第4章PCR技術(shù)的應(yīng)用

1、pcr技術(shù)的應(yīng)用分子克隆操作的一般步驟：（1）獲得目的基因；（2）與克隆載體連接，形成新的重組dna分子；（3）用重組dna分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；（4）對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定；（5）對獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。一、概述一、概述 pcr：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用：使用一對寡核苷酸引物，以目的序列為模板，利用dna合成合成 酶和四種脫氧核糖酶和四種脫氧核糖核酸進(jìn)行核酸進(jìn)行dna的體外合成反應(yīng)。的體外合成反應(yīng)。 pcr技術(shù)具有靈敏度高，特異性高、操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)，能夠在幾個小時內(nèi)獲技術(shù)具有靈敏度高，特異

2、性高、操作方便和重復(fù)性好等特點(diǎn)，能夠在幾個小時內(nèi)獲得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。得多達(dá)幾百萬拷貝的目的基因。 該技術(shù)在上個世紀(jì)該技術(shù)在上個世紀(jì)80年代中期由美國年代中期由美國k.mullis發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多發(fā)明建立，經(jīng)過近二十年已發(fā)展成包括多種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，種衍生技術(shù)，在很多領(lǐng)域中廣泛使用，k.mullis也因此獲得也因此獲得1993年度的諾貝爾化學(xué)獎。年度的諾貝爾化學(xué)獎。二、二、pcr基本原理基本原理 dna在細(xì)胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是在細(xì)胞中的復(fù)制是一個復(fù)雜的酶促脫氧核糖核酸聚合過程，是 dna聚合酶、聚合酶、dna連接酶、引發(fā)

3、酶、連接酶、引發(fā)酶、rna引物、四種脫氧核糖核酸、引物、四種脫氧核糖核酸、dna超螺旋酶、離子環(huán)境等超螺旋酶、離子環(huán)境等多成份參與的過程。多成份參與的過程。 pcr是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的是在試管內(nèi)使用最基本的成份模擬了細(xì)胞內(nèi)的dna復(fù)制，所以在一個復(fù)制，所以在一個pcr中中必需成分是必需成分是 1. 模板模板dna 2. dna聚合酶聚合酶 3. 四種脫氧核糖核酸四種脫氧核糖核酸 4. 正向和反向兩條引物正向和反向兩條引物 5. 適當(dāng)?shù)木彌_體系。適當(dāng)?shù)木彌_體系。模板序列：待擴(kuò)增的模板序列：待擴(kuò)增的dna序列，一般為雙鏈的序列，一般為雙鏈的dna可包括線形雙螺旋可包括線形雙螺旋

4、dna，如基，如基因組因組dna，及閉環(huán)雙鏈，及閉環(huán)雙鏈dna，如質(zhì)粒；，如質(zhì)粒；模板的來源很廣，如從細(xì)胞模板的來源很廣，如從細(xì)胞/細(xì)菌中提取基因組細(xì)菌中提取基因組dna、提取、提取mrna經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cdna、質(zhì)粒、病毒等；、質(zhì)粒、病毒等；每個反應(yīng)中模板的量為每個反應(yīng)中模板的量為1 ng1 g。質(zhì)粒。質(zhì)粒dna和純化的和純化的dna的量可少一些，而基的量可少一些，而基因組因組dna的量應(yīng)多一些。的量應(yīng)多一些。pcr靈敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否則會導(dǎo)致靈敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否則會導(dǎo)致pcr的非特異性擴(kuò)增。的非特異性擴(kuò)增。1

