激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用

1、 激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用李楠王黎明楊軍關(guān)鍵詞激光; 顯微鏡; 原理和作用中國圖書資料分類法分類號R 318. 51激光共聚焦顯微鏡是80年代發(fā)展起來的一項劃時代意義的高科技新產(chǎn)品, 它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置, 利用計算機進行圖象處理, 使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針, 從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖象, 在亞細胞水平上觀察諸如Ca 2+、pH 值, , 成為形態(tài)學, , , 學, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美國M eridian 公司的產(chǎn)品:A cas 系列U lti m a 型和掃描速度最快的In sigh t 型兩臺激光共聚焦儀。儀器自199

2、5年5月份到貨安裝以來, 已為我院7個科室的10個課題所應(yīng)用, 目前主要開展的研究內(nèi)容有:(1 細胞內(nèi)游離鈣的實時監(jiān)測; (2 細胞通訊的研究; (3 細胞形態(tài)學的研究。1基本原理和功能1. 1基本原理傳統(tǒng)的光學顯微鏡使用的是場光源, 標本上每一點的圖象都會受到鄰近點的衍射光或散射光的干擾; 激光共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點光源對標本內(nèi)焦平面上的每一點掃描, 標本上的被照射點, 在探測針孔處成像, 由探測針孔后的光電倍增管(PM T 或冷電耦器件(cCCD 逐點或逐線接收, 迅速在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖象。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛作者單位解放軍總醫(yī)院實驗儀器中心

3、, 北京100853的, 焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔, 焦平面以外的點不會在探測針孔處成像, 這樣得到的共聚焦圖象是標本的光學橫斷面, 克服了普通顯微鏡圖象模糊的缺點。在顯微鏡的載物臺上加一個微量步進馬達, 可使載物臺上下步進移動, 最小步進距離為的0. 1m , 能清楚地顯示, 實現(xiàn)了的目的, 這就是21. . CT ”功能通過狹縫掃描技術(shù)將我們對細胞的研究由多層迭加影像推進到真正的平面影像水平, 使圖像更加清晰, 從而為分子細胞生物學的深入研究拓寬了視野。1. 2. 2三維成像與細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖像相結(jié)合的功能激光共聚焦顯微成像儀可以將斷層圖像與三維重建圖像有機的結(jié)合起來, 不但

4、能揭示細胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和提供細胞的長、寬、厚、斷層面積、細胞體積等參數(shù), 而且可以給人以三維立體的概念。例如:可以使細胞旋轉(zhuǎn)起來從而能隨意觀察細胞各個側(cè)面的表面結(jié)構(gòu)。1. 2. 3將形態(tài)學、生理學與分子細胞生物學的研究相互結(jié)合利用激光共聚集顯微成像儀不但可以觀察細胞形態(tài)的動態(tài)變化, 而且用適當?shù)臒晒馓结樋梢杂^察細胞內(nèi)部的生物化學變化。如細胞內(nèi)游離Ca 2+、pH 值及其它細胞內(nèi)離子的實時測定。熒光原位雜交的雜交點觀測和定量分析。1. 3激光共聚焦顯微成像儀的細胞生物學功能1. 3. 1粘附細胞分選技術(shù)U lti m a 型激光共聚焦顯微成像儀是目前世界上唯一能對粘附細胞進行分選的儀器, 而這種不

5、改變細胞周圍培養(yǎng)環(huán)境, 細胞鋪展程度和生長狀態(tài)的分選方式232軍醫(yī)進修學院學報1996Sep t ; 17(3 是至關(guān)重要的。1. 3. 2細胞激光顯微外科及光陷井技術(shù)該儀器可將激光當作一把“光刀子”使用, 完成諸如細胞膜瞬間穿孔, 染色體切割, 神經(jīng)元突起切除等一系列細胞外科手術(shù), 也可以作光陷井操作。1. 3. 3熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)該技術(shù)用來測定活細胞的動力學系數(shù)。通過對活細胞的動力學系數(shù)的測定, 可對細胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)、大分子組裝和徑跨膜大分子遷移率等領(lǐng)域進一步研究。1. 3. 4光活化技術(shù)該技術(shù)通過籠鎖與解籠鎖測定, 可以人為控制多種生物活性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時

