、吸水紙等。、微量加樣器、滴管、吸水紙等。.三、method（一）（一）quantity test1 1、add sampleadd sample 取包被好的酶標(biāo)孔取包被好的酶標(biāo)孔7 7孔，進(jìn)行標(biāo)記，第孔，進(jìn)行標(biāo)記，第1 16 6孔分別加入孔分別加入AFPAFP參考標(biāo)準(zhǔn)夜（參考標(biāo)準(zhǔn)夜（0 0、2525、5050、100100、200200、400ng/ml400ng/ml）各）各10100ul0ul。第。第7 7孔加入樣品孔加入樣品10100ul0ul。37372020分鐘分鐘2 2、washwash：在各孔中加入洗液在各孔中加入洗液2 2

7、滴滴, ,輕輕搖動(dòng)幾下輕輕搖動(dòng)幾下, ,棄之棄之, ,然后然后用蒸餾水或自來水加滿各孔用蒸餾水或自來水加滿各孔, ,甩掉甩掉, ,反復(fù)反復(fù)5 5次次, ,最后在吸水紙最后在吸水紙上拍干上拍干. .3 3、每孔加酶結(jié)合物、每孔加酶結(jié)合物2 2滴，滴，37153715分鐘。分鐘。4 4、washwash5 5、顯色、顯色每孔加底物和顯色液各每孔加底物和顯色液各1 1滴，輕輕振搖，室溫避光反應(yīng)滴，輕輕振搖，室溫避光反應(yīng)5 5分鐘，分鐘，加入加入2 2滴終止液滴終止液終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。5 5、酶標(biāo)儀、酶標(biāo)儀450nm450nm比色，計(jì)算結(jié)果。比色，計(jì)算結(jié)果。.（二）（二） quality test1

8、Add samplel取包被好的酶標(biāo)板取包被好的酶標(biāo)板3 3各孔，分別加入陰性對(duì)照（各孔，分別加入陰性對(duì)照（25 25 ng/mlng/ml）、陽性對(duì)照（）、陽性對(duì)照（400 ng/ml400 ng/ml）和待檢標(biāo)本各）和待檢標(biāo)本各10100ul 370ul 372020分鐘。分鐘。2 2、washwash：在各孔中加入洗液在各孔中加入洗液2 2滴滴, ,輕輕搖動(dòng)幾下輕輕搖動(dòng)幾下, ,棄棄之之, ,然后用蒸餾水或自來水加滿各孔然后用蒸餾水或自來水加滿各孔, ,甩掉甩掉, ,反復(fù)反復(fù)5 5次次, ,最后在吸水紙上拍干最后在吸水紙上拍干. .3 3、每孔加酶結(jié)合物、每孔加酶結(jié)合物2 2滴，滴，37

9、153715分鐘。分鐘。4 4、washwash5 5、顯色、顯色每孔加底物和顯色液各每孔加底物和顯色液各1 1滴，輕輕振搖，室溫避光反滴，輕輕振搖，室溫避光反應(yīng)應(yīng)5 5分鐘，加入分鐘，加入2 2滴終止液滴終止液終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。.四、result 1Quantity testQuantity testl用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，以用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，以0 ng/ml0 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)孔為空白孔，在波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)孔為空白孔，在波長(zhǎng)450nm450nm處分別讀取各標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔處分別讀取各標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔ODOD值，以值，以O(shè)DOD值為橫坐標(biāo)，值為橫坐標(biāo)，AFPAFP含量為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，

10、以測(cè)含量為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以測(cè)定孔的定孔的ODOD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)標(biāo)本的值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)標(biāo)本的AFPAFP含量。含量。 2 2Quality testQuality testl在白色背景上直接肉眼觀察結(jié)果。陰性對(duì)照孔應(yīng)基本無色，在白色背景上直接肉眼觀察結(jié)果。陰性對(duì)照孔應(yīng)基本無色，陽性對(duì)照孔呈深藍(lán)色。若待檢樣品孔色澤深于陽性對(duì)照孔陽性對(duì)照孔呈深藍(lán)色。若待檢樣品孔色澤深于陽性對(duì)照孔則則AFP400ng/mlAFP400ng/ml，陽性；若待檢樣品孔色澤深于陰性對(duì)照，陽性；若待檢樣品孔色澤深于陰性對(duì)照孔而淺于陽性對(duì)照孔則孔而淺于陽性對(duì)照孔則20ng/ml20ng/mlAFPAFP400ng/ml400ng/ml，弱陽性；，弱陽性；待檢樣品孔色澤淺于陰性對(duì)照孔則待檢樣品孔色澤淺于陰性對(duì)照孔則AFP AFP 20ng/ml20ng/ml，陰性。，陰性。l 參考范圍：正常成人參考范圍：正常成人AFPAFP含量含量20ng/ml20ng/ml。.【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】Experiments resultsl若待檢孔顯色淺于或等于陰性對(duì)照判定為若待檢孔顯色淺于或等于陰性對(duì)照判定為l若待檢孔顯色深于或等于陽性對(duì)照孔則判定若待