5、、模板、模板dna引物（引物（primer）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的）也稱為寡核苷酸引物，常規(guī)的pcr反應(yīng)需要兩種引物，分別成為反應(yīng)需要兩種引物，分別成為5端引端引物和物和3端引物，或稱為正向引物和反向引物。端引物，或稱為正向引物和反向引物。通常通常dna及及mrna序列的寫法為序列的寫法為53，所以，所以5端引物與目的序列的端引物與目的序列的5末端序列相同，而末端序列相同，而3端引物與目的序列的端引物與目的序列的3末端序列反向互補(bǔ)。末端序列反向互補(bǔ)。2、引物、引物它們作為它們作為dna擴(kuò)增的起始部分，能限定待擴(kuò)增擴(kuò)增的起始部分，能限定待擴(kuò)增dna序列的長度。序列的長度。為了保證擴(kuò)增的特異性

6、和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有為了保證擴(kuò)增的特異性和有效性，引物與模板相匹配部分應(yīng)至少有1518 bp。55335533上游引物上游引物下游引物下游引物dna聚合酶：以聚合酶：以dna為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的為模板，以脫氧核糖核酸為底物催化合成新的dna的一種酶。的一種酶。早期的早期的pcr反應(yīng)使用的反應(yīng)使用的dna聚合酶為大腸桿菌聚合酶為大腸桿菌dna聚合酶聚合酶i的的klenow片段。但該酶在高溫片段。但該酶在高溫下容易失活，需要在每次合成反應(yīng)進(jìn)行時候再加入一份酶。下容易失活，需要在每次合成反應(yīng)進(jìn)行時候再加入一份酶。隨著新的耐熱隨著新的耐熱dna聚合酶的發(fā)現(xiàn)及在聚合

7、酶的發(fā)現(xiàn)及在pcr反應(yīng)中的應(yīng)用，使反應(yīng)中的應(yīng)用，使pcr操作更方便，產(chǎn)量更穩(wěn)定。操作更方便，產(chǎn)量更穩(wěn)定。目前商品化的目前商品化的dna聚合酶有聚合酶有taq dna聚合酶和聚合酶和pfu dna聚合酶。聚合酶。taq dna聚合酶最適工作溫度為聚合酶最適工作溫度為75-80。該酶具有。該酶具有53聚合酶活性，在鎂離子存在情況聚合酶活性，在鎂離子存在情況下可催化核苷酸沿下可催化核苷酸沿53方向發(fā)生聚合反應(yīng)。方向發(fā)生聚合反應(yīng)。3、dna聚合酶聚合酶4、脫氧核糖核酸、脫氧核糖核酸四種脫氧核苷三磷酸即四種脫氧核苷三磷酸即datp、dttp、dctp和和dgtp，為，為pcr反應(yīng)中反應(yīng)中dna合成原料。

8、合成原料。在新的一個反應(yīng)體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等，如果其中一種在新的一個反應(yīng)體系中，這四種脫氧核糖核酸的起始濃度應(yīng)該都相等，如果其中一種的濃度明顯不同于其他的就會誘發(fā)錯配，并降低新鏈合成速度。的濃度明顯不同于其他的就會誘發(fā)錯配，并降低新鏈合成速度。緩沖液提供緩沖液提供pcr反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有反應(yīng)所必需的合適酸堿度與離子環(huán)境。主要成分有kcl、tris-cl和和mgcl2。其中其中mg2的濃度最重要，它能影響的濃度最重要，它能影響dna聚合酶的活性，以及模板與聚合酶的活性，以及模板與pcr產(chǎn)物產(chǎn)物的解鏈溫度。的解鏈溫度。5、緩沖液、緩沖液1.變性：

9、是指模板的熱變性，雙螺旋模版變性：是指模板的熱變性，雙螺旋模版dna成為單鏈的成為單鏈的dna分子；在應(yīng)用分子；在應(yīng)用taq dna聚聚合酶進(jìn)行合酶進(jìn)行pcr反應(yīng)時，變性往往在反應(yīng)時，變性往往在9495條件下進(jìn)行。這也是條件下進(jìn)行。這也是taq dna聚合酶進(jìn)聚合酶進(jìn)行行30個左右的個左右的pcr循環(huán)而活力不致受到過多損失時所能耐受的最適溫度。循環(huán)而活力不致受到過多損失時所能耐受的最適溫度。2.退火：是指引物和模板在局部形成互補(bǔ)的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物退火：是指引物和模板在局部形成互補(bǔ)的雜交鏈的過程。退火溫度比兩條寡核苷酸引物的熔解溫度低的熔解溫度低510，pcr實(shí)驗(yàn)要對退火