6、間和空間。1. 3. 5析, 重要的意義1. 3. 6胞間通訊的研究通過測量細胞縫隙連接的分子轉(zhuǎn)移, 研究相鄰細胞間的通訊。此項研究用于監(jiān)測環(huán)境毒素和藥物在細胞增殖和分化中所起的作用, 腫瘤啟動子和生長因子對縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的作用, 以及細胞內(nèi)Ca2+, pH 和CAM P 對縫隙連接作用的影響。2應(yīng)用2. 1細胞內(nèi)游離鈣測定細胞內(nèi)鈣作為第二信使, 對細胞生長分化起著重要作用, 而目前用于監(jiān)測細胞內(nèi)游離鈣的方法少之又少, 激光共聚焦儀的誕生為人們提供了一有效工具。目前已應(yīng)用的課題有:臨檢科“不同刺激物對血小板胞內(nèi)鈣的應(yīng)用”、內(nèi)分泌科“免疫球蛋白對甲狀腺細胞內(nèi)鈣的作用”、眼科“糖性白內(nèi)障晶

7、體上皮細胞內(nèi)鈣的變化”。其技術(shù)難點及處理方法如下。2. 1. 1細胞的獲取細胞內(nèi)游離鈣的測定需要活的生長旺盛的細胞。其來源可從細胞株培養(yǎng)獲得, 也可由動物活體直接取得。培養(yǎng)優(yōu)良的細胞, 是一件非常辛苦又花費精力的工作, 但它可以確保每次都有足夠多的細胞供實驗使用; 從動物的活體上直接取細胞, 需要實驗人員高超的手術(shù)技巧, 能準確地摘取標本, 并且盡量避免細胞的丟失和死亡。2. 1. 2細胞的染色根據(jù)各種細胞的特性和活性, 確保每次染色成功, 是技術(shù)性很強的實驗技術(shù), 需要一段摸索的時間。首先確定加多大濃度的鈣敏熒光染料FLUO 23 AM , 在CO 2培養(yǎng)箱中孵育多長時間, 是否需要加去污劑

8、F 2127助溶? 這些在幾次試驗以后才能夠確定。2. 1. 3藥物對細胞內(nèi)游離鈣的影響實驗設(shè), 滲透壓是否合適, 是否會引起細胞內(nèi)鈣的變化。藥物對細胞內(nèi)游離鈣的作用是瞬間上升下降, 還是鈣的振動。要對出現(xiàn)的實驗現(xiàn)象作出解釋。2. 1. 4細胞的粘附如果培養(yǎng)的是粘附細胞, 那么它們會較為牢固地粘附在培養(yǎng)皿上或載玻片上, 可是懸浮的細胞如血小板, 紅細胞很難貼壁。為了解決這個問題必須對載玻片進行處理。處理主要方法為使用多聚賴氨酸, 蛋清, 聚乙烯醇等作粘貼劑。實驗者必須根據(jù)細胞特性來選取不同的處理方法。2. 2細胞通訊近年來細胞通訊是分子細胞生物學的研究熱門。但是對于細胞縫隙間細胞通訊的研究,

9、由于缺少檢測手段, 一直阻礙人們?nèi)ド钊胩剿?。自激光共聚焦顯微鏡誕生以來, 尤其是M eridian 公司的A cas 系列的推出, 為研究細胞通訊提供了新的手段。目前已完成的課科題有:“腎小球成纖維細胞胞間通訊影響的研究”。實驗方法為:首先觀察原細胞的通訊情況, 測定其恢復(fù)速率, 然后在不同藥物作用下, 監(jiān)測其通訊情況, 對恢復(fù)速率做統(tǒng)計學處理, 推斷藥物對細胞通訊的作用。其技術(shù)難點及處理方法為:332軍醫(yī)進修學院學報1996Sep t ; 17(3 2. 2. 1確定原細胞通訊情況并非所有的細胞都有這種縫隙連接的通訊, 例如:淋巴細胞,部分癌細胞就沒有這種通訊, 因此, 必須預(yù)先對原細胞作用