10、溫度進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)要對退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。三、三、pcr基本步驟基本步驟3.延伸：在鎂離子存在條件下，延伸：在鎂離子存在條件下，dna聚合酶按堿基互補(bǔ)原則，催化四種脫氧核糖核酸加聚合酶按堿基互補(bǔ)原則，催化四種脫氧核糖核酸加在引物的在引物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成與模版方向生成與模版dna互補(bǔ)的新互補(bǔ)的新dna鏈。鏈。雙鏈模版雙鏈模版dna變性變性退火退火5353553355335533上游引物上游引物下游引物下游引物延伸延伸35533553多次循環(huán)多次循環(huán)（2n 拷貝）拷貝）下面為一個典型的下面為一個典型的pcr循環(huán)參數(shù)設(shè)置：循環(huán)參數(shù)設(shè)置：備注：備注：* 比兩條引物的比兩條引物的t

11、m值低值低510。94 5 min 94 30 s x * 30 s 72 1 kb/min 72 5 min25-35個循環(huán)個循環(huán)四、影響四、影響pcr因素因素 雖然雖然pcr操作很方便，但影響因素也很多，從而影響操作很方便，但影響因素也很多，從而影響pcr的特異性和高效性。的特異性和高效性。1.引物引物2.變性溫度和時間變性溫度和時間3.退火溫度和時間退火溫度和時間4.延伸溫度和時間延伸溫度和時間5.循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)引物決定了引物決定了pcr產(chǎn)物的長度和特異性。產(chǎn)物的長度和特異性。引物的設(shè)計(jì)要求請看本實(shí)驗(yàn)講義引物的設(shè)計(jì)要求請看本實(shí)驗(yàn)講義“引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)”部分。部分。1、引物、引物在在pc

12、r反應(yīng)剛開始時，為保證作為模板的雙鏈反應(yīng)剛開始時，為保證作為模板的雙鏈dna完全變性成單鏈完全變性成單鏈dna，一般設(shè)為，一般設(shè)為95、5 min；在隨后的循環(huán)中，可設(shè)為；在隨后的循環(huán)中，可設(shè)為95、30s。有些模板有些模板dna的的g+c含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間含量較高，變性溫度就越高。太高的變性溫度和太長的變性時間會影響會影響dna聚合酶的活性。聚合酶的活性。 2、變性溫度和時間、變性溫度和時間退火溫度與引物的退火溫度與引物的tm值相關(guān)，一般比值相關(guān)，一般比tm值低值低510。退火溫度設(shè)置過低，會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合退火溫度

13、設(shè)置過低，會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增；退火溫度過高，則影響引物與模板的結(jié)合而降低而降低pcr效率。效率。在退火時間里，引物與模板相結(jié)合，時間太短會使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法在退火時間里，引物與模板相結(jié)合，時間太短會使引物與模板未完全結(jié)合而導(dǎo)致無法延伸；時間過長容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時間延伸；時間過長容易產(chǎn)生引物在模板上的非特異性結(jié)合或形成引物二聚體。退火時間設(shè)置為設(shè)置為30s基本上就足夠了?；旧暇妥銐蛄恕?、退火溫度和時間、退火溫度和時間tm值的計(jì)算值的計(jì)算一般的公式：一般的公式：tm = 4 (g+c) + 2(a+t) 所用所用dna聚合酶的最佳活性溫度決

14、定了延伸溫度，如聚合酶的最佳活性溫度決定了延伸溫度，如taq聚合酶的最佳溫度為聚合酶的最佳溫度為7080度，所以延伸溫度設(shè)為度，所以延伸溫度設(shè)為72即可。即可。在實(shí)踐中在實(shí)踐中taq dna聚合酶的延伸效率約為聚合酶的延伸效率約為500 bp/30 s，若待擴(kuò)增的片段較長，可，若待擴(kuò)增的片段較長，可適當(dāng)延長時間，但時間過長又會致非特異性擴(kuò)增。適當(dāng)延長時間，但時間過長又會致非特異性擴(kuò)增。4、延伸溫度和時間、延伸溫度和時間在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，在經(jīng)過一定的循環(huán)次數(shù)后，隨著聚合酶活性的降低，引物濃度降低等因素，pcr產(chǎn)產(chǎn)物不再呈指數(shù)增加，此時稱為平臺效應(yīng)。

15、物不再呈指數(shù)增加，此時稱為平臺效應(yīng)。循環(huán)次數(shù)設(shè)為循環(huán)次數(shù)設(shè)為2530次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。過多的循環(huán)次數(shù)會次，即可滿足一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。過多的循環(huán)次數(shù)會導(dǎo)致堿基錯配增加和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。導(dǎo)致堿基錯配增加和非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。5、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù)五、五、pcr引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)是引物設(shè)計(jì)是pcr 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不合適的pcr 引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等?，F(xiàn)現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶

16、很弱，等等?，F(xiàn)在在pcr 引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁，得到設(shè)引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)的原則v引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)v引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)v引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)dna dna 聚合反應(yīng)聚合反應(yīng)( (即錯配即錯配) ) v如引物長度（如引物長度（prim

17、er length），產(chǎn)物長度（），產(chǎn)物長度（product length），序列），序列tm 值值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability, 用用g 值反映值反映)，形，形成引物二聚體成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值，在）的能值，在錯配位點(diǎn)（錯配位點(diǎn)（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的gc 含量（含量（composition），），等等。必要

18、時還需對引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。等等。必要時還需對引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。具體因素具體因素一般原則一般原則v引物的長度一般為引物的長度一般為15-30 bp，常用的是，常用的是18-24 bp，但不應(yīng)大于，但不應(yīng)大于38。v引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的。是必要的。v例如：一個長度為例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(diǎn)個潛在的退火位點(diǎn)(3 x 109/412=200 )。而一個長度為。而一個長度為20

19、bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個。個。v較長的引物（較長的引物（28-35bp)v一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn) 2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物易導(dǎo)致錯配。引物3端出現(xiàn)端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如個以上的連續(xù)堿基，如ggg 或或ccc，也會使錯誤引，也會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加。發(fā)機(jī)率增加。 3，引物，引物3端的末位堿基對端的

20、末位堿基對taq 酶的酶的dna 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為錯配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為a 的錯配效率明顯高于其他的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基端使用堿基a。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致pcr 反應(yīng)失敗。反應(yīng)失敗。5端序列對端序列對pcr 影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。 4. 引物序列的引物序列的gc 含量一般為含量一般為40-60

21、%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的的gc含量不能相差太大。含量不能相差太大。 不同的算法推薦不同的算法推薦45-55%或或50-60% 5. g 值是指值是指dna 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端端g 值較低（絕對值不超過值較低（絕對值不超過9），而），而5端和中間端和中間g 值相對較高值相對較高的引物。引物的的引物。引物的3端的端的g 值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)dna 聚合

22、聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合） 6. 對引物的修飾一般是在對引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入pcr 產(chǎn)物產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。的載體的相應(yīng)序列而確定。 7. 引物二級結(jié)構(gòu)對引物二級結(jié)構(gòu)對pcr反應(yīng)的影響。反應(yīng)的影響。 盡可能少的引物二聚體。盡可能少的引物二聚體。 常用的引物設(shè)計(jì)軟件常用的引物設(shè)計(jì)軟件voligo 6 （引物評價(jià)）（引物評價(jià)）*vprimer premier （自動搜索）（自動搜索）*vvector nti suitvdnasisvomigavdnastarvprimer3 （