10、出判斷。2. 2. 2細胞通訊測定結(jié)果的統(tǒng)計學處理由于細胞處于不同的生長期, 即使同一細胞系, 其恢復(fù)速率也不完全一致。這就必須取得盡可能多的標本數(shù)據(jù)來進行統(tǒng)計。2. 2. 3觀察細胞的選擇在一個視野里有若干個細胞。作為數(shù)據(jù)采集對象必須選擇3組細胞為觀察目標:(1 對照組:選孤立的單個細胞12個, 由于此類細胞與其它細胞不相連接,因而就不會有細胞通訊的機能, 適合用作對照;(2 觀察組:選相互緊密相連的細胞56個, 這種細胞間存在通訊, 可作為測試對象; (3 正組:, 光去淬滅, 光照射下, , 為消除。2. 3細胞形態(tài)學研究細胞形態(tài)測量是激光共聚焦顯微鏡最廣泛的用途之一, 這些測試的技術(shù)難

11、點在于如何選擇熒光探針標記, 如何獲取樣品, 樣品的處理方法及染色方法。如:“腎小管上皮細胞對成纖維細胞表達的粘附因子的影響”。3工作設(shè)想總結(jié)Confocal 在我院的應(yīng)用情況, 考慮今后我們的工作重點主要有3個方面。3. 1積極與臨床各科研配合, 做好技術(shù)保障工作。3. 2加強儀器功能的開發(fā)和方法學的研究。UL T I M A 型是功能很強大, 技術(shù)很復(fù)雜的科研儀器, 目前我們只開發(fā)出很小一部分功能, 今后將在這方面組織人力物力進行研究和探索。例如, 在細胞形態(tài)學方面的研究和分子細胞生物。3. 是精密, 。目前工作難(包括細胞培養(yǎng), 染色等 達不到儀器所要求的技術(shù)水平。激光共聚焦顯微鏡作為我

12、院投資最大的科研儀器之一, 為我院科研水平的提高, 提供了嶄新的, 強有力的技術(shù)手段。我們將和各科同志共同努力, 使其在“九五”期間發(fā)揮更大的作用。(1996-01-30收稿, 1996-02-13修回(上接226頁 服20余劑, 諸癥漸消。不意月經(jīng)來潮, 量中色黯, 夾有黑色血塊, 歷時4d 而凈, 乳脹、小腹墜脹也隨之消失。停用降壓藥, 血壓亦能穩(wěn)定在正常范圍。陰火既降, 遂改予益腎健脾, 調(diào)暢氣血治療。隨訪3月, 月事如常。2討論夫陰陽之機, 清者屬陽, 濁者屬陰。清陽貴升, 濁陰宜降。清陽不升則濁陰不降, 中氣下陷則陰火上乘, 即所謂“陰火乘其土位”。清濁相干, 則諸癥叢生而變化萬端。眾所周知, 補中益氣湯乃東垣所創(chuàng)之名方, 具補中益氣, 升陽舉陷, 升清降濁之功效, 用之臨床奧妙無窮。對該患者應(yīng)用此方乃病情所需, 月事久閉而不治自通實屬意外。然仔細斟酌, 亦自有其內(nèi)在之理。經(jīng)曰“沖為血海, 任主胞胎”, 又云“任脈通, 太沖脈盛, 月事以時下”。正常的月事和胎孕有賴于沖、任二脈的充盛與暢通。如任脈不通, 太沖脈衰, 則月事為之變, 經(jīng)閉而無子。該患者年屆六七有余, 太沖漸衰; 中氣下陷, 清陽不升, 陷于胞宮; 心情不舒, 氣血不暢, 氣滯血瘀, 阻于胞宮;