23、在線服務(wù)）（在線服務(wù)）*primer premier 5.0 的使用技巧簡介的使用技巧簡介主要功能主要功能:1、即引物設(shè)計(jì)、即引物設(shè)計(jì)2、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析3、dna 基元基元(motif)查找查找4、同源性分析、同源性分析primer premier 5.0使用介紹使用介紹(1)preimer premier 啟動界面啟動界面load sequence基本信息基本信息sequence nameoriginal sequenceuse these two button to translate the dna seq to a protein seq or a prot

24、ein seq to a dan seq 8種密碼子偏好種密碼子偏好choose a function 引物設(shè)計(jì)界面引物設(shè)計(jì)界面first you can design the primer manuallysense strand or anti-sense stranduseful information of the primer引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型引物類型搜索模式搜索模式5引物位置范圍引物位置范圍3引物位置范圍引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度引物長度搜索結(jié)果搜索結(jié)果28對引物對引物引物分值引物分值100分為滿分分為滿分每對引物的信息每對引物的信息雙擊選中

25、一對引物雙擊選中一對引物引物信息引物信息回到主窗口回到主窗口引物及產(chǎn)物信息引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)是否出現(xiàn)hairpin,dimer,false priming and cross dimer一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有but 引物編輯引物編輯edit primer hereanalysis the edit resultaccept the edit result return to the main windowoligo 6.44 使用說明使用說明主要功能：專門的引物

26、設(shè)計(jì)軟件主要功能：專門的引物設(shè)計(jì)軟件oligo 6.44 啟動界面啟動界面open sequence file3個彈出窗口個彈出窗口g internal stabilityfrq為鄰近為鄰近6至至7 個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。用用oligo 設(shè)計(jì)引物時的設(shè)計(jì)引物時的3個標(biāo)準(zhǔn)個標(biāo)準(zhǔn)vtm 值曲線以選取值曲線以選取5到到3的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。vfrq 曲線宜選用曲線宜選用3端端frq 值相對較低的片段。值相

27、對較低的片段。vg 值在值在5端和中間值比較高，而在端和中間值比較高，而在3端相對低端相對低選中引物選中引物上游引物上游引物下游引物下游引物只是示意圖只是示意圖引物分析引物分析v首先檢查引物二聚體尤其是首先檢查引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性；端二聚體形成的可能性；v第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好；）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好；v第三項(xiàng)檢查為第三項(xiàng)檢查為gc 含量，以含量，以45-55為宜；為宜；v第四項(xiàng)第四項(xiàng)false priming 檢查。檢查。引物分析引物分析key information of pri

28、merhairpindimer and cross dimergc%total pcr informationfinal pcr informationsearch for primer using oligo 6.44search primeronline primer3 service v/ 凝膠準(zhǔn)備凝膠準(zhǔn)備 稱稱1g瓊脂糖置三角瓶中，加瓊脂糖置三角瓶中，加100ml 1tae； 微波爐加熱大約微波爐加熱大約2分鐘，熔化瓊脂糖；分鐘，熔化瓊脂糖； 熔化的瓊脂糖自然冷卻到熔化的瓊脂糖自然冷卻到6070時，加入時，加入eb 5l，并輕輕混勻。，并輕輕

29、混勻。 膠床準(zhǔn)備膠床準(zhǔn)備 將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有將梳子垂直插入到膠床的小凹槽內(nèi)，梳齒底端和床面有1mm的間隙；的間隙； 將膠床放在調(diào)整好的水平臺上；將膠床放在調(diào)整好的水平臺上； 鋪膠：將冷卻致鋪膠：將冷卻致60的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約的凝膠倒入準(zhǔn)備好的膠床內(nèi)，凝膠厚度約5 mm；室溫下靜置室溫下靜置30分鐘左右，凝膠固化。將帶凝膠分鐘左右，凝膠固化。將帶凝膠 的膠床置于電泳槽中，并使樣品的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于電場負(fù)極；孔位于電場負(fù)極；六、六、pcr產(chǎn)物電泳鑒定產(chǎn)物電泳鑒定向電泳槽中加入向電泳槽中加入1tae電泳緩沖液，越過凝膠表面即可；電泳緩沖

30、液，越過凝膠表面即可；輕輕拔出固定在凝膠中的梳子；輕輕拔出固定在凝膠中的梳子； 樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積樣品準(zhǔn)備：向核酸樣品中加入約為樣品體積1/6的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻的上樣緩沖液，用加樣器輕輕混勻上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為上樣：用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為10l蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳；蓋上電泳槽，接通電源，開始電泳；電泳條件：電壓電泳條件：電壓80v；時間；時間2025分鐘；分鐘；電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠；電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠；電泳結(jié)果分析：電泳結(jié)果分析： 紫外檢測儀直接觀察電泳條帶紫

31、外檢測儀直接觀察電泳條帶 攝影記錄攝影記錄 瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期結(jié)果：500 bp560 bppcr產(chǎn)物的直接測序：從瓊脂糖凝膠中回收產(chǎn)物的直接測序：從瓊脂糖凝膠中回收pcr產(chǎn)物后測序。產(chǎn)物后測序。 pcr產(chǎn)物連接到載體后測序：從瓊脂糖凝膠中回收產(chǎn)物連接到載體后測序：從瓊脂糖凝膠中回收pcr產(chǎn)物，利用連接酶將產(chǎn)物，利用連接酶將pcr產(chǎn)物連接到載體如產(chǎn)物連接到載體如pgem-t后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒后測序。后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒后測序。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 3130 基因分析儀基因分析儀 24 小時無人監(jiān)控操作小時無人監(jiān)控操作 儀器設(shè)置更方便更簡單儀

32、器設(shè)置更方便更簡單 新型自動灌膠系統(tǒng)進(jìn)行灌膠新型自動灌膠系統(tǒng)進(jìn)行灌膠 檢測池加熱器改進(jìn)了溫度控制檢測池加熱器改進(jìn)了溫度控制 通過通過 96 孔和孔和 384 孔板自動進(jìn)樣孔板自動進(jìn)樣 多色熒光檢測多色熒光檢測 七、七、pcr產(chǎn)物測序鑒定產(chǎn)物測序鑒定觀看測序結(jié)果的軟件觀看測序結(jié)果的軟件chromas軟件運(yùn)行界面軟件運(yùn)行界面打開一個測序結(jié)打開一個測序結(jié)果果峰型排列良好，無高大雜峰，說明測序結(jié)果可靠峰型排列良好，無高大雜峰，說明測序結(jié)果可靠將測序結(jié)果輸出為文本文件將測序結(jié)果輸出為文本文件雖然現(xiàn)在的雖然現(xiàn)在的pcr技術(shù)使技術(shù)使pcr擴(kuò)增有很高的真實(shí)性，即擴(kuò)增有很高的真實(shí)性，即pcr產(chǎn)物與模板產(chǎn)物與模板

33、dna的一致性的一致性很高，但由于很高，但由于pcr擴(kuò)增畢竟是在試管內(nèi)進(jìn)行的擴(kuò)增畢竟是在試管內(nèi)進(jìn)行的dna復(fù)制，沒有類似細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，沒有類似細(xì)胞內(nèi)dna錯配錯配修復(fù)機(jī)制，所以，在修復(fù)機(jī)制，所以，在pcr產(chǎn)物擴(kuò)增以后，仍要分析其與模板產(chǎn)物擴(kuò)增以后，仍要分析其與模板dna的是否完全一致。的是否完全一致。最好的方法是將最好的方法是將pcr產(chǎn)物測序，將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫作序列比對分析。產(chǎn)物測序，將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫作序列比對分析。八、目的基因序列變異分析八、目的基因序列變異分析/ 核酸序列比對核酸序列比對http:/blast.ncbi.nlm.nih.

34、gov/blast.cgi blast分析界面分析界面輸入測序結(jié)果輸入測序結(jié)果結(jié)果界面之一結(jié)果界面之一結(jié)果界面之二結(jié)果界面之二九、九、pcr污染的產(chǎn)生及防治污染的產(chǎn)生及防治pcr污染的監(jiān)測污染的監(jiān)測 vpcr強(qiáng)大擴(kuò)增能力強(qiáng)大擴(kuò)增能力+檢測的敏感性檢測的敏感性v經(jīng)經(jīng)30個周期后，特定個周期后，特定dna片段的數(shù)量在理論上可增加片段的數(shù)量在理論上可增加109倍倍v極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對定量造成很大的問題極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性，尤其對定量造成很大的問題 ntc (no template control): 必須必須設(shè)置一個不含模板設(shè)置一個不含模板dna但含有但含有pcr系統(tǒng)中所有其他

35、成分的對照反應(yīng)，這一對系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應(yīng)，這一對照管須在準(zhǔn)備好所有其他照管須在準(zhǔn)備好所有其他pcr以后才進(jìn)行吸加。以后才進(jìn)行吸加。 常見的常見的pcr contamination v常規(guī)常規(guī)pcrv熒光定量熒光定量pcrntc432176598ntc引起引起pcr污染的原因污染的原因模板間交叉污染模板間交叉污染v容器被污染容器被污染v模板放置時模板放置時, 由于密封不嚴(yán)溢于容器外由于密封不嚴(yán)溢于容器外v容器外粘有模板而造成相互間交叉污染容器外粘有模板而造成相互間交叉污染v模板吸取過程中模板吸取過程中, 因氣溶膠（因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器污染，從而導(dǎo)致）或其他原因

36、引起移液器污染，從而導(dǎo)致交叉污染交叉污染引起引起pcr污染的原因污染的原因pcr試劑污染試劑污染vpcr 試劑配制過程中試劑配制過程中, 移液器、容器、水等原因造成試劑被移液器、容器、水等原因造成試劑被pcr 核酸模板污染。核酸模板污染。引起引起pcr污染的原因污染的原因pcr產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染-最主要最常見最主要最常見vpcr 產(chǎn)物拷貝量大，極微量的產(chǎn)物拷貝量大，極微量的pcr產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染, 就可形成假陽性。就可形成假陽性。v移液器吸取移液器吸取pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，同一支移液器去準(zhǔn)備產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，同一支移液器去準(zhǔn)備pcr mixvpcr產(chǎn)物的氣溶膠污染：產(chǎn)物的氣溶膠污染： 一個氣溶

37、膠顆?？赡芎瑤兹f個拷貝一個氣溶膠顆?？赡芎瑤兹f個拷貝氣溶膠（氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質(zhì)）：懸浮于氣體介質(zhì)中粒徑一般為中粒徑一般為 0.001m1000m的固體、的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系。液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系?？諝馀c液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠, 在在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管, 開蓋時、開蓋時、吸樣時及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶吸樣時及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠膠引起引起pcr污染的原因污染的原因?qū)嶒?yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染v克隆質(zhì)粒濃度高克隆質(zhì)粒濃度高, 另外在純化過程中需

38、用較多的用具及試劑另外在純化過程中需用較多的用具及試劑, 其污染可能性也很大其污染可能性也很大防止防止pcr污染污染首要原則首要原則v永遠(yuǎn)要設(shè)置永遠(yuǎn)要設(shè)置ntc對照對照 如果不能在污染出現(xiàn)的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果：一大段時間的數(shù)據(jù)不可信如果不能在污染出現(xiàn)的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果：一大段時間的數(shù)據(jù)不可信v準(zhǔn)備準(zhǔn)備pcr的移液器要專用的移液器要專用 千萬不能千萬不能用吸取用吸取pcr產(chǎn)物產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備克隆質(zhì)粒的移液器去準(zhǔn)備pcr 體系體系防止防止pcr污染污染空間：空間： 合理分隔實(shí)驗(yàn)區(qū)域合理分隔實(shí)驗(yàn)區(qū)域:將樣品的處理、配制將樣品的處理、配制pcr反應(yīng)液、反應(yīng)液、pc

39、r循環(huán)擴(kuò)增及循環(huán)擴(kuò)增及pcr產(chǎn)物的鑒定產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)進(jìn)行，特別注意樣本處理及等步驟分區(qū)進(jìn)行，特別注意樣本處理及pcr產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。 理想狀態(tài)：理想狀態(tài)： 各個區(qū)域?qū)嶒?yàn)用品及移液器專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將該區(qū)域用紫外線消毒，破壞殘留的各個區(qū)域?qū)嶒?yàn)用品及移液器專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將該區(qū)域用紫外線消毒，破壞殘留的dna或或rna。防止防止pcr污染污染操作操作v一旦進(jìn)入吸加一旦進(jìn)入吸加pcr試劑的專用場所并開始工作，就應(yīng)戴上一副新手套，并應(yīng)勤于更換。試劑的專用場所并開始工作，就應(yīng)戴上一副新手套，并應(yīng)勤于更換。v準(zhǔn)備專供自己使用的準(zhǔn)備專供自己使用的pcr試劑，

40、分裝為小份。不要與樣品存放在一起。試劑，分裝為小份。不要與樣品存放在一起。v選擇質(zhì)量好的選擇質(zhì)量好的eppendorf管管-密封性好且開管不需要太大力氣。密封性好且開管不需要太大力氣。v打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。體濺出。v實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時清理臺面。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時清理臺面。防止防止pcr污染污染移液器操作移液器操作由于操作時不慎將模板吸入槍內(nèi)或粘上槍由于操作時不慎將模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣時要十頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣時要十分小心

41、。分小心。1）準(zhǔn)備）準(zhǔn)備pcr的移液器專用的移液器專用2）吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，）吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。染或產(chǎn)生氣溶膠污染。3）最好在加完所有其他反應(yīng)成分后才吸）最好在加完所有其他反應(yīng)成分后才吸加模板。加模板。4）推薦在準(zhǔn)備）推薦在準(zhǔn)備pcr過程中使用濾芯槍頭過程中使用濾芯槍頭出現(xiàn)污染后解決辦法出現(xiàn)污染后解決辦法v更換試劑更換試劑 更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用更換新的試劑和水，用確保無污染的移液器分裝備用v清潔所有可能的污染源：實(shí)驗(yàn)臺面、小離心機(jī)、冰箱門把手等等清潔

42、所有可能的污染源：實(shí)驗(yàn)臺面、小離心機(jī)、冰箱門把手等等 1）實(shí)驗(yàn)臺面、超凈工作臺用現(xiàn)配的）實(shí)驗(yàn)臺面、超凈工作臺用現(xiàn)配的3%雙氧水或雙氧水或10%次氯酸鈉溶液擦拭清潔。次氯酸鈉溶液擦拭清潔。 2）或者用）或者用10%漂白粉溶液擦拭漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過紫外光照射，照射距離應(yīng)不超過90 cm，照射時間最好過夜。，照射時間最好過夜。v實(shí)驗(yàn)過程中更加小心，采用前面提到的各種防止污染的辦法實(shí)驗(yàn)過程中更加小心，采用前面提到的各種防止污染的辦法十、十、colony pcrcloningvcloning is the way in which we can take a single molecule, and make lots of bacterial cells that contain an identical molecule.vthese cells are clones, hence the namevthis used to be the only way to amplify dna. it is still by far the most accurate.imperfect sciencevmost of the plasmid / insert combi